BASES TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO

I. BASES PARA EL DIAGNÓSTICO EN SANGRE Y OTROS LÍQUIDOS BIOLÓGICOS

 La patología clínica general se enfoca en el desarrollo, aplicación e interpretación de
procedimientos de laboratorio para: establecer un diagnóstico y/o pronóstico,
monitorear el tratamiento y el estado del paciente.

A. VARIABUBILIDAD DE LOS RESULTADOS

1. Variabilidad Biológica
- Muestra debe contar con la siguiente información: alimento, estatus
reproductivo, tratamientos, lugar/tiempo, enfermedades previas, resultado de
laboratorio previo, etc.

a) Inter-individual  diferencias entre grupos de animales por especie,

raza, edad y sexo. Ejemplos:
- Especie: VGA gato > VGA perro
- Raza: akitas con menos VCM  eritrocitos de akitas son más
pequeños que lo de otros caninos.
- Edad: perros en crecimiento tienen menor VGA (volumen globular
aglomerado) y PPT (proteínas plasmáticas totales)
- Sexo: machos tienen mayor concentración de eritrocitos, y por lo
tanto un VGA mayor que hembras.

b) Intra-individual  diferencia en el mismo animal debido a factores

(generalmente ambientales/externas) como la dieta, excitación, estatus
reproductivo, farmacoterapia o el método de extracción de la muestra.
- Resultados “outliers”  cuando se escapan de la lógica médica al
compararse con rangos referenciales. Requieren repetición de muestra y
deben ser minimizados al máximo posible.

- Ejemplos:
- Alimento: aumenta glicemia, lípidos, ácidos biliares en animales
monogástricos. La mayoría de las muestras se toman en ayuno.
- Respuesta adrenérgica (ej. stress): aumenta el VGA en caballos,
aumenta glucosa y linfocitos en gatos. Pueden aparecer coágulos.
- Estatus reproductivo: lactancia disminuye el calcio sérico.
- Farmacoterapia: glucocorticoides aumentan ALP y ALT (enzimas
que determinan la función hepática)
- Lugar de la toma de muestras

2. Variabilidad Analítica
a) Pre-instrumental  Inciden sobre el 80% de los errores.
- Sangre: poca cantidad de muestra, plasma hidrolizado, ictérico o
lipidémico, falla anticoagulante, proporción sangre/anticoagulante
errada, transporte de la muestra y almacenamiento.

 Toma de muestras  Paciente tranquilo y en ayuno, limpieza

de la zona y el sitio de extracción diferente según especie. Usar
jeringas desechables individuales o sistema de vacío. Este
último no sirve ni para todos los animales ni para todas las
 venas. Es útil en animales mayores, pero en menores pueden
colapsar vasos.

 Colores del Plasma  Antes de procesar hay que observar la

muestra para determinar si se acepta o no. Ej. Equinos y
bovinos ricos en carotenos y el suero se ve amarillento. Lo
contrario indica desnutrición.

 Efectos de la hemólisis  Aumenta valores de algunos

compuestos y enzimas por la elevada concentración de
eritrocitos. Interfiere con las determinaciones debido al color o
a interacciones químicas

 Efectos de la lipemia Aumenta o disminuye compuestos

plasmáticos o pericos debido a la presencia de fracciones extra-
lipídicas o turbidez causada por los lípidos. Muchas
determinaciones no se pueden llevar a cabo o no son confiables.

 Almacenamiento o transporte  Algunos compuestos no son

estables en sangre entera. Suero o plasma se deben separar lo
antes posible de las células. La muestra se guarda en tubos
cerrados, refrigerados (congelar suero/plasma a -20 a -70º) y en
oscuridad. Contaminación bacteriana disminuye la estabilidad

b) Instrumenmtal
c) Post-instrumental

B. SANGRE
1. Tubos de toma de muestra

 .
* El tubo amarillo tiene un gel que acelera la coagulación.

