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50 ARTÍCULO PRODUCTO DE LA INVESTIGACIÓN

NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA - ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 6 JUNIO - DICIEMBRE DE 2006:1-114

Aislamiento e identificación de
diez cepas bacterianas desnitrificantes a partir de un suelo
agrícola contaminado con abonos nitrogenados
proveniente de una finca productora de cebolla en la
Laguna de Tota, Boyacá, Colombia
Joaquín L. Benavides López de Mesa1, Gladys M. Quintero1,
Olga Lucía Ostos Ortiz2

1
Universidad de La Salle, 2Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

Correspondencia: jbenavides@lasalle.edu.co

Recibido: 13-10-06 / Aceptado: 17-11-06

Resumen
Este articulo presenta los resultados de la versatilidad adaptativa y tolerancia de una consorcio bacteriano
constituido por 10 cepas bacterianas endémicas de un suelo agrícola contaminado, proveniente de una finca
productora de cebolla ubicada en la laguna de Tota en Aquitania, Boyacá, Colombia, expuesto al uso incontro-
lado de fertilizantes nitrogenados. La consorcio bacteriano aislado del suelo está conformado por: Bacillus
megaterium, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp, Propionibacterium sp,
Peptoestreptococcus sp, Sthaphylococcus coagulasa negativa, Corynebacterium sp, Clostridium sp y
Actinomyces sp. Se demostró que los microorganismos aislados tienen capacidad desnitrificante in vitro,
transformando el nitrato a nitrógeno molecular. La consorcio bacteriano aislado se constituye en una alterna-
tiva de biorremediación para recuperar suelo agrícola contaminado con exceso de fertilizantes nitrogenados.
Palabras Claves: agentes fertilizantes, amonio, biorremediación, desnitrificación, nitratos, urea.

Abstract
This article presents the results of the adaptative versatility and tolerance of a bacterial consortium made
up of 10 bacterial stocks endemic to a contaminated soil coming from an onion farm located near Laguna de
Tota, Aquitania, Boyacá, Colombia. This soil has been exposed to the uncontrolled use of nitrogen rich fertilizers.
The bacterial consortium from the soil is made up of Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis,
Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp, Propionibacterium sp, Peptoestreptococcus sp, coagulasa
negative sthaphylococci, Corynebacterium sp, Clostridium sp, and Actinomyces sp. It was demonstrated
that the isolated microorganisms have in vitro denitrifying capabilities, thus transforming nitrates to molecular
nitrogen. The isolated bacterial association constitutes a bioremediation alternative to recover the soil that has
been contaminated by the excess of nitrogen rich fertilizers.
Key words: ammonium, biodegradation, denitrification, fertility agents, nitrates, urea.

