Biotecnología Microbiana Ambiental

Guia de Problemas “TP n°1 -Diversidad”

1. En el TP de Composición y cuantificación de diversidad en ecosistemas hay 3 grupos de

alumnos. Cada uno sembró 50 L de 3 diluciones de una suspensión obtenida a partir de suelo de
jardín (1g/50 mL sc. fisiológica) en 5 placas de LB, 5 placas de R2A y 5 placas de alguna de las
concentraciones de fenol (un grupo en 0.1, otro en 1 de fenol y otro 10 M de fenol). Los resultados
obtenidos luego de incubar se muestran en la siguiente tabla:

Medio de cultivo dilución Número promedio ufc

(5 placas)
LB 10-2 incontables
-3
LB 10 115
R2A 10-3 incontables
R2A 10-4 210
fenol 10 M Tal cual Sin colonias
fenol 10 M 10-1 Sin colonias
fenol 1 M Tal cual Sin colonias
fenol 1 M 10-1 Sin colonias
fenol 0.1 M Tal cual 110
fenol 0.1 M 10-1 8

a) Calcular el número de unidades formadoras de colonia en el suelo de jardín.

b) ¿Por qué motivo el número de ufc difiere de acuerdo al medio utilizado?
c) ¿ A qué grupo podrían pertenecer las fenolhidroxilasas presentes en el suelo en base a los
valores de Ks? Cómo sería la afinidad por el TCE de las bacterias que tienen estas mPH?

2. Dos suelos, uno proveniente de un campo de uso agrícola y otro de un pastizal cercano, se
analizaron mediante PCR, utilizando distintos primers para los genes correspondientes a enzimas de
baja, media o alta saturación de fenol (Ks) de la subunidad mayor del complejo enzimático mPH. Se
observó que la muestra de suelo agrícola presenta bandas en un gel de agarosa compatibles con la
enzima de alto Ks, mientras que la del pastizal mostró bandas consistentes con media y baja constante
de saturación.
a) ¿Cuantas calles debieron utilizar en un gel de agarosa para realizar el ensayo? ¿Qué se sembró
en cada calle para poder llegar a las conclusiones adecuadas? Dibuje un gel con los resultados.
b) Proponga una explicación frente a dichos resultados. A que podría deberse la presencia de los
fenotipos bacterianos informados en cada suelo propuesto? Tenga en cuenta que la densidad vegetal es
mucho mayor en el suelo de uso agrícola que en el pastizal
 3. Al realizar un aislamiento microbiológico a partir de tierra fértil de un campo se encuentra gran
diversidad de microorganismos en los medios ricos y en las placas de medio selectivo con fenol 0.1 y
10M. Sin embargo, no se observaron UFC en las placas con fenol 1M.
a) ¿Cómo explicaría la ausencia de crecimiento bacteriano en las placas de concentración intermedia
de fenol?
b) Sospecha que hubo un error en alguno de los pasos de aislamiento, ¿Qué errores piensa que podría
haber tenido?
c) Si al realizar la PCR y luego un gel de agarosa, ud encuentra únicamente una banda en la calle de
bajo Ks, ¿cuál sería su conclusión acerca del error cometido en los pasos de aislamiento?