2. ¿Suero o Plasma?
- Difieren en que el plasma tiene proteínas (especialmente fibrinógeno)
a) Plasma  sangre + anticoagulante + centrifugación. Separa glóbulos rojos
de plasma y costra flogística (leucocitos y plaquetas).

b) Suero  sangre + coagulación. Es el líquido que rodea al coágulo.

- Ventajas del suero: auto analizadores trabajan mejor con suero
- Desventajas del suero: Separación quita tiempo si no se usa un
activador y tiende a hemolizarse con más facilidad.

3. Anticoagulantes
a) EDTA  Sal sódica, potásica del ácido etilendiaminotetracético.
- Quela Ca sanguíneo.
- Se usa para estudios de morfología celular en la mayoría de las especies.
- Preserva la muestra hasta 24 hrs.
- Muestras con excesos de Ca pueden coagular.

b) Heparina anticoagulante natural

- Interfiere en la conversión de protrombina a trombina
- Se utiliza para la obtención de plasma en química sanguínea y hormonal.
- Preserva la muestra por 8-10 hrs.
- Interfiere en los colores
- No muy utilizado.

c) Citrato de Na (3.8%)
- Se utiliza para la obtención de “plasma citrato” utilizando en pruebas de
coagulación sanguínea anticoagulante
- Preservación por 1 hora
- El plasma que queda da información acerca de as vías de coagulación

d) Dextrosa Citrato
- Se utilizan para preservar por tiempos más prolongados sangre para ser
utilizada en transfusiones sanguíneas.

e) Fluoruro de Na
- Para la obtención de“plasma” utilizado en pruebas de determinación de
la glicemia sanguínea.
- Quela calcio en menor proporción.
- Permite la preservación de la muestra por 1 hora sin variar el resultado
- Evita la coagulación y evita el uso de la glucosa por las células de tubo.

4. Técnicas de Análisis de la Sangre

a) Hemograma
- Cuenta total de células (eritrocitos, leucocitos y plaquetas)
- VGA, Hb (concentración hemoglobina, índice hematimétrico de Wintrobe),
concentración de proteínas, análisis morfológico y diferencial de células.
 - VGA  proporción de eritrocitos en la sangre. Cuando el VGA esta bajo
el rango es anemia y sobre el rango es policitemia.

b) Frotis sanguíneo
- Método del portaobjeto
- Método del cubreobjeto
 Esparcir sangre en una capa fina para observarla al microscopio.
 Permite ver morfología, ver parásitos y hacer recuentos.

c) Método del hemocimétrico (cámara de Neubauer)  permite contar

células en unidades de volumen.
- Pipetas volumétricas: una para glóbulos rojos y otra para glóbulos blancos.
- Diluyentes de leucocitos es un ácido débil, que expone el núcleo de las
células para su conteo. Los eritrocitos se necesitan enteros para visualizarlos.

d) Método de la cianometahemoglobina reactivo de drabkin y ferrocianuro

de K. Mide la hemoglobina en grs. por dt. Tubo con el reactante y luego la
muestra y se obtiene la densidad óptica (ej. 0.23) la cual se multiplica con el
factor del reactante y eso da la concentración de hemoglobina.

e) Método del microhematocrito El hematocrito (= microhematocrito) es un

estudio dentro del hemograma. Se usa sangre con EDTA, se centrifuga por 5
minutos y se obtienen las 3 fases: glóbulos rojos, costra flogística y plasma. Se
pone en una tabla con una escala que mide hasa donde llega lo rojo (ej. en
perros es de un 49% aprox.)

f) Refractómetro mide las proteínas plasmaticas, Pone suero en una

maquina t se ve una escala.

g) Índice ictérico  patrón de dicromato de K. Tubos con diferentes tonos de

amarillo indican diferentes concentraciones de bilirrubina.

h) Fibrinógeno Método del calentamiento a 56ºC

i) Perfil Bioquímico
- Más estandarizados que los hemogramas en todas las especies
- Se solicita para: control sano, apoyo al diagnóstico, evaluar compromiso
sistémico, control tratamiento.
- Metodología paciente en ayuno y tranquilo, toma de muestra con suero
o plasma con heparina. Se debe informar tratamientos previos.
- Elementos interferentes  hiperlipidemia postprandial (muestras
lipidémicas no permiten la realización de pruebas fotométricas), hemólisis
(puede activar factores de coagulación), ictericia, presencia de coágulos.

