Determinación de

Enterobacteriaceae sin resucitación -

Técnica NMP y
técnica de recuento en placa
NCh2676.Of2002

Pesar 25 gramos de muestra en Bolsa y ambiente estéril

↓

Añadir 225 ml en bolsa para Stomacher (1:9).

Homogeneización
10- 1

Homogenizar por 1 min. Constituye la dilución 10-1.

↓
Agregar 1 ml del homogenizado a 9 ml del diluyente

Dilución de la muestra
Constituye la dilución 10- 2; 10-3;10-4

NMP Controles de productividad Técnica de recuento en placa Control

Tomar tres tubos de caldo EE doble-concentración. Transferir a cada uno de A partir de la dilución inicial, Esterilidad(0)
estos tubos, 10 ml de la suspensión inicial (10-1). transferir a placas Petri, 1 ml en duplicado.
Tomar tres tubos de caldo EE simple-concentración. Transferir a cada uno de Repetir el procedimiento descrito con las
estos tubos 1 ml de la suspensión inicial (10-1). Tomar tres diluciones adicionales, usando una pipeta
tubos de caldo EE simple-concentración. Transferir a cada uno de estos estéril
tubos 1 ml de la primera dilución decimal de la suspensión inicial (10-2). para cada dilución decimal.

1 ml 10-1
Inoculación e incubación

Inoculación e incubación

Verter 15 ml de agar VRBG a 46ºC ± 1ºC

EE-D 10 ml (10-1) EE-S 1 ml (10-1) EE-S 1 ml (10-2) e.coli(+) E.aerog(-) Est (0) en el baño termorregulado. Homogenizar. Control
Solidificar Esterilidad (0)

Incubar estos nueve tubos a 35ºC ± 1ºC por 24 h ± 2 h.

Agregar 15 ml de agar VRBG como doble
capa. Dejar solidificar.
Incubar invertidas a 35ºC ± 1ºC por 24 h ±
Desde cada uno de los tubos en que se observa turbidez, sembrar con un asa Controles de Productividad 2 h.que contengan no
Seleccionar las placas
Recuento y selección de

sobre placas de agar VRBG, para obtener colonias aisladas más de 150 colonias típicas; contar y
registrar estas colonias presuntivas.
Seleccionar cinco de tales colonias desde
colonias

cada placa para la confirmación

Aislamiento

bioquímica.

E. coli (+) E. Feacalis(-) Est Subcultivo Control

Incubar las placas a 35ºC ± 1ºC por 24 h ± 2 h. (0) Sembrar en estría sobre placas de agar Esterilidad (0)
nutritivo cada una de las colonias
seleccionadas para la confirmación.
Colonias típicas: rosadas o
Confirmación
colonias para la
confirmación

rojas (con o sin anillos de

Selección de

Seleccionar al menos tres colonias desde cada una de las placas incubada precipitación) o colonias
para la confirmación bioquímica. incoloras, mucoides

Incubar estas placas a 35ºC ± 1ºC por 24 h

± 2 h.

Confirmación bioquímica

Prueba de oxidasa

Usar asa o aguja de Positiva: Papel o disco color azul .

inoculación desechable Negativa: no se ha torna azul en 10 s.
tomar una porción de cada
colonia aislada sobre un
disco.

Prueba de fermentación

Repicar en profundidad,
usando una aguja de
inoculación, las mismas Positiva: Se desarrolla un color amarillo
colonias seleccionadas para a lo largo del tubo. La mayoría de las
la prueba de la oxidasa en variedades producen gas.
tubos que contienen agar
glucosa previamente
deaireado y enfriado.

Incubar a 35ºC ± 1ºC por

24 h ± 2 h
Expresión de resultados
8.1 Cálculo del Número Más Probable (NMP)
Ver NCh2047.
8.1.1 Si una de las colonias típicas seleccionadas de un subcultivo es oxidasa-negativa y
glucosa-positiva, el tubo del que deriva el subcultivo será considerado como positivo.
8.1.2 Contar y registrar el número de tubos que dan una reacción positiva para cada
dilución.
8.1.3 Usando la tabla NMP (ver Anexo B), determinar a partir del número de tubos
positivos en las diferentes diluciones, el índice de número más probable (NMP).
8.1.4 El número de Enterobacteriaceae por gramo igual al índice de NMP.

Caso general - Placas que contienen hasta 150 colonias típicas

Calcular el número, N, de Enterobacteriaceae por gramo de producto,

usando la ecuación siguiente:

Tomar como resultado el número de microorganismos por gramo de muestra

expresado como un número entre 1,0 y 9,9 x 10x ufc, donde x es la correspondiente
EJEMPLO

Un recuento directo de microorganismos dio los resultados siguientes:

- en la primera dilución (10-3): 66 y 80 colonias;
- en la segunda dilución (10-4): cuatro y siete colonias.
Los números siguientes fueron repicados:

- para 66 colonias: cinco colonias, cuatro de las cuales coincidieron con

los criterios,
- para 80 colonias: cinco colonias, tres de las cuales coincidieron con los
criterios,
- para siete colonias: cinco colonias, cuatro de las cuales coincidieron
con los criterios,

dando a=6. Como a=80%, se consideran las siete colonias;

- para cuatro colonias: las cuatro coincidieron con los criterios dando
a=4.
Por lo tanto:

Aproximando el resultado como se especificó da 56 818 ó 5,7 x 104

Enterobacteriaceae
por gramo de producto.
Cálculo del recuento en placa
Ver NCh2047.
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