1.

Identificación

Método de biorremediación de suelos

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
perturbados por xenobióticos

NO. DE PRÁCTICA: 3 NO. DE SESIONES: 9

NO. DE INTEGRANTES MÁXIMO POR EQUIPO: 3

2. Introducción

Para procesos donde se aplica la biotecnología ambiental, en la recuperación de suelo

agrícola o por la sobreexplotación de actividades antropogénicas y con la intención de
disminuir los efectos negativos de compuestos xenobióticos, que han impactado en el
desequilibrio del medio ambiente, es necesario de analizar la condición inicial
(diagnostico) y final de una técnica de biorremediación de los sitios perturbados. Así
como, la perturbación en el transporte (horizontal) del xenobiótico en un sitio determinado.
La recuperación de un sitio en desequilibrio implica procesos complejos y lentos. Sin
embargo es importante realizar un diagnóstico preliminar para identificar las propiedades
fisicoquímicas y bioquímicas que involucran la recuperación del sitio mediante técnicas
biotecnológicas sustentables.
Ejemplo de ello, son los suelos agrícolas por el uso de plaguicidas. Se inicia por definir
que es el suelo, es un sistema complejo, polifuncional, disperso, abierto, polifacético,
estructurado, dinámico en el tiempo y variable en el espacio (Acevedo, 2000), esto implica
que cuando presenta alteraciones, se torna difícil su recuperación. Es el biomaterial
necesario para vida en el planeta, es el más complejo y tiene dos componentes: a) la
arquitectura abiótica y b) la diversidad biótica (young, 2004).
La remediación de suelos contaminados es una práctica necesaria debido a que las
actividades del hombre han contaminado el sistema edafológico, mediante la adición,
voluntaria o accidental de sustancias xenobióticas como son los plaguicidas (herbicidas,
insecticidas, acaricidas, etc.). A las técnicas biológicas para la remediación de suelos,
también se les conoce como técnicas de biorremediación.

3. Objetivo General
Validar y relacionar un método de biorremediación de suelos a escala laboratorio-
invernadero contaminados por xenobióticos, utilizando herramientas y mecanismos de
recuperación mediante la aplicación de la biotecnología ambiental

4. Objetivos Específicos

1. Determinar los parámetros fisicoquímicos de diagnóstico de suelos contaminados por

xenobióticos antes y después del proceso de biorremediación
2. Relacionar los conceptos de bioquímica y metabolismo aplicados al diagnóstico y
control en procesos de biorremediación
3. Aplicar e integrar conocimientos verticales y horizontales a la biotecnología

5. Reactivos/Insumos, Materiales/Utensilios y Equipos/Instrumentos

a) Reactivos/Insumos
CANTIDA UNIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
D
1 litro Lixiviado de lombriz
1 litro Mezcla de ácidos húmicos
5 kg Vermicomposta
Bolsas negras para vivero de
5 piezas
25*20
4 piezas Plántula de planta de lavanda
1 litro Humato de calcio
1 kg Huminas
10 kg Agrolita
200 g Frijol “moro”
100 mL Agroquímico
b) Materiales/Utensilios
CANTIDA UNIDAD DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
D
4 pza Frascos de 100 mL color ámbar
3 pieza Embudo de filtración rápida de talle
corto
3 pieza Vaso de precipitado de 250 mL
3 pieza Anillos
1 pieza Soporte universal
2 pieza Probeta de 100 mL
1 pieza Probeta de 1 L de plástico
c) Equipos/Instrumentos
CANTIDAD UNIDA DESCRIPCIÓN ESPECIFICACIONES OBS.
D
1 pza Balanza electrónica
2 pza Herramientas para cultivar a
escala pequeña (palas para
jardinería)
pza Guantes
1 pza Overol o ropa exclusiva para el
manejo de agroquímicos

6. Desarrollo de la Actividad Práctica

A) Trabajo en el Invernadero
1. Realizar los cálculos necesarios para realizar la siguiente formulación la cual
tendría que alcanzar para llenar 5 macetas por tratamiento
50 % v/v de suelo salino-sódico y suelo agrícola con antecedentes de aplicación de
agroquímicos cernido, el cual tendrá que estar secado de acuerdo a la norma 021.
Apartar 100 g de muestra para determinación de propiedades FQ y Microbiológicas
25% v/v de vermicomposta cernida y estéril ( 3 días consecutivos de esterilización
durante 20 min a 15 libras de presión)
25% v/v de agrolita