C. URIANÁLISIS
- Evaluación tracto urinario bajo y renal
- Aproximación diagnostica a patologías metabólicas y a estados de deshidratación
 Refleja muchos metabolismos y entrega mucha información

1. Factores Pre-instrumentales de la Orina

a) Muestra
 - Micción espontánea animal orina y uno va y lo recolecta
- Cateterización sonda
- Cistocentesis percutánea  se saca orina desde la vejiga con jeringa. En
pequeños animales.
b) Contaminación sangre, bacterias, espermatozoides, detergente…etc.
c) Almacenaje si es posible no almacenar por envejecimiento celular y
proliferación bacteriana. Si es necesario, almacenar a 4-8º C por 10-12 hrs.
Para análisis llevar a T º ambiente.

2. Examen físico
- Color amarillo claro, rojo, amarillo oscuro o café, café rojo, etc.
- Aspecto  transparente u opaco. Turbidez es normal en equinos.
- Olor  típico, amonio o cetona.
- Densidad Determina concentración de la orina. Interpretar con estado de
hidratación.
- pH ácido en carnívoros, básico en herbívoros y neutro en omnívoros.

3. Examen Químico
- Proteínas (-)
- Bilirrubina (-)
- Urobilinógeno (normal)
- Glucosa (-)
4. Examen Sedimento
- Leucocitos (-)
- Eritrocitos (- o escasos)
- Piocitos/leucocitos (-)
- Bacterias (-)
- Cuerpos cetónicos (-)
- Sangre oculta (-)
- Nitritos (-)
- Células epiteliales (- o escasos)
- Cristales (-)
- Cilindros (-)
- Células de transision o renales (-)
  En orinas tomadas directamente desde vejiga.
 Cilindros: ostrubita (ataud), oxalato de Ca (sobre de carta), cilindro
leucocitario y cilindro hialino, entre otros.

5. Refractómetro gota de orina y se ve a la luz.

D. EFUSIONES
- Abdominal, pleural, pericárdica, sinovial, cefalorraquídea
 Muestras con y sin EDTA, estéril para cultivo

1. Examen físico  color, aspecto, densidad, coagulación y proteínas.

2. Examen químico proteína, NIS, bilirrubina
3. Examen citológico recuento de células nucleadas, cuenta diferencial en frotis
teñido.

II. DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES VIRALES

 Optimización del diagnóstico rápido, simple, sensible, específico y de bajo costo.
 Identificación de muestras  fecha, especie, edad, sexo, historia clínica,
diagnóstico presuntivo, vacunas aplicadas, diagnóstico solicitado, identificación del
veterinario y del dueño.
 Procesamiento de la Muestra 
- Registro y asignación códigos (confiere confidencialidad si es necesario)
- Preparar imponta y/o cortes en laminillas
· Tejidos, hisopados, heces y líquidos  preparar inóculo para sembrarlo
(para tener partículas virales en suspensión)
· Sangre líquida separar plasma y leucocitos
· Sangre coagulada separar suero.
- Congelación a -20 a 0ºC

A. DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO
- Busca identificar el virus
- Técnicas diagnósticas Clásicas o Moleculares
- Directo en Tejido  por morfología virus (microscopio electrónica), antígenos virus
(pruebas serológicas MC), genoma virus (diagnóstico molecular IP)
- Aislamiento Viral  morfología, antígenos y genoma viral (por PCR). En animales de
laboratorio, huevos embrionados o cultivos celulares
 Los virus en cultivo necesitan células vivas específicas.
 Hay líneas celulares por especies. En condiciones de esterilidad (cámaras de
flujo laminar)

1. Diagnóstico Clásico
- Ventajas simples, detección directa, morfología, microorganismos viables,
virulencia e infectividad
- Desventajas lento, laborioso, tedioso, alta destreza, sólo microorganismos
viables, baja sensibilidad y especificidad.

