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CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO.
METODO ECOMETRICO
Objetivos
• Familiarizar a los estudiantes con las diferentes metodologías para controlar la
calidad de los medios de cultivo empleados en el diagnóstico microbiológico
(entendiendo como control el estado de funcionamiento de los medios, es decir, su
capacidad de recuperabilidad y selectividad).
• Concientizar a los estudiantes de la importancia que representa para el
aseguramiento de la calidad e inocuidad de los alimentos el contar con un
programa de calidad de medios de cultivo microbiológicos.
Marco teórico
Los servicios de análisis microbiológico representan uno de los elementos
fundamentales de todo programa de inocuidad y de control de calidad de calidad de
los alimentos.
El laboratorio de microbiología más que un simple servicio de apoyo, se constituye en
una herramienta veraz y eficaz para confirmar si un alimento:
• Puede ser o fue el vehículo de ETAs, ayuda a identificar el origen de la
contaminación (materia prima, superficies, ambientes, manipuladores, etc.)
• Juega un papel importante en el control, monitorización y validación de un
programa de aseguramiento de la calidad como lo es el sistema de Análisis de
peligros y puntos de control críticos (HACCP).
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Marco teórico
Medios de cultivo y reactivos: la importancia que tiene la calidad en la fabricación de
los medios de cultivo deshidratados así como su preparación, conservación y uso, es
el punto de partida para lograr que estudios microbiológicos y resultados confiables.
Los laboratorios utilizan diversos medios de cultivo sin efectuar la comprobación
de sus eficiencia, en la mayoría de los estudios sobre calidad en los laboratorios uno
de los puntos críticos son los medios de cultivo reconstituidos.
Inicialmente los fabricantes de medios de cultivo pueden ofrecer una buena calidad
de los mismos en cuanto a su capacidad de recuperación y/o selectividad, estado físico
(granulado, en polvo, deshidratado, etc.).
Criterios mínimos que debe cumplir un laboratorio de microbiología para
asegurar un control de calidad de medios de cultivo:
• A cada lote se le debe realizar pruebas de funcionalidad del medio preparado
para confirmar que es satisfactorio y si cumple con las especificaciones para el
propósito señalado.
• El laboratorio deberá tener un criterio serio para la compra de medios de cultivo,
así como para su almacenamiento y conservación.
• Normalizar: la preparación, manipulación y conservación de cada medio de cultivo.
• Desarrollar o implementar métodos y procedimientos para verificar la
esterilidad, pH, capacidad de crecimiento, pruebas de funcionalidad
(productividad, selectividad y estabilidad), etc.
• Seleccionar los microorganismos de prueba (cepas control) de acuerdo con el tipo
de medio a evaluar.
• Implementar un programa definido para la esterilización y eliminación de los
medios de cultivos ya usados.
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Marco teórico
Pero su uso inadecuado, así como su almacenamiento, preparación y elementos que
intervienen durante esta operación pueden conducir a un deterioro de los mismos, y
como consecuencia se evaluaran inadecuadamente la contaminación real de las
muestras analizadas o alteración de los datos en una investigación microbiológica.
La evaluación con cepas control, es un punto importante para determinar la calidad del
medio.
Criterios mínimos que debe cumplir un laboratorio de microbiología para
asegurar un control de calidad de medios de cultivo:
• Usar agua destilada o desmineralizada para la preparación de medios de cultivo
que satisfagan las exigencias requeridas.
• Preparar y aplicar un programa de supervisión de la calidad del agua destilada,
comprobar que no contenga trazas de compuestos inhibidores o bactericidas.
• Utilizar para la preparación, medios de cultivo, equipo, materiales, reactivos, que
cumplan con los requisitos de calidad.
• Conservar y registrar los resultados de las pruebas control.
• Cuando no se conozca la fecha de vencimiento de un medio de cultivo y antes de
usarlo para cualquier ensayo, se debe valorar primero su funcionalidad.
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Criterios mínimos que debe cumplir un laboratorio de microbiología para
asegurar un control de calidad de medios de cultivo:
• Los medios de cultivo deshidratados deben contar con una hoja de registro que
contenga mínimo la siguiente información: Nombre, Marca, Número de lote, Fecha
de adquisición, Fecha de apertura, Fecha de vencimiento (que debe ser como
mínimo de 3 años desde la adquisición), Número de codificación, datos de
preparación, indicador biológico usado para su control, resultados de los controles
de calidad, nombre del preparador, y Observaciones.
• Los medios de cultivo son higroscópicos, por esto deben mantenerse bien cerrados
para evitar cambios a nivel de pH, alteraciones del color y de las sustancias que los
