CÓDIGO

GESTIÓN ACADÉMICA
VERSIÓN 01

INSTRUCTIVOS DE PRÁCTICAS LABORATORIO FECHA ABRIL 2020

BIOTECNOLOGIA
PÁGINA
MICROBIOLOGIA APLICADA

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCIÓN
La identificación bacteriana preliminar puede hacerse mediante la observación de características
de las colonias y morfología con tinción de gram. Sin embargo, la caracterización final de un
aislamiento bacteriano desconocido para identificarlo a nivel de género y especie habitualmente
se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y
sirven como marcadores para identificación. En el laboratorio de microbiología, éstos sistemas
enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de una colonia bacteriana bien aislada
en una serie de medios de cultivo que contienen sustratos específicos e indicadores químicos
para detectar cambios del pH o la presencia de subproductos específicos
OBJETIVO
o Reconocer las reacciones metabólicas para la identificación bacteriana.
o Evidenciar cómo la bioquímica celular es importante en la microbiología.

FUNDAMENTO

Las pruebas bioquímicas de función enzimática son herramientas esenciales para estudiar el metabolismo
microbiano. Estas pruebas proporcionan información detallada sobre las actividades enzimáticas específicas
de un microorganismo, lo que facilita la identificación y caracterización de cepas bacterianas, y se llevan a
cabo mediante la observación de reacciones específicas que indican la presencia o actividad de ciertas
enzimas en una muestra bacteriana.
Algunas de estas pruebas bioquímicas más comunes son:

 Prueba de la Catalasa: Detecta la presencia de la enzima catalasa. Se añade peróxido de hidrógeno

a una muestra bacteriana. La presencia de burbujas de oxígeno indica actividad catalasa. Se usa para
determinar la diferencia entre bacterias catalasa-positivas (burbujas) y catalasa-negativas.

 Prueba de la Oxidasa: Detecta la presencia de la enzima citocromo oxidasa. Se impregna una tira
con un reactivo oxidable. La formación de un color azul oscuro indica actividad oxidasa. Útil para
distinguir entre bacterias oxidasa-positivas y oxidasa-negativas.

 Prueba de la Coagulasa: Detecta la presencia de la enzima coagulasa. Se mezcla la bacteria con

plasma. La formación de coágulos indica actividad coagulasa. Utilizada para diferenciar
Staphylococcus aureus (coagulasa-positiva) de otras especies.

 Pruebas de Ureasa: Se incuba la bacteria en un medio que contiene urea. Se observa un cambio de
color debido a la liberación de amoníaco. Un cambio de color indica actividad ureasa.
 Reducción de Nitratos: Algunas bacterias tienen la capacidad de reducir nitratos (NO ₃⁻) a nitritos
(NO₂⁻) o incluso a productos nitrogenados finales, como el óxido nitroso (N₂O) o el gas nitrógeno
(N₂). La prueba implica la adición de reactivos que detectan la presencia de nitritos o productos
finales de la reducción de nitratos, lo que se manifiesta como un cambio de color.

 Producción de Indol: La producción de indol es una prueba que evalúa la capacidad de una bacteria
para descomponer el triptófano en indol, amoníaco y ácido pirúvico. Se realiza mediante la adición
de reactivos que forman un complejo coloreado en presencia de indol, como el reactivo de Kovacs.

 Utilización de Citrato: La utilización de citrato es una prueba que evalúa si una bacteria puede
utilizar citrato como única fuente de carbono. Se utiliza un medio de cultivo de citrato, y el cambio
de color del medio de verde a azul indica la utilización de citrato.

 Motilidad: La motilidad evalúa la capacidad de las bacterias para moverse activamente. Se inocula
la bacteria en un medio semisólido (agar con menor concentración) y se observa la difusión o
dispersión de la bacteria desde el punto de inoculación.

MEDIOS DE CULTIVO

Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Diferenciar entre bacterias que fermentan lactosa y las que
no. Las bacterias que fermentan lactosa producen colonias de color oscuro, mientras que las no
fermentadoras desarrollan colonias de color claro.

