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50 ARTÍCULO PRODUCTO DE LA INVESTIGACIÓN

NOVA - PUBLICACIÓN CIENTÍFICA - ISSN:1794-2470 VOL.4 No. 6 JUNIO - DICIEMBRE DE 2006:1-114

Aislamiento e identificación de
diez cepas bacterianas desnitrificantes a partir de un suelo
agrícola contaminado con abonos nitrogenados
proveniente de una finca productora de cebolla en la
Laguna de Tota, Boyacá, Colombia
Joaquín L. Benavides López de Mesa1, Gladys M. Quintero1,
Olga Lucía Ostos Ortiz2

1
Universidad de La Salle, 2Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

Correspondencia: jbenavides@lasalle.edu.co

Recibido: 13-10-06 / Aceptado: 17-11-06

Resumen
Este articulo presenta los resultados de la versatilidad adaptativa y tolerancia de una consorcio bacteriano
constituido por 10 cepas bacterianas endémicas de un suelo agrícola contaminado, proveniente de una finca
productora de cebolla ubicada en la laguna de Tota en Aquitania, Boyacá, Colombia, expuesto al uso incontro-
lado de fertilizantes nitrogenados. La consorcio bacteriano aislado del suelo está conformado por: Bacillus
megaterium, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp, Propionibacterium sp,
Peptoestreptococcus sp, Sthaphylococcus coagulasa negativa, Corynebacterium sp, Clostridium sp y
Actinomyces sp. Se demostró que los microorganismos aislados tienen capacidad desnitrificante in vitro,
transformando el nitrato a nitrógeno molecular. La consorcio bacteriano aislado se constituye en una alterna-
tiva de biorremediación para recuperar suelo agrícola contaminado con exceso de fertilizantes nitrogenados.
Palabras Claves: agentes fertilizantes, amonio, biorremediación, desnitrificación, nitratos, urea.

Abstract
This article presents the results of the adaptative versatility and tolerance of a bacterial consortium made
up of 10 bacterial stocks endemic to a contaminated soil coming from an onion farm located near Laguna de
Tota, Aquitania, Boyacá, Colombia. This soil has been exposed to the uncontrolled use of nitrogen rich fertilizers.
The bacterial consortium from the soil is made up of Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis,
Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp, Propionibacterium sp, Peptoestreptococcus sp, coagulasa
negative sthaphylococci, Corynebacterium sp, Clostridium sp, and Actinomyces sp. It was demonstrated
that the isolated microorganisms have in vitro denitrifying capabilities, thus transforming nitrates to molecular
nitrogen. The isolated bacterial association constitutes a bioremediation alternative to recover the soil that has
been contaminated by the excess of nitrogen rich fertilizers.
Key words: ammonium, biodegradation, denitrification, fertility agents, nitrates, urea.