2. Determinación de la capacidad de campo de la mezcla

Pesar 50 g de la muestra del suelo mezclado y colocarla en un embudo que
contenga en la salida un pequeño de tapón como se muestra en la imagen 1.
Medir 50 mL de agua y agregar lentamente sombre el embudo hasta que caiga
una gota del filtrado y anotar el volumen gastado.
3. Determinación de propiedades fisicoquímicas a la mezcla del suelo, porterior al
tratamiento
4. Tratamientos de biorremediación por equipos

Equipo 1.Fitorremediación +bioestimulación

Mezcla: suelo contaminado con agroquímico + vermicompost + planta polinizadora+
riegos con agua a capacidad de campo cada dos días
Equipo 2. Fitorremediación + Bioestimulación
Mezcla: Suelo salino-sódico + vermicompost + frijol forrajero + riegos con ácidos
húmicos al 10% v/v a capacidad de campo cada dos días

Equipo 3. Fitorremediación + Bioestimulación

Mezcla suelo salino-sódico + con vermicompost + planta polinizadora + con riego con
ácidos húmicos al 10% v/v a capacidad de campo cada dos días

Equipo 4. Bioestimulación
Mezcla de suelo contaminado con agroquímico + vermicompost + sin planta + con riego
con mezcla de ácidos húmicos al 10% v/v a capacidad de campo cada dos días

Equipo 5. Biestimulación
Mezcla suelo salino-sódico + vermicompost + sin planta + con riego con mezcla de
ácidos húmicos al 10% v/v a capacidad de campo cada dos días

Equipo 6. Biestimulación
Mezcla suelo con agroquímico + vermicompost +sin planta + con riego con agua a
capacidad de campo cada dos días

5. Los riegos del experimento pueden ser diarios o cada dos día a capacidad de
campo para evitar lixiviación. Depende de las condiciones ambientales
6. Los parámetros fisicoquímicos y microbiológicos del experimento serán al inicio y
después de 3 semanas
7. Medir temperatura y humedad relativa diariamente durante el tiempo del
experimento

Trabajo en el Laboratorio
8. Aislar y purificar bacterias rizosfericas de los tipos de suelo en estudio (salino-
sodio y/o con agroquímico). Ver anexo 1
9. Generar biomasa de las bacterias y/o esporas, cuantificar la densidad de mg/ mL
de biomasa húmeda. Ver anexo 2
10. Realizar pruebas de resistencia y/o tolerancia al xenobiótico en estado solido a
diferentes concentraciones
11. Cinética de consumo y biomasa microbiológica en suelo estéril por lote de 15
días (tiempo 0, 5,10 y 15 días). Ver anexo 3.
12. Extracción y cuantificación del xenobiótico
Secar el suelo tratado al aire libre evitando los rayos del sol de forma directa. En
tubos cónicos de 50 mL con rosca, se colocan 2.5 g de suelo seco y
homogenizado, 5 mL de metanol y se colocan en un baño de sonicación durante
15 minutos en condiciones de oscuridad. Al término del tiempo de agitación, los
tubos se centrifugan 10 min, 7000 rpm a 14 °C; se filtra el sobrenadante y se
colecta en viales de vidrio de 5 mL. El metanol, se evaporó a sequedad a
25°C dentro de una campana de extracción de gases (se colocó piedra
volcánica para regular la evaporación) y el residuo fue re suspendido en 5
mL de acetonitrilo, las muestras se filtraron por una membrana (Millipore-Nylon®)
de 0.45 micras y el líquido filtrado, se recolectó en viales para su análisis
13. Se cuantifica el xenobiótico M-entrada= M-retenida + M-degradada y se aplica la
ecuación del modelo de caja negra para calcular los rendimientos respectivos

7. Cuestionario

1. Enlista tipos de biorremediación mas aplicados

2. Enlista 5 mecanismos de fitorremediación

8. Bibliografía

9. Formato y Especificación del Reporte de Práctica

a) Introducción
b) Objetivo
c) Desarrollo de la actividad práctica
d) Resultados y Discusión
 e) Conclusión
f) Cuestionario
g) Bibliografía
NOTA: Revisar la rúbrica de reporte de practica

10. Anexos.

Imagen 1.