4. Terriglobus roseus es una bacteria perteneciente al phylum Acidobacteria presente en suelo.

Estas bacterias son capaces de producir beta-carotenoides, por lo cual su aislamiento puede resultar de
interés económico pero su lento crecimiento dificulta el proceso. Las acidobacterias se encuentran
presentes en suelos ácidos dónde hay acumulación de CO 2. En un intento de aislar esta bacteria, un
grupo de investigadores recolectó muestras de un suelo virgen y de un suelo agrícola, los cuales
fueron sometidos a diferentes pruebas. Las muestras fueron homogeneizadas en 1 volumen de agua y
luego se dejó decantar la fracción insoluble. Se midió el pH de la solución obtenida encontrándose que
era de 6.5 para el suelo virgen y de 4.3 para el suelo cultivado. El ADN fue extraído a partir de la
mitad de cada solución obtenida, utilizando un kit de extracción de ADN. El resto de la muestra se
utilizó para evaluar el crecimiento de acidobacterias en placas de R2A (diluido 1:50) a distintos pH (2
– 4 – 6) y distinto % de CO 2 en la atmósfera de incubación (2% - 20%). Estas placas fueron incubadas
a 23°C durante 20 días.
a) Justifique la elección de: medio de cultivo; condiciones de incubación (T y %CO 2 en la
atmósfera) y período de incubación. ¿Que esperaría si los investigadores hubieran utilizado un medio
LB en lugar de R2A diluído?
b) Ordene las siguientes condiciones de menor a mayor de acuerdo con el crecimiento de
acidobacterias esperado para:
i) Suelo virgen
ii) Suelo cultivado
1: R2A a pH 2 vs R2A a pH 4 vs R2A a pH 6
2: 2% CO2 vs 20% CO2

c) Se extrajo el ADN de las bacterias crecidas en las placas de R2A a distintos pHs y se realizó una
PCR utilizando primers específicos contra un fragmento de 16S de acidobacterias (150 bp). El ADN
purificado directamente de las muestras de suelo también fue evaluado. Los productos de PCR
fueron luego analizados por electroforesis en gel de agarosa. Esquematice los resultados esperados.

d) A partir del volumen restante de las muestras, se realizaron diluciones seriadas (1:10, 1:100 y
1:100) las cuales fueron plaqueadas en medio R2A a pH 5 y se crecieron en las condiciones
anteriormente mencionadas en atmósfera 2% de CO2. ¿Para cual dilución esperaría encontrar mayor
crecimiento de T. roseus (fácilmente identificable por el color de los betacarotenoides producidos)?
Justifique.
 5. Las bacterias heterotróficas reductoras de sulfato (SRB) y reductoras de hierro (IRB) se
encuentran presentes de manera poco abundante en suelos contaminados con efluentes de la minería
ácida pero su actividad y abundancia podría ser estimulada para biorremediar estos suelos contaminados.
A fin de investigar posibles tratamientos para aumentar la abundancia de las bacterias de interés, un
grupo de investigadores tomó muestras de suelos contaminados en una cuenca minera e incubó alícuotas
equivalentes durante 180 días a 30°C en presencia de:
i. 0,1% cisteína
ii. 0.1% cisteína + 0.1% lactato
iii. Sin agregados

b. Disponiendo de los siguientes medios de cultivo: LB, R2A, Medio de reducción de sulfato,
medio de reducción de hierro; ¿cuál elegiría para evaluar la abundancia y diversidad microbiana pre-y
post-tratamiento? Justifique.
c. En la muestra inicial, los investigadores pudieron determinar la presencia de varias especies
bacterianas de acuerdo con la siguiente tabla. Calcule el índice de Shannon.

Bacteria Número de colonias

Pseudomonas
35
pseudoalcaligenes
Brucella microti 6
Neisseria SY22 1
Motilibacter peucedani 14
WD272 20
Acidobacter capsulatum 11
Chloroflexi KD4 96 9
Clostridium sensu stricto1 2
Bacillus pumilus 2

d. Tras los tratamientos, ¿qué efecto esperaría sobre la abundancia y diversidad microbiana?
e. Para evaluar cambios en la abundancia SRB, los investigadores realizaron una PCR multiplex
usando primers específicos contra el gen dsrB (subunidad B de Sulfito reductasa) de 230 pb y primers
contra una región altamente conservada del gen 16S de 150 pb. Los resultados fueron evaluados por
electroforesis en gel de agarosa. Suponiendo que la incorporación de cisteína fomenta el crecimiento
de este tipo de bacterias, grafique los resultados esperados. ¿Por qué se amplificó también un
fragmento del gen 16S?