o amonio previamente reducido convirtiéndolo en sus- tancias gaseosas como N2O. las rimentales) y un control. contribuyendo en el crecimiento. Las muestras fueron empacadas en 14 sacos puede realizarse mediante la aplicación y/o (40 kilos). Enterobacterias. El proceso de desnitrificación ocurre cuales 6m2 se emplearon para la disposición del suelo. la flora y a partir de un suelo proveniente de una finca productora fauna autóctona (1). de los acuáticos y terrestres. Para la recolección del suelo se toria. cual se tomaron muestras compuestas utilizando un miento y calidad de las cosechas (2). Aquitania (Boyacá). con cicloheximida (50 mg/ml) para inhibir el . constituyen una nado por exceso de fertilizantes (nitratos y amonio). consorcios bacterianos desnitrificantes tiéndose en una amenaza para la agricultura. complejo que ocasiona un impacto ambiental negativo. El objetivo del estudio. importante alternativa de solución a la salinización de suelos. por 20 cm de profundidad. ya que permiten eliminar o inmovilizar contami. cada surco de 52 cm de ancho. convir. 20 cm. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE DIEZ CEPAS BACTERIANAS DESNITRIFICANTES A PARTIR DE UN SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO: 50-54 51 Introducción minerales a fin de no seleccionar organismos La salinización de suelos es un problema universal y fermentativos. cada que cambian el aceptor de electrones como el oxigeno unidad experimental poseía tres réplicas. y se homogenizaron en 225 ml agua peptonada fermentable como donador de electrones y sales (0. los cuales son Montaje ex situ emitidos a la atmósfera (3). transformándolos o degradándolos a sustan- cias menos peligrosas o inocuas.85%). Dichas técnicas utili.30 cm de largo. El aislamiento de estos microorganismos se realizó Homogenizado de suelo en un medio de cultivo al que se le añadió nitrato potásico De cada muestra de suelo secado y tamizado se pesaron como aceptor de electrones. urea). de cebolla cerca a la laguna de Tota (Boyacá) contami- Las técnicas de biorremediación. Se en muchas especies de Eubacterias y en unas pocas realizó el montaje de 3 surcos problema (unidades expe- Arqueobacterias. nación del suelo problema. delimitó un área aproximada de 1500 m2 dentro de la micas del suelo. fue aislar e identificar me- el cual se ha incrementado con el pasar de los años como diante el uso de medios selectivos y pruebas bioquímicas consecuencia del uso indiscriminado de abonos. Toma de muestra de suelo zan microorganismos con capacidad para utilizar los La muestra de suelo fue traída de la finca Siempre contaminantes como fuente de energía o como aceptores Viva la cual se encuentra ubicada en el municipio de y donadores de electrones dentro de la cadena respira. mejorando así. rendi. cial del suelo a una profundidad de 5 cm (4). NO y N2 . convencionales. el montaje con- por óxidos de nitrógeno bajo condiciones anóxicas. la biorremediación de suelos conta. debido a por 1. diversas y están distribuidas ampliamente en ecosistemas donde se utilizó un área total de terreno de 14m2. que utilizan formas de nitrógeno inorgánico traciones de nitratos. La selección de la muestra se basó en análi- bioaumentación de microorganismos desnitrificantes sis físico-químicos previos confirmando altas concen- autóctonos. la calidad y condiciones físico-quí. Se removió la capa su- De esta forma. suelos aledaños y acuíferos. muestreo aleatorio en zig-zag. perficial presente y se excavó hasta una profundidad de minados por fertilizantes nitrogenados (gallinaza. son anaerobios facultativos. Materiales y métodos nantes. La muestra fue trasladada a un invernadero construi- Las bacterias desnitrificantes son filogenéticamente do en la Sede La Floresta de la Universidad de La Salle. una fuente de carbono no 25 g. Otros tó con un sistema de impermeabilización para la recolec- estudios han demostrado que las bacterias desnitrificantes ción y manejo de lixiviados con el fin de evitar la contami- y fijadoras de nitrógeno se encuentran en la capa superfi. Las Proteobacterias.

6x104. por medio de la tinción de Gram y coloraciones especiales para cápsula.1 ml a pla. Conteo preliminar de células viables esporas e inclusiones citoplasmáticas. los microorganismos aislados e identificados mediante nias. Microorganismos aislados e identificados mediante pruebas los protocolos convencionales de identificación: teniendo bioquímicas. Los microorganismos aislados se determinaron según Tabla 1. el recuento promedio en el surco con- mineral mínimo fundido y mantenido a 450 C.4 No. se mantuvieron en agitación a 120 rpm. características micro y macroscópicas de las colonias tración inicial de bacterias viables heterótrofas y aisladas se procedió a la aplicación de los protocolos desnitrificantes de cada uno de los surcos mediante la convencionales y pruebas bioquímicas especiales para técnica de recuento por vertido en placa.DICIEMBRE DE 2006:1-114 crecimiento fúngico. la morfología microscópica. Una vez se observó crecimiento a partir de los A partir del homogenizado se prepararon diluciones aislamientos positivos se procedió a realizar caracteri- seriadas en base 10 en medio líquido mineral. de cada dilución se inoculó.3 x 104UFC/g. se realizó el cálculo teniendo en cuenta el título de la dilución y la cantidad de inóculo utilizado. por triplicado. Una vez trol fue de 2. solidificados los medios se llevaron a incubar a 370 C Identificación bioquímica. Luego se agregaron 20 ml de medio agar fue de 6.52 NOVA . zación macro y microscópica de las colonias aisladas. Para cuantificar las colonias se seleccionaron las pruebas bioquímicas. 6 JUNIO .3x 104. en cuenta las características macroscópicas de las por 30 minutos a temperatura ambiente (20° C). la identificación de bacterias provenientes de suelo. ración de la muestra de suelo por homogenización y se- cado. Aislamiento e identificación de consorcios denitrificantes bacterianos nativos A partir del crecimiento obtenido en las placas de recuento de desnitrificantes y heterótrofos se realizó el aislamiento de los consorcios bacterianos nativos me- diante resiembra en medio de sales minerales. 0. previa prepa. El recuento promedio de UFC/g de suelo post-tratamiento cas de petri. para obtener crecimiento de colo. Según las A partir del homogenizado se determinó la concen. Los resulta- dos se expresan en UFC/g de suelo.PUBLICACIÓN CIENTÍFICA . según protocolo. Resultados Recuento Inicial de células viables:1.ISSN:1794-2470 VOL. Recuento de desnitrificantes de suelo. (100 a 10-7). En la Tabla 1 se presentan durante 48-96 horas. diluciones que presentaron crecimiento entre 30 y 300 UFC. . Los cul- tivos se manipularon en iguales condiciones de creci- miento a las descritas para los recuentos bacterianos y se realizaron las resiembras necesarias en medio sólido hasta obtener cepas puras. colonias. Las cepas puras componen- tes de los consorcios nativos se resembraron en medios de cultivo de aislamiento primario básicos y con el fin de obtener el crecimiento suficiente para su completa iden- tificación y para mantenerlas viables.