Anexo 1. Aislar y purificar bacterias rizosfericas de los tipos de suelo en

estudio (salino-sodio y/o con agroquímico)
1. Preparar 6 cajas de medio de cultivo para rizobacterias:
Medio de Wrigth adaptado g/L(medir el pH del medio)
Manitol 10
Sulfato de magnesio 0.3
Cloruro de sodio 0.2
Sulfato de calcio 0.1
Cloruro de sodio 0.2
Fosfato de potasio monobásico 0.5
Carbonato de calcio 0.1
Extracto de levadura 0.2
Agar bacteriológico ( o grenetina) 15
solución de rojo Congo 10 mL

2. Preparar tubos con dilución hasta 10-5

3. Pesar 1 g de suelo en estudio y hacer diluciones seriales hasta 10-5
4. Se siembra en superficie las diluciones de 10-4 y 10-5
5. Incubar a 35 ºC durante 72 horas o hasta crecimiento de bacterias
6. Aislar y purificar en el mismo medio las UFC que no absorbieron el
colorante
 7. Resembrar las UFC en medio de Wright con azul de bromotimol: la
coloración azul indica una reacción alcalina presente en organismos de
lento crecimiento, la coloración amarilla indica reacción ácida de
organismos de rápido crecimiento.
8. Seleccionar las colonias describiendo su morfología (bordes, forma,
elevación y textura), realizar tinción de Gram y pruebas presuntivas

Anexo 2. Generar biomasa de las bacterias y/o esporas, cuantificar la densidad

por mg/mL de biomasa húmeda.
1. De las bacterias aisladas y purificadas resembrar en tres cajas que
contengan el siguiente medio de Wrigth modificado. Esta para adaptar a la
bacteria a un medio donde se puede aprovechar un subproducto
agroindustrial como es el lactosuero
Medio de Wrigth adaptado g/L
Lactosa (lactosuero sin proteína, con 10 (250 mL suero lácteo)
estimado del 4 % de lactosa)
Sulfato de magnesio 0.3
Cloruro de sodio 0.2
Sulfato de calcio 0.1
Cloruro de sodio 0.2
Fosfato de potasio monobásico 0.5
Carbonato de calcio 0.1
Extracto de levadura 2.5
Agar bacteriológico ( o grenetina) 15
solución de rojo Congo 10 mL

2. Una vez que la bacteria crezca en este medio realizar la cinética de

consumo y formación de la biomasa de interés
3. Preparar 500 mL del medio de cultivo en estado acuoso y distribuir 50 mL
de esté en reactores de 300 mL adaptados con tapones de algodón
4. Inocular cada reactor con dos asadas de la caja con bacterias purificadas y
dejar dos blancos (reactores con medio sin inocular)
5. Colocar los reactores en la estufa de incubación a 35 ºC y 150 RPM
6. Determinar los parámetros cinéticos de pH y biomasa húmeda en el tiempo:
0,24,48,72 y 96 horas
7. Comparar siempre con el blanco
8. Cuantificar la UFC contenidas en dos asadas por militro en placas para
estimar la cantidad de células inoculadas a cada reactor
9. Para medir la biomasa húmeda en cada tiempo estimado:
 -En condiciones estériles (campana de flujo laminar clase II) medir y pesar
15 mL de la solución del reactor en tubo redondo estéril (de peso exacto
conocido). Llevar a la centrifuga refrigerada por espacio de 5 min a 10000
RPM y 4ºC (realizar 3 repeticiones).
-Decantar el sobrenadante y pesar el tubo con la biomasa adherida a la
pared.
-Al sobrenadante se le toma el pH
-La biomasa adherida se re-suspende con agua estéril y se guarda en
refrigeración
10. Al termino del tiempo estimado centrifugar la biomasa generada en cada
reactor y suspender la biomasa en agua estéril

Anexo 3. Cinética de consumo y biomasa microbiológica en suelo estéril por lote

de 15 días (tiempo 0, 5,10 y 15 días).

1. Esterilizar 300 g de la mezcla de suelo correspondiente: suelo salino o

suelo contaminado +vermicomposta + agrolita. Tres días consecutivos
durante 20 min a 15 libras de presión
2. Verificar que no exista crecimiento de microorganismos en la mezcla.
3. Pesar en condiciones estériles 50 g de la mezcla del suelo a cada reactor
( 9 frascos ) y agregar la cantidad de agua para alcanzar capacidad de
campo de los 50 g de mezcla de suelo. En el agua que se agrega a cada
reactor la biomasa a una razón de con 10 mL de la suspensión de cepas de
bacterias (1x108 UFC mL-1 de células viables).
4. Los reactores se almacenan a temperatura ambiente por 15 días. Al
primer día de incubación (tiempo 0) y a los 5, 10 y 15 días, se les realizó
cuenta total en medio de Wrigth. Al mismo tiempo, se trabajó un blanco
(suelo estéril sin xenobiótico) y un testigo (suelo no estéril, con xenobiótico),
en las mismas condiciones que los microorganismos en estudio.