- Prueba “gold Standard” en virología es el AISLAMIENTO VIRAL  Lograr la

generación de nuevas partículas virales infectantes.
- Generalmente hay un efecto citopático de lisis celular si ocurre, ya esta dando
información acerca del tipo de virus. Le da identidad.
 - Concentración de viriones infectantes en una solución puede titularse por
infección de cultivos celulares con diluciones de suspensión del virus y observación
de la evidencia de la replicación viral.
- Basado en la infecciosidad de un virus surgen pruebas cuantitativas y cuantales.

a) Pruebas Cuantitativas
- Método de la placa
· Monocapa de células confluentes
· Adición del virus diluido y remover luego de la adsorción
· Se cubre con agar (evita la difusión y diseminación)
· Incubación
· El virus es liberado desde las células infectadas
· Se forman placas de lisis (zonas claras)
· Tinción de células para mejorar visualización de placas.
· Recuento diluciones conocidas (1/10, 1/100, 1/1000…etc., hasta
que se pueda contar el número de viriones.

b) Pruebas Cuantales
- Dilución punto final cuantifica dilución viral en el cual una cierta
proporción de animales de laboratorio o huevos embrionados reaccionan y
mueren o bien de cultivos celulares que presentan efecto citopático. El más
deseado es el 50%
- DL50 indica los miligramos de una sustancia necesarios por kilogramo de
peso de un animal para matar al 50% de la población.
- Método de Reed y Muench es un método para determinar la DL50.

2. Diagnóstico Molecular
- Identificación de un agente biológico a través de la detección de una molécula,
una región de una o un grupo de moléculas virales.
- Condiciones molécula blanco ser específica para el agente a detectar y debe
estar presente en todos los aislados del agente biológico.
- Ventajas diagnóstico molecular especificidad (- FP), sensibilidad (-FN) y
simplicidad (de realización e interpretación de los resultados)

a) Metodología Usada en el Diagnóstico Molecular

i. Detección del Patrón Proteico (total)
- Detección patrón proteico específico en número y tamaño.
- Electroforesis separa proteínas según tamaño. Es útil en virus,
porque tienen pocas proteínas y se obtienen patrones sencillos
- Desventajas el patrón debe ser conservado y único para el virus.
Además, se necesita gran cantidad para ser detectable.

ii. Detección Ag (zona proteica)  Métodos inmunológicos

- Basado en la detección de un Ag específico del Ag biológico
 Métodos primarios: sólo reacción Ag-Ac
· Ventajas: Simples, específicos y sensibles
· Desventajas: muchos FP, por lo que necesitan confirmarse.
· Pruebas inmunoquímicas: inmunofluorescencia,
radioinmunoensayo (Ac con isótopo radioactivo)
· Pruebas inmunoenzimáticas: ELISA, RIA, IP, inmunoblot o
Western blot.
 * ELISA la más usada de las inmunoenzimáticas. Su defecto es
la baja especificidad y los muchos falsos positivos. Por eso se
usa como screen, o sea, dentro de miles de muestras. Positivos
se someten a confirmación.

* Western blot es la más específica porque usa 2 criterios de

diagnóstico: unión Ag-Ac y el tamaño de la proteína a la cual se
unió. Primero se hace una electroforesis y luego se agrega el
Ac. Es la técnica de confirmación de ELISA.