Análisis estadístico para nitratos post-tratamiento con el consorcio bacteriano aislado. Bacillaceae. sus numerosas especies suelen ser mesófilas. especie ha sido reportada frecuentemente como una disminución significativa de nitratos en las Unida. figura 1. des experimentales (p£ 0. Pseudomonas sp. Corynebacterium. en la suelos y agua. con especies anaerobias por lo que se sugiere en futuros ensayos probar diferen. haciendo parte del bacteriano aislado llevó a cabo el proceso de consorcio nativo. comúnmente encontradas en tes asociaciones bacterianas y diferentes concentracio. aerobias o anaerobias facultativas. utilizados con frecuencia para degra- observaron diferencias significativas entre las unidades dación de derivados de petróleo (10). agua y polvo ambiental. experimentales y el control. suelo también han sido informados como potentes nes de las mismas. 6. En cuanto al análisis de los nitratos se biorremediadores. para que colectivamente desnitrifiquen el suelo. desnitrificante del suelo (9). También se aislaron diferentes microorganismos de pués de introducir el consorcio bacteriano. Adicionalmente al estar en grupo las diferentes especies bacterianas pueden tolerar los cambios físico-químicos que se den en el ambiente durante el proceso de biorremediación (3. pertenecientes a la familia concentración bacteriana óptima para la desnitrificación. alimen- La actividad desnitrificante (AD) del consorcio tos preparados para bebes. bién en los extremos de acidez y alcalinidad con pH lo problema estuvo compuesto por: Bacillus megaterium. especies de Staphylococcus coagulasa desnitrificación de una manera efectiva. Clostridium sp.5. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE DIEZ CEPAS BACTERIANAS DESNITRIFICANTES A PARTIR DE UN SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO: 50-54 53 Numerosos estudios han reportado microorganismos como potentes desnitrificantes en suelo (3. y ha sido recuperada de humus. algu- Discusión nas de sus especies termófilas pueden desarrollarse tam- El consorcio bacteriano identificado a partir del sue. pecies de Bacillus son de amplia distribución. negativa. aguas estancadas. 8). Sin embargo.6). fue demostrada mediante análisis méticos para los ojos. ha coagulasa negativa. Las diferentes es- Acinetobacter sp. Esta fisicoquímicos observando mediante espectrofotometría. facultativos ó estrictas. sido informado como desnitrificantes fuertes y rápidos. por lo que pueden recuperarse a partir de Bacillus licheniformis. En la presente investigación se aisló Pseudomonas stutzeri. Peptoestreptococcus. la familia Bacillaceae. En este trabajo se realizó la biorremediación con un consorcio nativo de bacterias desnitrificantes. equipos hospitalarios. cos- bacteriano. El recuento promedio de UFC/g de suelo post-trata.6x104. y diversos materiales clínicos. entre 2-10. estiércol. paja.05) en relación al control des. las cuales están ampliamente distribuidas en . el Clostridium. El género Bacillus. 7. ya que convierten los nitratos a nitritos en 24 horas como miento fue de 6. es el caso de la especie Bacillus licheniformis (8). habitan Actinomyces. Sthaphylococcus suelos. lo que permite combinar y complementar las funciones metabólicas de diferentes microorganismos. la cual se encuentra ampliamente distribuida Figura 1. una variedad de nichos ecológicos. Propionibacterium. Utilizando todo el consorcio no se pudo determinar una Otro de los géneros. aguas servidas. mostrando que el consorcio En este trabajo se encontraron.3x 104 y en el surco control fue de 2. no existen reportes de trabajos utilizando consorcios bacterianos.