 Agar MacConkey: Diferenciar entre bacterias que fermentan lactosa y las que no, así como
distinguir entre lactosa y no fermentadores. Las bacterias lactosa-fermentadoras producen colonias
rosadas o rojas, mientras que las no fermentadoras desarrollan colonias incoloras.
  Agar SS (Salmonella-Shigella): Inhibir el crecimiento de Gram-positivas y diferenciar entre
enterobacterias. Las bacterias que fermentan lactosa y producen ácido generan colonias rosadas o
rojas, mientras que las que no fermentan lactosa desarrollan colonias incoloras.

 Medios Selectivos:

Agar CNA (Columbia colistin-nalidixic acid): Inhibir el crecimiento de

Gram-negativas y seleccionar Gram-positivas. Contiene colistina y ácido
nalidíxico para inhibir bacterias Gram-negativas.

 Agar Thayer-Martin: Selectivo para Neisseria gonorrhoeae y Neisseria

meningitidis. Contiene antibióticos para inhibir el crecimiento de
bacterias no patógenas.

Medios de Enriquecimiento:

 Caldo Selenito: Enriquecimiento para Salmonella y Shigella.Contiene sulfito y selenito para inhibir
bacterias comunes y favorecer el crecimiento de Salmonella y Shigella.
 Caldo de Lactosa Brilla en Verde: Enriquecimiento para bacterias coliformes. Contiene lactosa y
sales biliares para favorecer el crecimiento de coliformes.
 Medios de Identificación Específicos:

 Agar MSA (Manitol Sal Agar): Identificar Staphylococcus

aureus. Contiene manitol y un indicador de pH para distinguir
entre Staphylococcus aureus y otros estafilococos.

 Agar TCBS (Tiosulfato Citrato Sales de Biliares Sacarosa):

Identificar Vibrio cholerae. Contiene sacarosa y tiosulfato para
diferenciar Vibrio cholerae de otras bacterias.

 Agar TSI (Triple Sugar Iron): Se utiliza para diferenciar

bacterias entéricas, especialmente del grupo Enterobacteriaceae,
según su capacidad para fermentar azúcares y producir gases y
sulfuro de hidrógeno (H₂S).

 Fermentación de Azúcares: El medio contiene tres azúcares: glucosa,

lactosa y sacarosa. La fermentación de estos azúcares produce ácido,
cambiando el color del indicador de pH (rojo de fenol). Amarillo:
Fermentación ácida de al menos uno de los azúcares. Rojo: No hay
fermentación significativa.
 Producción de Gas:La fermentación puede ir acompañada de producción
de gas, evidenciada por la presencia de burbujas o fisuras en el agar.
 Producción de Sulfuro de Hidrógeno (H₂S):
La presencia de sulfato ferroso en el medio permite detectar la
producción de H₂S.Formación de un área negra o de color negro en el
agar indica la producción de H₂S.

 El Agar SIM: Se utiliza para diferenciar bacterias, principalmente enterobacterias, según su

capacidad para producir sulfuro de hidrógeno, indol y su motilidad. Estas características metabólicas
ayudan en la identificación y clasificación de microorganismos. Las bacterias que tienen la
capacidad de reducir tiosulfato a sulfuro de hidrógeno (H₂S) producen colonias de color negro en el
medio debido a la reacción con el hierro presente.
 Producción de Indol: La presencia de triptófano en el medio permite la producción de indol. La adición
de reactivo de Kovacs después de la incubación revela la presencia de indol, mostrándose en forma de
color rojo en la capa superior del medio.

 Motilidad: El Agar SIM se presenta en forma de tubo, lo que

permite observar la motilidad de las bacterias. La difusión
radial desde el punto de inoculación indica motilidad,
mientras que la falta de difusión sugiere falta de motilidad.

 El Agar Citrato de Simmons: Se utiliza para determinar

si una bacteria tiene la capacidad de utilizar el citrato
como fuente de carbono, lo que se refleja en un cambio
de color del indicador de pH en el medio.
 Utilización de Citrato: El citrato de sodio en el medio es la única fuente de carbono. Las bacterias que
pueden utilizar el citrato como fuente de carbono producirán álcali durante el proceso de fermentación,
aumentando el pH del medio. Indicador de pH: El indicador de bromotimol en el medio cambia de verde
a azul al elevarse el pH debido a la utilización del citrato.
 Azul intenso: Utilización positiva de citrato. Indica que la bacteria es capaz de utilizar el
citrato como fuente de carbono y ha alcalinizado el medio. Verde: Utilización negativa de
citrato. Indica que la bacteria no ha utilizado el citrato, y el pH del medio permanece
inalterado.

