Determinación de Staphylococcus aureus

Pesar 25 gramos de muestra en Bolsa y ambiente estéril

↓
Homogeneización

Añadir 225 ml en bolsa para Stomacher (1:9).

10- 1

Homogenizar por 1 min. Constituye la dilución 10-1.

↓
Agregar 1 ml del homogenizado a 9 ml del diluyente
Dilución de la muestra

Constituye la dilución 10-2; 10-3;10-4

↓
El tiempo transcurrido entre la preparación del homogeneizado de la muestra y
la siembra, no debe ser superior a los 15 min.

↓
Inoculación e incubación
 Transferir a placas con agar Baird Parker + emulsión de huevo + telurito de
potasio 0,1 ml en duplicado.

Inoculación e incubación

↓
Distribuir el inóculo, mediante un rastrillo de vidrio. Dejar secar las placas
tapadas por 15 min a la temperatura del laboratorio.

↓
Incubar las placas en forma invertidas en estufa a 35ºC ± 1°C por 24 h ± 2 h

↓
Reincubar todas las placasen estufa a 35ºC ± 1°C por otras 24 h ± 2 h, y marcar
cualquier colonia típica nueva que haya aparecido.
Recuento de colonias y registro

↓
Considerar para la enumeración solamente aquellas placas que contienen como
máximo 150 colonias típicas en dos diluciones sucesivas. Una de las placas debe
contener por lo menos 15 colonias. Seleccionar para la confirmación (10) un
número dado A de colonias a lo menos cinco colonias típicas por placa

Remover con una aguja de inoculación, cada colonia seleccionada y transferir a

un tubo con caldo BHI

Incubar en estufa a 35ºC ± 1ºC por 24 h ± 2 h

↓
Confirmación
 Añadir 0,1 ml de cada cultivo a un tubo que contenga 0,3 ml de plasma de
conejo + EDTA.

Confirmación ↓
Incubar en estufa a 35ºC ± 1ºC.
↓

Inclinar el tubo y observar la coagulación del plasma después de 4 h a 6 h de

incubación, si la prueba es negativa, observar nuevamente a las 24 h ± 2 h de
incubación. Considerar la prueba de coagulasa positiva, si el volumen del
coágulo ocupa más de la mitad del volumen original del líquido.
Control ambiental; Control de
productividad (+ y -) ; Control esterilidad
diluyente

Control Ambiental
Control ambiental; control de productividad
(+ y -); control de plasma con BHI sin
inóculo.

(-)Staphylococcus epidermidis en BHI

 Cálculo del número a de Staphylococcus aureus coagulasa positiva
después de la confirmación Calcular,

para cada una de las placas, el número a de Staphylococcus aureus

coagulasa positiva confirmados, de acuerdo a la ecuación:
CAba=×
en que: A = número de colonias típicas seleccionadas y sometidas al
ensayo de la coagulasa (10)
b = número de colonias típicas que resultan coagulasa positiva
C = número de colonias típicas presentes en la placa (9).

Aproximar el número de colonias calculado a dos cifras significativas. Para esto, si la última cifra est

Cálculo del número N de Staphylococcus aureus coagulasa positiva presentes en la muestra analiz

Calcular el número de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en la muestra de ensayo, como la m

∑a = suma de colonias de Staphylococcus aureus identificadas en todas las placas seleccionadas de

V = volumen de inóculo de cada placa, en mililitros, ml;
n1 = número de placas seleccionadas de la primera dilución
n2 = número de placas seleccionadas de la segunda dilución;
d = factor de dilución correspondiente a la primera dilución seleccionada (la suspensión inicial es un

Aproximar el resultado calculado a dos cifras significativas

Informar el resultado como el número de Staphylococcus aureus coagulasa positiva por gramo, exp

Si de dos placas, correspondientes a la suspensión inicial, cada una contiene menos de 15 colonias c
Estimación de números bajos
Si las dos placas, correspondientes a la suspensión inicial, no contienen colonias de Staphylococcus
11.2.2 Si las dos placas, correspondientes a la suspensión inicial, no contienen colonias de Staphyloc
 esto, si la última cifra está por debajo de 5, no se modifica la cifra precedente; si la última cifra es 5 o más, aumentar la cifra precedente e

ntes en la muestra analizada

stra de ensayo, como la media ponderada de dos diluciones sucesivas usando la ecuación siguiente:

placas seleccionadas de dos diluciones sucesivas

a suspensión inicial es una dilución)

a positiva por gramo, expresado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10x donde x es la correspondiente potencia de 10

ne menos de 15 colonias confirmadas, informar el resultado de la manera siguiente.

onias de Staphylococcus aureus coagulasa positiva y si en la inoculación se han sembrado 0,1 ml de muestra, informar el resultado como s
nen colonias de Staphylococcus aureus coagulasa positiva y si en la inoculación se han sembrado 0,1 ml de muestra, informar el resultado
aumentar la cifra precedente en una unidad. Proceder gradualmente hasta obtener dos cifras significativas.

pondiente potencia de 10
ra, informar el resultado como sigue (caso general de inóculos de 0,1 ml):
muestra, informar el resultado como sigue (caso general de inóculos de 0,1 ml): - menor de 10/d Staphylococcus aureus coagulasa positiv
coccus aureus coagulasa positiva por gramo, donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial. Si la inoculación se realizó con 1 ml d
noculación se realizó con 1 ml de muestra, informar el resultado como sigue: - menos de 1/d Staphylococcus aureus coagulasa positiva po
us aureus coagulasa positiva por gramo
Informe El informe de resultados debe incluir, a lo menos, los antecedentes siguientes:

12.1 Identificación única del informe

12.2 Nombre y dirección del laboratorio donde se efectuaron los ensayos.
12.3 Nombre y dirección del solicitante
12.4 Identificación de la muestra
12.5 Fecha de muestreo
12.6 Fecha de recepción de la muestra.
12.7 Fecha de ensayo de la muestra.
Identificación del método utilizado.
12.9 Resultados: recuento Staphylococcus aureus coagulasa positiva = (Nº) 6) ufc/g.
12.10 Nombre y firma del responsable.
12.11 Acreditación para esta técnica, si existe (por ejemplo, ISO 17025)