30 cm de largo. las rimentales) y un control. suelos aledaños y acuíferos. nación del suelo problema. de los acuáticos y terrestres. transformándolos o degradándolos a sustan- cias menos peligrosas o inocuas. cada que cambian el aceptor de electrones como el oxigeno unidad experimental poseía tres réplicas. los cuales son Montaje ex situ emitidos a la atmósfera (3). 20 cm. El proceso de desnitrificación ocurre cuales 6m2 se emplearon para la disposición del suelo. El objetivo del estudio. Toma de muestra de suelo zan microorganismos con capacidad para utilizar los La muestra de suelo fue traída de la finca Siempre contaminantes como fuente de energía o como aceptores Viva la cual se encuentra ubicada en el municipio de y donadores de electrones dentro de la cadena respira. y se homogenizaron en 225 ml agua peptonada fermentable como donador de electrones y sales (0. muestreo aleatorio en zig-zag. la flora y a partir de un suelo proveniente de una finca productora fauna autóctona (1). Aquitania (Boyacá). Materiales y métodos nantes. Se en muchas especies de Eubacterias y en unas pocas realizó el montaje de 3 surcos problema (unidades expe- Arqueobacterias. Otros tó con un sistema de impermeabilización para la recolec- estudios han demostrado que las bacterias desnitrificantes ción y manejo de lixiviados con el fin de evitar la contami- y fijadoras de nitrógeno se encuentran en la capa superfi. consorcios bacterianos desnitrificantes tiéndose en una amenaza para la agricultura. por 20 cm de profundidad.85%). fue aislar e identificar me- el cual se ha incrementado con el pasar de los años como diante el uso de medios selectivos y pruebas bioquímicas consecuencia del uso indiscriminado de abonos. delimitó un área aproximada de 1500 m2 dentro de la micas del suelo. convencionales. La muestra fue trasladada a un invernadero construi- Las bacterias desnitrificantes son filogenéticamente do en la Sede La Floresta de la Universidad de La Salle. con cicloheximida (50 mg/ml) para inhibir el . contribuyendo en el crecimiento. una fuente de carbono no 25 g. cual se tomaron muestras compuestas utilizando un miento y calidad de las cosechas (2). Se removió la capa su- De esta forma. o amonio previamente reducido convirtiéndolo en sus- tancias gaseosas como N2O. cada surco de 52 cm de ancho. ya que permiten eliminar o inmovilizar contami. urea). El aislamiento de estos microorganismos se realizó Homogenizado de suelo en un medio de cultivo al que se le añadió nitrato potásico De cada muestra de suelo secado y tamizado se pesaron como aceptor de electrones. diversas y están distribuidas ampliamente en ecosistemas donde se utilizó un área total de terreno de 14m2. Las muestras fueron empacadas en 14 sacos puede realizarse mediante la aplicación y/o (40 kilos). debido a por 1. convir. la biorremediación de suelos conta. Para la recolección del suelo se toria. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE DIEZ CEPAS BACTERIANAS DESNITRIFICANTES A PARTIR DE UN SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO: 50-54 51 Introducción minerales a fin de no seleccionar organismos La salinización de suelos es un problema universal y fermentativos. constituyen una nado por exceso de fertilizantes (nitratos y amonio). Las Proteobacterias. de cebolla cerca a la laguna de Tota (Boyacá) contami- Las técnicas de biorremediación. son anaerobios facultativos. la calidad y condiciones físico-quí. mejorando así. La selección de la muestra se basó en análi- bioaumentación de microorganismos desnitrificantes sis físico-químicos previos confirmando altas concen- autóctonos. perficial presente y se excavó hasta una profundidad de minados por fertilizantes nitrogenados (gallinaza. NO y N2 . cial del suelo a una profundidad de 5 cm (4). importante alternativa de solución a la salinización de suelos. Enterobacterias. Dichas técnicas utili. el montaje con- por óxidos de nitrógeno bajo condiciones anóxicas. rendi. que utilizan formas de nitrógeno inorgánico traciones de nitratos. complejo que ocasiona un impacto ambiental negativo.

Recuento de desnitrificantes de suelo. Aislamiento e identificación de consorcios denitrificantes bacterianos nativos A partir del crecimiento obtenido en las placas de recuento de desnitrificantes y heterótrofos se realizó el aislamiento de los consorcios bacterianos nativos me- diante resiembra en medio de sales minerales. Según las A partir del homogenizado se determinó la concen. El recuento promedio de UFC/g de suelo post-tratamiento cas de petri.3x 104.4 No.52 NOVA . se realizó el cálculo teniendo en cuenta el título de la dilución y la cantidad de inóculo utilizado. Una vez trol fue de 2.3 x 104UFC/g. Una vez se observó crecimiento a partir de los A partir del homogenizado se prepararon diluciones aislamientos positivos se procedió a realizar caracteri- seriadas en base 10 en medio líquido mineral. Los microorganismos aislados se determinaron según Tabla 1. Resultados Recuento Inicial de células viables:1. Luego se agregaron 20 ml de medio agar fue de 6. por triplicado. en cuenta las características macroscópicas de las por 30 minutos a temperatura ambiente (20° C).ISSN:1794-2470 VOL. previa prepa. la morfología microscópica. ración de la muestra de suelo por homogenización y se- cado. los microorganismos aislados e identificados mediante nias.DICIEMBRE DE 2006:1-114 crecimiento fúngico. Las cepas puras componen- tes de los consorcios nativos se resembraron en medios de cultivo de aislamiento primario básicos y con el fin de obtener el crecimiento suficiente para su completa iden- tificación y para mantenerlas viables. Los resulta- dos se expresan en UFC/g de suelo. . por medio de la tinción de Gram y coloraciones especiales para cápsula. la identificación de bacterias provenientes de suelo. según protocolo. Microorganismos aislados e identificados mediante pruebas los protocolos convencionales de identificación: teniendo bioquímicas.6x104. se mantuvieron en agitación a 120 rpm. Para cuantificar las colonias se seleccionaron las pruebas bioquímicas. de cada dilución se inoculó. 6 JUNIO . 0. (100 a 10-7).1 ml a pla. colonias. solidificados los medios se llevaron a incubar a 370 C Identificación bioquímica. Conteo preliminar de células viables esporas e inclusiones citoplasmáticas. Los cul- tivos se manipularon en iguales condiciones de creci- miento a las descritas para los recuentos bacterianos y se realizaron las resiembras necesarias en medio sólido hasta obtener cepas puras.PUBLICACIÓN CIENTÍFICA . zación macro y microscópica de las colonias aisladas. En la Tabla 1 se presentan durante 48-96 horas. diluciones que presentaron crecimiento entre 30 y 300 UFC. el recuento promedio en el surco con- mineral mínimo fundido y mantenido a 450 C. para obtener crecimiento de colo. características micro y macroscópicas de las colonias tración inicial de bacterias viables heterótrofas y aisladas se procedió a la aplicación de los protocolos desnitrificantes de cada uno de los surcos mediante la convencionales y pruebas bioquímicas especiales para técnica de recuento por vertido en placa.