 El Agar LIA: Se utiliza para diferenciar entre bacterias entéricas, especialmente en la identificación
de Salmonella y algunas especies de Proteus, basándose en su capacidad para desaminar la lisina,
fermentar azúcares y producir sulfuro de hidrógeno.
 Desaminación de Lisina: La lisina en el medio es un sustrato para la desaminación. Las
bacterias capaces de desaminar la lisina alcalinizan el medio, generando un cambio de color de
rojo a púrpura.
 Fermentación de Azúcares: La presencia de glucosa y lactosa permite evaluar la capacidad de
fermentación. Áreas amarillas indican fermentación ácida.
 Producción de Sulfuro de Hidrógeno (H₂S): La reducción de tiosulfato a sulfuro de hidrógeno
se evidencia por la formación de un anillo negro en el medio.
 Púrpura en la parte superior: Desaminación de lisina (positiva).
 Amarillo en la parte inferior: Fermentación ácida de glucosa.
 Amarillo en la parte inferior y superior: Fermentación ácida de glucosa y lactosa.
 Negro en la parte inferior: Producción de sulfuro de hidrógeno (H₂S).
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EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES Y REACTIVOS MEDIOS DE CULTIVO Y AGARES

▪ Tubo de ensayo con plasma ▪ Cultivo puro de Staphylococcus aureus
▪ Portaobjeto ▪ Cultivo puro de cocos gram positivos coagulasa
▪ Papel de filtro y catalasa negativos
▪ Gotero ▪ Cultivo puro de Pseudomona
▪ Coloración de gram ▪ Cultivo puro de Escerichia coli
▪ Peróxido de hidrógeno al 3% ▪ Cultivo puro de Citrobacter o Arizona
▪ Reactivo de Citocromooxidasa ▪ Cultivo puro de Salmonella
▪ Rojo Metilo ▪ Cultivo puro de Klebsiella
▪ Voges Proskauer ▪ Cultivo puro de enterobacter
▪ Nitrato ▪ Agar Sangre
▪ LIA ▪ Agar Mac Conkey
▪ Agar EMB Batería bioquímica:
▪ Agar TSI
▪ Agar Indol motilidad
▪ Agar citrato
▪ Agar urea
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PROCEDIMIENTO

Se toman las colonias Utilizar un hisopo Por ultimo se

Prueba apartir del medio de cultivo para transferir las adicionan 1 o 2
Catalasa que contiene el colonias al gotas de peroxido
microorganismo de estudio portaobjetos de hidrogeno al 3%

Pruebas
bioquimicas

Prueba Agregar unas pocas Una muestra de el

Aplicar sobre el
Citocromo gotas del reactivo a una microorganismo mediante
papel
Oxidasa tira del papel de filtro una gota

Utilizar una asa abrirla caja petri cerca sembrar por

redonda para tomar del mechero para evitar agotamiento en los
Cajas de una muestra de contaminacion distintos agares
petri
Medios de inóculo.
cultivo Utilizar una asa Abrir el tubo de Inocular por punción en
Tubos de recta para tomar ensayo cerca del profundidad o por estría en
ensayo una muestra de mechero para prevenir superficie, dependiendo del
inóculo. la contaminación. tipo de agar.
 CUESTIONARIO

1. ¿Qué es el metabolismo bacteriano?

2. ¿Cuál es la importancia de los medios de cultivo diferenciales en microbiología?
3. Explica cómo funcionan estos medios y cómo permiten la distinción entre distintos
microorganismos.
4. ¿Cuál es la función principal de un medio de cultivo selectivo?
5. Explica cómo un medio selectivo inhibe el crecimiento de ciertos microorganismos mientras
permite el crecimiento de otros.
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BIBLIOGRAFIA
▪ Pruebas bioquímicas de identificación de bacterias - ULPGC
https://www2.ulpgc.es/hege/almacen/download/35/35729/
pruebas_bioquimicas_de_identificacion_de_bacterias.pdf

▪ Pruebas bioquímicas | PPT - SlideShare

https://es.slideshare.net/SusanaGG/pruebas-bioqumicas

▪ Manual de laboratorio de microbiologia - Universidad Veracruzana

https://www.uv.mx/qfb/files/2020/09/Guia-de-Microbiologia.pdf