07-09-2022

Test Aptitud de Método

Diplomado GMP, con énfasis en auditorías, validación y

análisis de riesgo

M.Sc. Q.F. CRISTIAN PARRA G.

Ensayo de Aptitud

Es un ensayo que tiene por finalidad desafiar o probar una técnica

microbiológica frente a determinados microorganismos, para que
cuando sea probada en el producto verificar que no presenta
propiedades inhibitorias frente a los microorganismos.

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Ensayo de Aptitud

Cuando lo realizo?

• Producto nuevo
• Cambio en la fórmula
• Cambios en el método (medios de cultivos, por ejemplo)
• Cambios de especificaciones

Requerimientos previos

• Técnica microbiológica
• Personal calificado
• Microorganismos de referencia
• Medios de cultivos (probados)
• Equipos calificados
• Esterilización validada

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Productos No estériles

• Método Directo
• Método Directo con disolución
• Filtración
• Combinado

Productos No estériles
y que se evalúa en ellos?

• Recuento de Aerobios Totales

• Recuento de Hongos y Levaduras

• Investigación de microorganismos específicos

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Productos No estériles
Cuando se hace el método
Directo?
• Productos que no presentan inhibición bacteriana.

• Productos donde se pudo neutralizar el efecto conservante.

Productos No estériles
Método Directo

• Se hace una transferencia directa a la placa.

• Eventualmente se puede tomar una dilución menor (1/10) que

también es considerada directa.

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• Productos No estériles
Cuando se hacen los otros
métodos?
(Método Directo con disolución, Filtración, Combinado).

• Productos que presentan inhibición bacteriana.

• Productos donde no se pudo neutralizar el efecto conservante,

sin tratar la muestra.

Productos No estériles
Método Directo con dilución

• Diluciones 1/20, 1/50, 1/100

• Luego de esa dilución, si hay desarrollo se saca en forma directa

para evaluar microorganismos específicos.

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Productos No estériles
Método por filtración
• Dilución, normalmente 1/10

• Luego se hace una filtración por membrana para recuento. Si

hay desarrollo se saca en forma directa para evaluar
microorganismos específicos.

Productos No estériles
Método combinado

• Se realiza una dilución de la muestra, luego se filtra.

• Filtración por membrana para recuento y evaluar

microorganismos específicos.

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Como se interpretan los valores

Test Aptitud
• El objetivo de esta adecuación de metodología es establecer la
técnica para el Control Microbiológico de Productos no
Obligatoriamente Estériles, verificando que no existe actividad o
es neutralizada la acción bacteriostática y/o fungistática de parte
de la muestra, en las condiciones del ensayo, logrando una
recuperación satisfactoria de los microorganismos testeados.

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Test Aptitud
• El Control Microbiológico de Productos no Obligatoriamente
Estériles abarca el Recuento de Microorganismos Aerobios
Totales, Recuento de Hongos y Levaduras y Búsqueda de
Microorganismos Específicos, que, de acuerdo a la vía de
administración y naturaleza de este producto, corresponde la
búsqueda de Escherichia Coli, Salmonella entérica,
Staphylococcus aureus, y Pseudomona aeruginosa.

Test Aptitud
• La adecuación de metodología es considerada válida, basada en
el porcentaje de recuperación en los recuentos de los
microorganismos testeados y la recuperación de los
microorganismos específicos.

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Test Aptitud
• Se debe conocer la fórmula de cada producto.
• La fórmula debe ser cuantitativa.

• Se deben tener los medios de cultivo adecuados.

• MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

Agar Digerido de Caseína – Soja
Caldo Digerido de Caseína – Soja
Caldo Digerido de Caseína – Soja
Agar Sabouraud Dextrosa
Agar MacConkey
Caldo Peptona + 0,5 % Lecitina de Soja + 4 %Tween 20 (Caldo
PLP)
NaOH 1N
HCl 1N

Test Aptitud
• Las cepas no deben tener más de 5 repiques, tienen que tener
su trazabilidad de referencia

• Algunas cepas utilizadas:

Aspergillus brasiliensis
Candida albicans
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Escherichia coli

Métodos más comunes para preservar es la liofilización o la

criopreservación.

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Test Aptitud
• Por qué son importantes las cepas de referencia?

Son requerimientos normativos, GLP e ISO 17025

Test Aptitud
• Por qué son importantes las cepas de referencia?