Las diferentes es- Acinetobacter sp. fue demostrada mediante análisis méticos para los ojos. paja. algu- Discusión nas de sus especies termófilas pueden desarrollarse tam- El consorcio bacteriano identificado a partir del sue. cos- bacteriano. figura 1. pecies de Bacillus son de amplia distribución. la familia Bacillaceae. por lo que pueden recuperarse a partir de Bacillus licheniformis. En este trabajo se realizó la biorremediación con un consorcio nativo de bacterias desnitrificantes. agua y polvo ambiental.3x 104 y en el surco control fue de 2. desnitrificante del suelo (9). pertenecientes a la familia concentración bacteriana óptima para la desnitrificación. Corynebacterium. utilizados con frecuencia para degra- observaron diferencias significativas entre las unidades dación de derivados de petróleo (10). El recuento promedio de UFC/g de suelo post-trata. equipos hospitalarios. especie ha sido reportada frecuentemente como una disminución significativa de nitratos en las Unida. alimen- La actividad desnitrificante (AD) del consorcio tos preparados para bebes. Sin embargo. Utilizando todo el consorcio no se pudo determinar una Otro de los géneros. una variedad de nichos ecológicos. des experimentales (p£ 0. Análisis estadístico para nitratos post-tratamiento con el consorcio bacteriano aislado. 6. haciendo parte del bacteriano aislado llevó a cabo el proceso de consorcio nativo. comúnmente encontradas en tes asociaciones bacterianas y diferentes concentracio. negativa. Sthaphylococcus suelos. con especies anaerobias por lo que se sugiere en futuros ensayos probar diferen. facultativos ó estrictas. Pseudomonas sp.5. Propionibacterium. Esta fisicoquímicos observando mediante espectrofotometría. entre 2-10. mostrando que el consorcio En este trabajo se encontraron. aguas servidas. 8). Bacillaceae. especies de Staphylococcus coagulasa desnitrificación de una manera efectiva. Peptoestreptococcus. el Clostridium. suelo también han sido informados como potentes nes de las mismas. 7. en la suelos y agua. aguas estancadas. sido informado como desnitrificantes fuertes y rápidos. es el caso de la especie Bacillus licheniformis (8). bién en los extremos de acidez y alcalinidad con pH lo problema estuvo compuesto por: Bacillus megaterium. y ha sido recuperada de humus. En la presente investigación se aisló Pseudomonas stutzeri. estiércol. y diversos materiales clínicos. Adicionalmente al estar en grupo las diferentes especies bacterianas pueden tolerar los cambios físico-químicos que se den en el ambiente durante el proceso de biorremediación (3. El género Bacillus. habitan Actinomyces. no existen reportes de trabajos utilizando consorcios bacterianos. experimentales y el control. ya que convierten los nitratos a nitritos en 24 horas como miento fue de 6.6x104. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE DIEZ CEPAS BACTERIANAS DESNITRIFICANTES A PARTIR DE UN SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO: 50-54 53 Numerosos estudios han reportado microorganismos como potentes desnitrificantes en suelo (3.6). para que colectivamente desnitrifiquen el suelo. sus numerosas especies suelen ser mesófilas. lo que permite combinar y complementar las funciones metabólicas de diferentes microorganismos. Clostridium sp. ha coagulasa negativa. aerobias o anaerobias facultativas. También se aislaron diferentes microorganismos de pués de introducir el consorcio bacteriano. las cuales están ampliamente distribuidas en . la cual se encuentra ampliamente distribuida Figura 1.05) en relación al control des. En cuanto al análisis de los nitratos se biorremediadores.