E.PUBLICACIÓN CIENTÍFICA . suelos contaminados (13).534p. sus diferentes especies han sido repor. 2. Caballero. Develoment of PCR primer system amplification of nitrite reductase genes (NirK and nirS) to detect denitrifyng bacteria in environmental samples. de crecimien. Scow. 1999.Mc. Eweis J. De Vos P.4 No. 5. Gram positivos. Naohiro N. Aerobic Denitrifyng Bacteria That Produce Low Levels of Nitrous to típico en placas de agar. microorganismos difíciles de recuperar por cultivo en 9. A halophilic denitrifier. Harting. J. Braker W. sido reportado como especie capaz de desnitrificar de 4. 13. . anaerobios la financiación de la investigación. 5 th ed Buenos Aires. 2003. formadores de gránulos 29: 9 -14. Applied and Environmental cadas por PCR no fueron aisladas en nuestro estudio.. Rösh C. Applied and Enviromental Microbiology en la literatura como microorganismo desnitrificante (12). de cre. Cromack J. Shoun H. Kinetics of nirS expression este estudio haciendo parte del consorcio nativo.. Sakaguchi Y. 131-147. cilos aerobios..2006.como aceptor de electrones. D. los cuales propietario de la Finca Siempre Viva. K. Isolation and characterization of aerobic denitrifiers from agricultural soil. Rich J. 2001.69(6): 3152-57. Zumft. en diferentes tipos de suelo y agua ha Environmental Microbiology.edu. bacilos filamentosos y and nitrite-responsive regulatory system. Morton.3818-29. que son bacilos Gram positivos. que también ha sido reportado Oxide. (6. otro de los microorganismos encontrados during the transition from aerobic respiration to denitrification: evidence for a denitrification-specific nitrate- fue el género Actinomyces. p. de la Salle por su apoyo incondicional. Akira H. Referencias Otro género encontrado fue Corynebacterium. 181:161–166. Bernard M..69(10): 5974-82.69(6):3152-3157. distribuidos en el medio ambiente. and metacromáticos. Witzel K.co Appl and Environ Microbiol. Bottomley J. Schroeder. Tratamientos para la descontaminación y regeneración de suelos y aguas tadas con frecuencia aisladas de diferentes tipos de suelo subterráneas mediante procesos biológicos y fisicoquímicos. al Sr. Mergel A. Akif M. Çelen E. a la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca por bacterium. 3769-75. Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil.unicolmayor. R. and W.11). Applied and medio ambiente. y al Dr. Aerobic Denitrifying Bacteria That Produce Low Levels of Nitrous Oxide . 3. J. Sakairi C.Graw-Hill. Bacteriol 2002. 11. 2002. Sawer C. cimiento lento en medios convencionales. El Acinetobacter un bacilo Gram negativo. E. Chemestry For Enviromental Engineering. frecuentemente aislados de suelos. Chang. 2003.ISSN:1794-2470 VOL. Turk Journal Biology 2003. 6. Ricardo también utilizan el NO3. Dayne W. Naoki T. Appl and manera lenta y débil (12). ramificados. Denariaz G. Zhemin Debido a que algunas especies comúnmente identifi. Vanparys B. Guillermo López. Kim H. 12. Montealegre Coordinador de Laboratorios Universidad de Peptostreptococcus. R. Koneman EW. Bacillus identificados y haciendo parte de la población nativa de halophilic denitrifier sp. cocos Gram positivos. 6 JUNIO . (cytochrome cd1 nitrite reductase) in Pseudomonas stutzeri Finalmente. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas placa o en medio líquido que aparecen en la literatura color.Bacteriol. Wittebolle L. 7. Gram variables. pleomorficos. Applied an Enviromental Microbiology. 1.. Gall J. distribuido ampliamente en el Composition and Functioning of Denitrifying Bacteria from Adjacent Meadow and Forest Soils. Cultivation of Denitrifying Bacteria: Optimization of biología molecular para la identificación de isolation Conditions and Diversity Study.54 NOVA . 2004. 1998.72(4)2637-2643. se recomienda en futuros estudios utilizar técnicas de 8. Feseldt A. 1978. 1989:39:145-151. no McGraw Hill. Sachiko Y. España.DICIEMBRE DE 2006:1-114 diferentes nichos ecológicos y se caracterizan por su gran Agradecimientos capacidad de tolerancia al medio ambiente (8). Verstraete W. G. Community fermentador de glucosa. facultativos. Boon N. Principios de Biorecuperación.Heichen P. también fue identificado en Environmental Microbiol. Satoshi T. www. Kato I. no hemolíticos. Microbiology.Syst. ba. Los autores agradecen a la Universidad de la Salle y También se encontraron especies de: Propioni. Bothe H. Z. Yubei H.