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Test Aptitud
• Por qué son importantes las cepas de referencia?

Test Aptitud - controles

■ El método específico dependerá del producto, en los
capítulos generales de la farmacopea <61> y <62>, salen los
límites y las indicaciones para productos no estériles.

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Test Aptitud – Inóculo Control

■ Desde la cepa (o cultivo puro)
■ Se hacen diluciones seriadas
■ Siembra e incubar

Test Aptitud – Muestra e Inóculo

■ Preparación muestra (10 g o 10 mL – Dil 1/10)
■ Homogenizar y medir pH
■ Inocular con la dilución apropiada, se trata de obtener 100
ufc /g o mL de producto.
■ Se espera incubación.
■ Se realiza recuento y/o investigación
■ El volumen del inóculo no debe superar el 1%.

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Test Aptitud - controles

■ -Hacer un control positivo de cada microorganismo sin
presencia de producto.
■ -Hacer control del producto en cada dilución sin inóculo para
evaluar la posible carga microbiana del mismo (Control
Negativo)
■ Se preparan con la misma solución nutritiva diluyente.

Test Aptitud - controles

■ Control Negativo del medio de cultivo.
■ Se preparan con la misma solución nutritiva diluyente.

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Test Aptitud - Conclusión

■ El control de inóculo del microorganismo de ensayo, en placa,
se encuentra dentro del rango de 10 – 100 UFC en un
volumen conocido de suspensión.

Puntos importantes
■ Documentar adecuadamente.
■ El muestreo debe ser representativo.
■ Investigar adecuadamente las desviaciones, similar a OOS.

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Puntos importantes
■ Se realiza en 3 lotes o en 3 repeticiones para tener
resultados estadísticos.
■ En caso de realizar en otras instalaciones (o laboratorios) se
debe realizar una adecuada transferencia analítica.
■ Cumpliendo todo lo anterior se puede señalar si el método es
APTO para el análisis del producto testeado.

OOS para microbiología

■ Tiene complejidades adicionales a los otros métodos

analíticos.
De todas formas se deben investigar puntos en común.

■ Equipos

■ Calibraciones

■ Mantenciones

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OOS para microbiología

■ Calificaciones

■ Preparaciones correctas de reactivos

■ Esterilización de caldos efectivas.

■ Sistema de Esterilización validados.

OOS para microbiología

■ Capacitación del personal.

■ Contaminaciones potenciales controladas.

■ Sistema de Aire, cabinas, etc.

■ Materiales estériles.

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Búsqueda de
Microorganismos Específicos
■ Staphylococcus aureus
■ Utilizando un factor de dilución apropiado,
disolver una cantidad de muestra
(equivalente a 10 g) en un volumen
adecuado de diluyente Peptona Buffereada
Cloruro de Sodio pH 7,2, Buffer Fosfato pH
7,0 o Caldo Digerido de Caseína y Soja,
según las características de la muestra a
analizar.
■ Transferir un volumen de la dilución
preparada, equivalente a 1 gramo de
muestra, a 90 mL de Caldo Digerido de
Caseína - Soja.

Búsqueda de
Microorganismos Específicos
■ Inocular con un volumen adecuado de suspensión de
Staphylococcus aureus para obtener un inóculo de no más de 100
UFC en el caldo de enriquecimiento.

■ Mezclar e incubar la suspensión inoculada, en estufa de cultivo a

30 - 35 ºC por 18 - 24 horas.

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Búsqueda de
Microorganismos Específicos
■ Realizar controles positivos.
■ Realizar los controles negativos.
■ Luego de las 18 - 24 horas de incubación, tanto a la muestra
como a sus controles, proceder a aislar cada uno, en placa de
Agar Manitol Salado e incubar en estufa de cultivo a 30 - 35 ºC
durante 18 – 72 horas.

Criterio de Aceptación:
La morfología de Staphylococcus
aureus sobre el Agar Manitol Salado
debe observarse como colonias
amarillas rodeadas de zonas amarillas.

Búsqueda de
Microorganismos Específicos
■ Pseudomonas aeruginosa

Criterio de Aceptación:
La morfología de Pseudomonas aeruginosa
sobre el Agar Cetrimide debe observarse
como colonias de un color verdoso nítido.

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Búsqueda de
Microorganismos Específicos
El método se va replicando con otros organismos específicos que
se buscaran (Aspergillus, Escherichia coli, etc.)

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