Bothe H. que también ha sido reportado Oxide.Mc. Develoment of PCR primer system amplification of nitrite reductase genes (NirK and nirS) to detect denitrifyng bacteria in environmental samples. Scow.. Caballero. Turk Journal Biology 2003. a la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca por bacterium.unicolmayor. and metacromáticos. Shoun H. Harting. R. Applied and Enviromental Microbiology en la literatura como microorganismo desnitrificante (12). 3769-75. Mergel A. Ricardo también utilizan el NO3.Syst..2006. A halophilic denitrifier. también fue identificado en Environmental Microbiol. Witzel K. Principios de Biorecuperación. sido reportado como especie capaz de desnitrificar de 4. (6. 12. G.4 No. Denariaz G. Morton. suelos contaminados (13). El Acinetobacter un bacilo Gram negativo.. de cre. R.69(10): 5974-82. Braker W.69(6): 3152-57. Kim H.Bacteriol.ISSN:1794-2470 VOL. Aerobic Denitrifyng Bacteria That Produce Low Levels of Nitrous to típico en placas de agar. cimiento lento en medios convencionales. Çelen E. pleomorficos. y al Dr. Wittebolle L. Isolation and characterization of aerobic denitrifiers from agricultural soil. and W. 2002. Los autores agradecen a la Universidad de la Salle y También se encontraron especies de: Propioni. España. . Kato I. Naohiro N.69(6):3152-3157. Sakaguchi Y. Cultivation of Denitrifying Bacteria: Optimization of biología molecular para la identificación de isolation Conditions and Diversity Study. 2003. Satoshi T. Gram positivos. distribuido ampliamente en el Composition and Functioning of Denitrifying Bacteria from Adjacent Meadow and Forest Soils. Dayne W. Bacillus identificados y haciendo parte de la población nativa de halophilic denitrifier sp.11). ba.Heichen P. Aerobic Denitrifying Bacteria That Produce Low Levels of Nitrous Oxide . Naoki T. www. al Sr. 1999. bacilos filamentosos y and nitrite-responsive regulatory system. Guillermo López. p. 2004. E. 13. J. 1. Bernard M. de la Salle por su apoyo incondicional. Montealegre Coordinador de Laboratorios Universidad de Peptostreptococcus. Sakairi C.54 NOVA . Referencias Otro género encontrado fue Corynebacterium.DICIEMBRE DE 2006:1-114 diferentes nichos ecológicos y se caracterizan por su gran Agradecimientos capacidad de tolerancia al medio ambiente (8). Sawer C. 131-147. Tratamientos para la descontaminación y regeneración de suelos y aguas tadas con frecuencia aisladas de diferentes tipos de suelo subterráneas mediante procesos biológicos y fisicoquímicos. 181:161–166.edu.como aceptor de electrones. K. microorganismos difíciles de recuperar por cultivo en 9. Applied an Enviromental Microbiology. cilos aerobios.534p. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas placa o en medio líquido que aparecen en la literatura color. 1998.Graw-Hill. no McGraw Hill. sus diferentes especies han sido repor. Bottomley J. otro de los microorganismos encontrados during the transition from aerobic respiration to denitrification: evidence for a denitrification-specific nitrate- fue el género Actinomyces.3818-29. formadores de gránulos 29: 9 -14. 2003. Akira H. Akif M. J. Chang. Community fermentador de glucosa. Chemestry For Enviromental Engineering. Vanparys B. 1978.. que son bacilos Gram positivos. 3.co Appl and Environ Microbiol. 7. Applied and medio ambiente.. Verstraete W. Gall J. 2001. no hemolíticos. Cromack J. Microbiology. 5. ramificados. frecuentemente aislados de suelos. distribuidos en el medio ambiente. Gram variables. 6. Rich J. Kinetics of nirS expression este estudio haciendo parte del consorcio nativo. (cytochrome cd1 nitrite reductase) in Pseudomonas stutzeri Finalmente. De Vos P. Zumft. facultativos. los cuales propietario de la Finca Siempre Viva. 11. E. Eweis J. se recomienda en futuros estudios utilizar técnicas de 8. Feseldt A. 1989:39:145-151. Rösh C. cocos Gram positivos. Z. 6 JUNIO . Applied and Environmental cadas por PCR no fueron aisladas en nuestro estudio. D.PUBLICACIÓN CIENTÍFICA . Schroeder. Koneman EW. 5 th ed Buenos Aires.72(4)2637-2643. en diferentes tipos de suelo y agua ha Environmental Microbiology. Appl and manera lenta y débil (12). Yubei H. de crecimien. anaerobios la financiación de la investigación. Boon N. Sachiko Y. Bacteriol 2002. Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil. 2. Zhemin Debido a que algunas especies comúnmente identifi.