componen.
• Deben almacenarse a temperaturas entre los 15ºC a 25ºC, en ambiente seco y libre
de luz, así como boca abajo para evitar la entrada de aire sobre los mismos.
Criterios mínimos que debe cumplir un laboratorio de microbiología para
asegurar un control de calidad de medios de cultivo:
• Para ajustar el pH de un medio no se deben emplear ácidos o bases débiles sino HCl
o NaOH 0.1 N.
• Todos los lotes deben cumplir con la prueba de esterilidad para verificar que
pueden ser usados sin problemas de contaminación.
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Criterios mínimos que debe cumplir un laboratorio de microbiología para
asegurar un control de calidad de medios de cultivo:
• Los medios de cultivo preparados deben almacenarse a temperaturas entre los
12ºC a 15ºC por 1 o 2 semanas, para prolongar su periodo de uso los medios
pueden ser almacenados en refrigeración cuidando siempre que la temperatura no
sea inferior de 0ºC ya que se desestabiliza el gel. En cualquier caso, deben
protegerse de la luz.
• Los medios de cultivo y los reactivos se deben almacenar en frascos color ámbar u
oscuros cuando así lo indiquen los fabricantes, y después de preparados se deben
proteger de la luz ya sea envolviendo el frasco en papel metálico, aluminio u otro
similar, o depositándolos en un cuarto oscuro.
• Si un medio o reactivo cambian de color o se hidratan, se deben dar de baja.
• No mezclar lotes de producto.
Puntos críticos durante la preparación de un medio de cultivo:
Todas las etapas durante la preparación de los medios de cultivo son consideradas
como puntos críticos de control. Estos puntos son:
• Pesada del medio deshidratado.
• Tiempo de exposición al medio ambiente, la luz solar, humedad.
• Agua destilada o desmineralizada empleada durante la preparación.
• Estado de limpieza de la cristalería empleada, presencia de residuos de detergentes
u otras sustancias químicas o biológicas.
• Mezcla y disolución de los ingredientes.
• Régimen de temperatura/tiempo de exposición al calor húmedo durante la
preparación y esterilización de los mismos.
• Corrección adecuada del pH.
• Adición de los suplementos.
• Servido de los medios de cultivo.
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Preparación de un medio de cultivo:
Todas las etapas durante la preparación de los medios de cultivo son consideradas
como puntos críticos de control. Estos puntos son:
1. Pesar.
2. Disolver.
3. Calentar.
4. Esterilizar.
5. Servir.
Control de calidad de medios de cultivo:
Para el control de calidad de medios de cultivo se debe usar un agar de referencia que
puede ser Agar Infusión Cerebro – Corazón (BHI), Agar Tripticasa de Soya (TSA o
CASOY) o Agar Estándar para conteo en placa (SPC).
El espesor de la capa de agar debe ser de unos 4 mm y deben estar bien secas
(preincubados a 35ºC por 2 horas o 55ºC por 10 minutos máximo).
Todos los medios de cultivo selectivos utilizados durante el trabajo ordinario deben
ir acompañados de un control positivo (microorganismos que se desea recuperar o
microorganismo deseado) y otro negativo (microorganismo que se desea inhibir total
o parcialmente) llamado interferente.
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Control de calidad de medios de cultivo:
En la mayoría de los laboratorios no se presta mucha atención al funcionamiento de
los medios de cultivo y por ende se pueden emitir resultados poco confiables.
Para su control es necesario realizar una prueba de productividad donde se
determina el rendimiento, la recuperación, el crecimiento de un microorganismo
que habitualmente se desarrolla en un medio de cultivo y la selectividad o supresión
del crecimiento del microorganismo, que se espera sea inhibido en el medio.
Normalmente se determina en los controles positivos; la productividad y no la
selectividad.
En ocasiones, por costos, se observan laboratorios que trabajan con medios de cultivo
con fecha de vencimiento ya expirada y/o alteradas.
Control de calidad de medios de cultivo:
Los medios no selectivos deben ir acompañados de un control positivo. Todos los
medios de cultivo de cada lote adquirido por el laboratorio deben ser probados para
demostrar su capacidad de reproductibidad, selectividad y estabilidad.
Cepas control: Las cepas control se usan para determinar la eficiencia de los medios de
cultivo sintéticos y semisintéticos deshidratados, estas cepas son un cultivo de un
microorganismo conocido y certificado por alguna entidad o laboratorio conocido.
Por ejemplo: American Type Culture Collection (ATCC – Colección de cultivos típicos
americanos – USA) que cuenta con una colección bastante grande de bacterias,
hongos y levaduras patógenas y no patógenas o la National Collection of Type
Cultures (NCTC – Colección Nacional de Cultivos típicos – Gran Bretaña; colección de
bacterias en general).
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Control de calidad de medios de cultivo: Materiales, Equipos e Insumos