ELISA  WESTERN BLOT para confirmar

 Métodos secundarios: Reacción Ag-Ac + reacción secundaria.
· Precipitación
· Aglutinación
· Etc.
 
iii. Detección del genoma completo
- Se basan en la detección de un patrón genómico específico para un
agente determinado
- Se usa en el caso del Rotavirus (segmentado), que cumple con tener
un patrón específico (4232) y estar en gran cantidad en la muestra
porque se libera por las heces.
- No todos cumples las funciones: adenovirus no tiene genoma
segmentado, y por lo tanto, se segmenta artificialmente con enzimas
de restricción. Se elige una enzima específica que genera un patrón
específico. Posteriormente se realiza una electroforesis.

iv. Detección Región del genoma

 Hibridación (Southern blot/Northern blot) basado en la unión de
una sonda al genoma. Método fue desplazado por el PCR.
- No hay problema en genomas segmentados. No segmentados se
cortan.
- En matriz de agarosa se pasa por un campo eléctrico y se agrega
un trozo de ácido nucleico complementario (sonda) a la región que
se busca, la cual tiene un marcador para detectarla.
- Ej. Se busca ACTG, la sonda sería TGAC, si se une, es (+)
- No es simple, es más especifica que métodos inmunológicos y la
sensibilidad comparada con el PCR es baja (no hay amplificación).

 PCR  amplificación de una región del genoma, independiente de

la cantidad de patógeno que hay en la muestra.
- El principio es el mismo: secuencia nucleotídica complementaria a
la región (primer o cebador)
- Separación de la doble hebra por calor, unión partidores y
replicación polimerasa. Detección del la amplificación se hace por
electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida.
- Sirve para virus DNA y RNA a través de un RT-PCR (usa una
transcriptasa inversa)

- 2 criterios diagnósticos presencia de la región y tamaño

específico esperado.
 - VENTAJAS muy sensible, muy específico, muy sencillo y
aplicable en todos los microorganismos y virus. Además es rápido
(diagnóstico en máximo 24 horas) y detecta agentes viables y no
viables.
- DESVENTAJAS  riesgos de falsos positivos por contaminación de
la muestra. Además, es tan alta la sensibilidad de detección que
muchas veces puede detectar infecciones subclínicas.

 PCR a tiempo real muestras en un capilar, pero el mismo

principio. La diferencia radica en la detección del producto
obtenido ya que se adhiere un fluorocromo y los resultados se ven
por fluorescencia y que el equipo mide al final de cada ciclo.
- Se elimina la última etapa de electroforesis
- Permite cuantificar mejor la secuencia blanco.

- VENTAJAS  rápido, más simple, más sensible, mide carga viral.

- DESVENTAJAS 1 criterio diagnóstico (presencia o ausencia)
- Para mejorar eso, se agrega una sonda que se una a la región que
se esta amplificando y esta tiene el elemento fluorescente, por lo
tanto, si hay más región, hay más sonda y más fluorescencia. La
fluorescencia se mide al final de la etapa 2.

B. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
- Busca identificar la respuesta inmune
- Sirven para: · Detectar antígenos de virus en los tejidos y de virus aislado.
· Detectar la respuesta inmune en un animal infectado o vacunado
- En virus es más fácil detectar la respuesta inmune porque estos están un tiempo muy
corto en los tejidos.

1. Pruebas Serológicas con Anticuerpos Marcados

- Ac lleva algo pegado que denota su presencia por visualización microscópica o
directa.
- Según el Ac que este pegado se distinguen pruebas directas (Ac dirigido al Ag)
o indirectas (Ac dirigido al Ac que se une al Ag).

a) Inmunofluorescencia  marcador es fluorcromo

b) Inmunoenzimáticas  el marcador es una enzima.
 Inmunoperoxidasa: en fase sólida. Sólo permite detectar Ag, no Ac.
Se marca con enzimas que actúan sobre sustrato produciendo un
cambio de color del sustrato.

 ELISA: Fase líquida. Se debe

obtener el suero de un animal.

Ej. Muestra se pone en placas o

posillos con Ac. o se pueden pegar
los Ac al fondo de posillos. Se
 agrega suero y el Ac-anti virus y luego un segundo Ac anti-especie
pegado a una enzima.
Si la prueba es (+), el Ac anti-virus se va a unir al antígeno, y el
segundo anticuerpo anti-especie se va a unir al Ac produciéndose un
cambio de color.

2. Pruebas serológicas con Anticuerpos sin Marca

a) Inmunodifusión (o difusión en gel)
- Se produce cuando Ag y Ac difunden en un gel
- Si se produce la unión Ag-Ac, se forma un precipitado visible.
 Difunde el suero del animal y las proteínas virales, se
encuentran y forman complejos que precipitan en
líneas de precipitación.
- Permitió erradicar fiebre aftosa del país, pero en la actualidad se reemplazo por
ELISA que es más sensible.

b) Inhibición de la hemoaglutinación
- Hemoaglutinación  cuando eritrocitos con receptores para virus, se van
aglutinando a través de los virus que actúan como puentes de unión.
- En la prueba serológica, los Ac se unen a los virus impidiendo que estos se unan
a los eritrocitos.
- Ac reconocen al virus, por lo tanto, copan el sitio de reconocimiento que
tenían para unirse a los eritrocitos.
- Diagnóstico de las influenzas (por presencia de hemoaglutininas)
- Para cuantificar la capacidad inhibidora del la hemoaglutinación del suero:
 Dilución de suero se enfrenta a una cantidad fija de unidades
hemoaglutinantes (virus)
 A la mezcla suero-virus se agrega una suspensión de eritrocitos
- Título inhibidor de la hemoaglutinación (HA): recíproco de la mayor dilución
de suero que en presencia de una cantidad conocida de virus aglutinantes,
inhibe la aglutinación de eritrocitos.

Ej. Título inhibidor de la hemoaglutinación = 64  el suero se diluye hasta

64 veces es capaz de inhibir la hemoaglutinación de cierta cantidad de virus.
Animales con título sobre 40 contra influenza están protegidos.

c) Seroneutralización
- Ac neutralizantes impiden que los virus hagan un ciclo replicativo en las
células.
- A dirigido al epitopo de la célula
- Prueba de oro Standard
- Lenta, demorosa (más de una semana) y cara
- Se usa en virus que líticos y persiguen eliminar esa capacidad del virus
- Mejor medida de respuesta vacunal
- Para cuantificar la capacidad neutralizante del suero:
 Dilución del suero se enfrenta a cantidad fija de DICT50
 Mezcla suero-virus se inocula en sustrato vivo.
* Al poner suero poco diluido, no hay lesión, pero a medida que aumentan las
diluciones, aparecen lesiones en la monocapa.
 - Título seroneutralizante dilución de suero que frente a cierta cantidad de
virus es capaz de proteger al 50% de la población expuesta al virus.
- Seroconversión o alza diagnóstica diagnostica infección o enfermedad
reciente. Se mide la respuesta de Ac con 15 días de intervalo. Si tiene un alza
de Ac, es porque se infecto con ese virus, si se mantiene constante no fue ese
virus que lo afecto.

III. DIAGNÓSTICO BACTERIOLOGICO

 Capacidad de un laboratorio para confirmar sospecha de una enfermedad es directamente
proporcional a la calidad de la muestra.
 Responsabilidades del profesional: seleccionar, recolectar, preservar y enviar muestra
adecuadamente, considerar el criterio con que fueron tomadas.

A. SELECCIONAR
1. Diagnóstico directo
a) Muestras
- Muestra debe ser la más probable de contener el agente causal y debe tomarse
evitando la contaminación ambiental.
- Productos alterados por enfermedades: leche, semen, orina, deposiciones,
placenta.
- Productos de biopsia (tejidos) o necropsia (fluidos y tejidos)
- Productos patológicos: secreciones vaginales, prepuciales. Líquido peritoneal y
abscesos. Costras y escaras.
- Orina estéril punción en vejiga para diagnostico de infecciones. Es la mejor
muestra
b) Pruebas
- Microscopía (tinciones)
- Aislamiento (cultivo)
- PCR (genoma) A partir de tejidos, pero comúnmente hay que cultivar (en
salmonella es directa). Es bueno complementarlo con aislamiento.
2. Diagnóstico indirecto
- Mide respuesta inmune Ac en suero sanguíneo o leche
- Se usan bajo dificultad para aislar bacterias y determinar condición en animales
(supuestamente la leptospirosis no se aísla). Cuando se produce la enfermedad es más
fácil.