Otras colecciones de cepas de cultivo son: MATERIAL DE VIDRIO y OTROS

Tubos para dilución.
DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen: hongos y bacterias no patógenas). Cajas de petri.
NCIB (National Collection of Industrial Bacteria: Bacterias no patógenas). Pipetas de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml. Asas de platino calibradas.
NRRL (Northern Regional Research Laboratory ARS Culture Collection: Tubos tapa rosca.
Microorganismos de importancia agrícola). Incubadoras a 25ºC, 35ºC y 45ºC.

MATERIAL BIOLÓGICO:
Cepas bacterianas de 18 horas de incubación y repicadas por tres días
consecutivos, y en fase estacionaria de:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus
epidermidis, Enterobacter aerogenes, Micrococcus spp.

Materiales, Equipos e Insumos Procedimiento

Evaluación de Medios sólidos:

MEDIOS DE CULTIVO:
Agar BHI, CASO, SPC, Baird Parker, Salado Manitol, VRBA, EMB, XLD, Salmonella –
Shigella, Bismuto sulfito, Hektoen, Chromocult, Caldo tetrationate, Caldo Rapaport,
Caldo selenite, Caldo Brilla.
Mossel y otros crearon un método que permite evaluar la sensibilidad de los medios
de cultivo selectivos al desarrollo de un microorganismo deseado y la resistencia a la
colonización por microorganismos indeseados y la selectividad de los medios no
selectivos, que se denomina METODO ECOMÉTRICO, y que está basado en los
siguientes procedimientos:

1. Se dividen las placas con un espesor de 4 mm y bien secas en 4 cuadrantes y se

marcan de forma conveniente sobre la base de la caja de Petri así:

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2. Depositar el medio de cultivo a evaluar en una capa cuyo grosor deberá ser de unos
4 mm.

3. A partir de cada uno de los cultivos en fase exponencial (mantenidos en crecimiento

toda la noche o 18 horas de incubación), tome con una asa calibrada de 1 microlitro y
trace sobre la superficie del medio 5 estrías paralelas a las líneas dibujadas en cada
cuadrante y una estría central, de forma progresiva y sin recargar, retorcer, repisar o
esterilizar el asa (Fig. 2). Hacer lo mismo con el medio de referencia.

4. Incubar las placas en posición invertida por el tiempo necesario y a la 5. Transcurrido el tiempo, efectuar la lectura de las cajas, teniendo en cuenta que
temperatura apropiada según el método. cada estría tiene un valor de 0.2 y la estría central de 1.0.