B. RECOLECTAR
- Muestra representativa del proceso infeccioso: individuo o grupo de animales afectados.
En estos últimos el animal entero como muestra (anatopatológico)
- Es bueno mandar un muerto y uno vivo para comparar las lesiones.
- Extracción aséptica. Hervir al menos 20 minutos el material a usar.
- Volúmenes adecuado: · Sangre para hemocultivo (con anticoagulante): 2-10 ml
· Sangre para suero: 5 ml (anticuerpo)
· Leche: 10-20 ml por cuarto
· Orina: 10-20 ml
- Identificación del animal
 - Utilizar medios de transporte: Stuart, cary blain, amies.
- Demora en llegar al laboratorio: Animal enfermo ideal antes de 6-8 hrs; postmortem no
más de 10 horas.
- Intervenciones previas: vacunación con vacuna viva, siempre en el post tratamiento
(72-96 hrs. después)
- Para control del tratamiento, se toman muestras a los 3-4 días post tratamiento.

C. PRESERVAR
- Frío a 4-6ºC (icepack o hielo)
- Los CULTIVOS NUNCA SE CONGELAN, sólo se refrigeran
- Suero sanguíneo se congela separado del coagulo, porque la sangre completa se
hemolisa congelada.
- Toxinas intestinales (enterotoxemia) con 1 gota de cloroformo por ml.
- Tejidos se conservan con GLICINA + AGUA HERVIDA(parte iguales). NO CON FORMALINA

D. CONSIDERAR EL CRITERIO CON QUE FUERON TOMADAS

- Conocer una situación infecciosa
- Confirmación diagnóstica
- Aplicación tratamiento adecuado (ej. antimicrobianos)
- Control del tratamiento (ej. Infección urinaria)
- Resultados deben ser confiables, oportunos y con conocimiento adecuado.
- Antibiogramas o salmonellas jamás con diagnósticos antes de 24 horas.
- Salmonella en 48 horas puede ser positiva, pero tarda mucho en ser negativa.
- Mayoría de los agentes con resultados por diagnóstico directo en mínimo 48 horas.

Siembra incubacióncrecimientopruebasidentificación antibiogramacapa conservada

E. DIAGNÓSTICO BACTRIOLÓGICO
- Procedimientos y técnicas usadas para establecer la etiología de un infeccioso
mediante su aislamiento en laboratorio o su detección a partir de la muestra
patológica.
a) Tinción
o Gram u otra. Gram (+) es azul y Gram (-) rojo.
o OH y Ziehl-Neelsen pueden ser diagnósticas
b) Aislamiento
- Desarrollo en medio de cultivos artificiales (tiempo de generación de 29 horas a
30 días). La efectividad depende de la calidad de la muestra.
- Medios de cultivo:
 básicos (bacterias no exigentes)
 mejorados (todas las bacterias)
 selectivos (desarrollo de cierta bacteria y no otras en muestras contaminadas o de
flora normal)
 - Muestra líquida o sólida dependerá del procedimiento en laboratorio.
- Muestra sólidamaceradolicuado aislamiento por diseminación.
c) Incubación
- Incubación de las placas a 37º C por lo menos por 24 horas
- Por técnica tradicional Salmonella no puede ser diagnosticada (+) antes de 72
horas (48 hrs. Si la carga es MUY alta)
d) Colonias
- Caracterizar para encontrar el tipo de bacteria.
- Cuando hay pocas bacterias la muestra se da (-) por poca sensibilidad.
- Para mejorar la sensibilidad se pueden usar perlas inmunomagnéticas + Ac contra
bacterias pegadas, pero nos exige saber que bacteria estamos buscando (por los Ac).
Se pone un imán para atrae a las perlas con Ac y bacterias para concentrarlas y
mejorar la sensibilidad del método tradicional.
e) Identificación / Diagnóstico
- A través de la fisiología y el metabolismo
- Tradicionalmente taxonomía de las bacterias a partir de esos 2 parámetros, por
propiedades bioquímicas (ej. Catalasas)  24 horas
- Caracterización genes específicos por PCR directamente sobre la muestra o
colonia, saltándose las propiedades bioquímicas.

- Detección de genes específicos (hibridación sondas) sólo en colonias para

buscar una bacteria puntual. Se le agrega una sonda y se une por homología al ADN
y se expresa por puntos negros. Especificidad depende da la zona génica a
determinar

- PCR vs. Hibridación  PCR con sensibilidad de 0.9-1.2 x 10² UFC y 10^6 -10^9
UFC para sonda. (PCR > sensible que sonda)
- Hay caldos que diluyen los inhibidores de la muestra. Además, se debe mejorar la
extracción del ADN de la muestra eliminando detritus celulares, las proteínas y
polisacáridos.
- PCR vs. Cultivo  más sensible (75% vs. 25%) en las 48 hrs. post-infección y 91.6%
vs. 75% a los 7 días de la infección.

- Detección por antígenos específicos (muestra) Ac conjugados fluorescentes, se

necesita un operador experto, alta sensibilidad en formas agudas, pero un 40% de
sensibilidad en cuadros subagudos o crónicos.

- ELISA directo Ac + muestras +/- conjugado = sustrato color (suero +)

- ELISA indirecto al revés, pero lo mismo.

- Aglutinación  suero +Ag. no es buena porque da muchos FP y FN

- Identificación taxonómica genes y especies, serotipos o serovares, biotipos,

fagotito…etc. Costosos, lento, baja sensibilidad y disponibilidad.
 - Diagnóstico indirecto patología x bacterias fastidinas o de lento crecimiento
- Basado en la deteccion de Ac específicos
- Rápido, económico, necesita confirmación
- Fenómeno de prozona (exceso de Ac, poco Ag), falsos (-) y sensibilidad
técnica.
- En inmunodeprimidos (-) porque no hay Ac suficientes, pero no indica
que no hay interaccion.

- Precipitación (inmunodifusión) en el centro Ag y en la periferia suero. Línea

de precipitación denota positividad. FN por pocos Ac y FP por antigenicidad
cruzada.
- CIEF precipitación apurada con electricidad
- IFI técnica igual a la anterior, pero detecta Ac.
-
f) Interpretación de Resultados
- Diagnóstico Directo:
- Gram:
· No se ven bacterias no se tiñen, malas muestras o baja carga
bacteriana.
· Levaduras hifas
· Abundantes/escasos bacterias
· Presencia abundante de leucocitos (compromiso inflamatorio,
infección, proceso patológico)
- Cultivo:
· Desarrollo polimicrobiano
· Gram con bacterias, cultivo (-) tratamiento previo con
antibióticos o cultivo incorrecto
· Gram sin bacteria y cultivos (+)
· Desarrollo bacteriano de Proteus spp asociado a contaminación
· Manejo flora bacteriana normal

- Urocultivo
· Catéter perro: > 1000 UFC/ml en machos y > 100.000 UFC/ml
hembras.
· Catéter gato: >1000 UFC/ml machos y hembras.
· Eso es lo normal, pero si es por sonda, es más bajo el nivel.
- Serología 1/200 título pero debe informarse en (+)
· Reactividad cruzada
· Muestra sospechosa, repetir 30 días después (riesgo de rx. Cruzada)
· Cultivo (+) y serología (-)
· Cultivo (-) y serología (+)
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