𝑰𝑪𝑨 𝑴𝒆𝒅𝒊𝒐 𝒆𝒗𝒂𝒍𝒖𝒂𝒅𝒐

6. Multiplicar por el número de estrías en las cuales se observa crecimiento, y 𝑰𝑪𝑹 =
𝑰𝑪𝑨 𝑴𝒆𝒅𝒊𝒐 𝒓𝒆𝒇𝒆𝒓𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂
determinar el Índice de crecimiento absoluto (ICA). Si hay crecimiento en las cinco
estrías de los cuatro cuadrantes y la estría central (1), el ICA es igual a 5.
OBSERVACIONES:
• El ICR deberá estar cercano a 1.
El ICA es igual al número del cuadrante cuando todas las estrías de este y de los
cuadrantes anteriores muestren un crecimiento completo, mientras no se observe • Para evaluar la productividad de un medio selectivo, se mide teniendo en cuenta
crecimiento en ninguna estría del cuadrante siguiente. que las cepas esperadas (microorganismos deseados) deben dar un ICA no menor a
2.5 – 3.
• Para evaluar la selectividad de un medio, se mide teniendo en cuenta que el
7. Efectuar la misma operación con el medio de referencia. Una vez obtenida las microorganismo interferente (no esperado) debe dar un ICA no mayor de 2.
lecturas en cada medio (ICA), sacar el Índice de Crecimiento Relativo (ICR),
comparando el ICA del medio en evaluación y el medio de referencia
𝑰𝑪𝑨 𝑴𝒆𝒅𝒊𝒐 𝒆𝒗𝒂𝒍𝒖𝒂𝒅𝒐
𝑰𝑪𝑹 =
𝑰𝑪𝑨 𝑴𝒆𝒅𝒊𝒐 𝒓𝒆𝒇𝒆𝒓𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂

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Evaluación de Medios líquidos selectivos y no selectivos:
Para evaluar el índice de crecimiento en medios de cultivo líquidos selectivos y no
selectivos, se puede emplear el METODO ECOMÉTRICO empleado para evaluación de
medios sólidos o un método general en agares no selectivos. El procedimiento general
es el siguiente:
• Se distribuyen 10 ml de caldo de referencia (Agua peptona 1%) y del que se va a
ensayar en tubos taparosca.
• Se esteriliza en autoclave según instrucciones del fabricante.
• A partir de cultivos en fase estacionaria, se siembran los caldos por duplicado con
0.1 ml de cultivo de cada microorganismo que contenga 105 UFC/ml (Fase
estacionaria 1:100).
El método de la evaluación del desempeño del caldo selectivo con una mezcla de
cultivos deseados e indeseados se desarrollo para valorar medios para Salmonella
spp. Consiste en lo siguiente:
1. Preparar cajas petri con Agar Tripticasa de Soya u otro Agar no selectivo.
2. Con cultivos de la cepa deseada en fase estacionaria, preparar diluciones decimales
consecutivas (10–1 a 10 – 10 ) en solución salina peptonada, preparada según la
formulación que se indica enseguida (NaCI 8.5 g, peptona 1.0 g y agua destilada 1L
pH (7 – 7.2), estimar el número de UFC/ml con siembra en superficie sobre un Agar
no selectivo, seleccionar una dilución que permita un recuento. Al mismo tiempo
preparar un pool de cepas patrón no deseadas tomando 1 ml de cada uno de los
microorganismos no deseados y diluir 10-1 en solución salina peptonada.
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Evaluación de Medios líquidos selectivos y no selectivos:
• Se retira 0.1 ml del caldo de análisis y se coloca sobre la superficie de una caja
bien seca que contenga agar no selectivo. Con ayuda de una asa de Hockey se
extiende sobre la superficie de la caja.
Incubar caldos y cajas de acuerdo al microorganismo en estudio.
• A intervalos de tiempo diferentes, se retira una parte de cada caldo con asa
calibrada, pipeta o micropipeta, si es necesario se diluye y distribuye sobre cajas de
petri que contenga el mismo medio utilizado anteriormente.
• Es posible evaluar resultados mediante observación directa o registrando el
recuento en función del tiempo en una gráfica. Se debe analizar cada lote de
caldo selectivo adquirido por el laboratorio para verificar el número de células
del microorganismo deseado que permite detectar. Para ello se verifica el
desempeño del medio con una mezcla de cultivos deseados e indeseados.
3. Para determinar la capacidad que tiene el caldo de enriquecimiento selectivo de
recuperar pequeñas concentraciones del microorganismo deseado, siembre 1 ml de
cada dilución de dicho microorganismo en 10 ml de ese caldo.
4. Incube en las condiciones normales del método y siembre por estrías sobre la
superficie del Agar no selectivo y selectivo que normalmente se usa en el método.
5. Observar las placas y calcular el número de microorganismos necesarios para activar
el desarrollo en el caldo de enriquecimiento selectivo.
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6. Para determinar la capacidad que tiene el caldo de enriquecimiento selectivo de
recuperar pequeños números del microorganismo deseado a partir de una mezcla de
cepas, transfiera 1 ml de cada una de las diluciones del microorganismo deseado (en
solución salina peptonada) en tubos separados que contengan 10 ml de caldo de
enriquecimiento y 0.02 ml de la dilución 10-1 del pool.
7. Incubar a la temperatura apropiada por 18 a 24 horas y sembrar en estrías sobre
Agar no selectivo y selectivo normal del método, aislar e identificar colonias deseadas
por confirmación bioquímica.
La productividad de un caldo de cultivo selectivo debe permitir el desarrollo de un
cultivo puro de la cepa deseada con un inoculo de 20 células o menos. Al colocar el
microorganismo en placas de Agar selectivo y no selectivo se puede manifestar
cualquier interacción de los medios líquidos con los sólidos.
La selectividad de un caldo de cultivo permite el desarrollo de las cepas deseadas en
los caldos de enriquecimiento que contienen microorganismos competidores (no
deseables) se debe detectar utilizando la máxima dilución que permita el desarrollo
del cultivo puro.

8. Registrar los resultados de la máxima dilución que permita aislar el

microorganismo deseado aparte o en conjunto con los indeseados.

Evaluación de medios sólidos y líquidos:

Seguir la metodología descrita anteriormente. En las tablas 1 y 2 se presentan algunos AGAR MICROORGANISMO TIEMPO MEDIO
EVALUAR DESEADO INTERFERENTE INCUBACION REFERENCIA
ejemplos de medios de cultivo a evaluar con sus respectivos microorganismos
deseados e interferentes. MacConkey Salmonella, E coli B cereus 24 horas. TSA / BHI
EMB E. coli. S. aureus. 24 horas. TSA / BHI
VRBA E. coli. P. vulgaris. 24 horas. TSA / BHI
Estas listas no son excluyentes, esto es, que se pueden emplear otros géneros
Bismuto Sulfito Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI
bacterianos para evaluar la selectividad y productividad de los medios cuando estos lo
permitan. Hektoen Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI
S–S Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI
XLD Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI

Tabla 1. Microorganismos deseados e interferentes para evaluación de medios sólidos por ecometría.

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Consulta

Realice en una tabla similar a la Tabla 1 y 2, que microorganismos utilizaría para

MICROORGANISMO
CALDO evaluar los siguientes medios:
EVALUAR
DESEADO INTERFERENTES • Mac Conkey.
• Mossel.
Selenite cisteína. Salmonella spp E. coli, Citrobacter spp, Klebsiella spp, S. aureus.
• Agar Sangre.
Tetrationate Salmonella spp E. coli, Citrobacter spp, Klebsiella spp. • Agar KF.
Brilla. E. coli. Salmonella spp, Klebsiella spp, E. aerogenes. • Agar ENDO.
• Agar OGY.
LMX Fluorocult. E. coli. Salmonella spp, Klebsiella spp, S. aureus.
• Agar Chromocult para enterobacterias.
Rapaport. Salmonella spp E. coli, Citrobacter spp, Klebsiella spp. • Caldo Giolitti – Cantoni.
Tabla 2. Microorganismos deseados e interferentes para la prueba de productividad y selectividad de medios • Caldo DRCM.
líquidos. • Caldo Chomocult enterococi.

Anexos

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Anexos Anexos

Bibliografía

• Cabeza Herrera E. (2008). Manual práctico de Microbiología de Alimentos,

Universidad de Pamplona. 50-64
• Harrigan, W.F. (1998). Laboratory Methods in Food Microbiology, 3rd Ed. San Diego,
California, USA: Academic Press.
• Mossel, D.A.A., Bonants-Van Laarhoven, T., Ligtemberg-Markus, A.M.Th., et al.
(1983). Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds and
yeasts: an attempt at standardization at the international level. Journal of Applied
Bacteriology, 54, 313-327.
• Mossel, D.A.A., Correy, J.E.L., Struijk, C.B., et al. (1995). Essentials of the
Microbiology of Foods. Chichester, UK: John Wiley. Formando líderes para la construcción
de un nuevo país en paz

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