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Trabajo Practico
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Estudiantes:
1. Arancibia Aguilar Astrid Daniela
2. Arancibia Severich Nicole
3. Cayoja Antezana Deniza
4. González Callejas Carlos Augusto
5. Gonzales Camara Riselle
6. Lucana Camperos Andrea Jhaneth
7. Morales Alvarez Andrea Gabriela
8. Perez Liendro Sheyla Alejandra
9. Sanchez Villarroel Gustavo Mauricio
10. Ticona Alvarez Giovana Lesly
Calcula la cantidad de energía radiante absorbida por las moléculas a longitudes de onda
específicas, es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas. Los
fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna,
esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis
en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está compuesta de fotones cada
uno de los cuáles tiene una energía:
2. OBJETIVOS
• Conocer y aplicar los fundamentos de la espectrofotometría para la determinación de
concentraciones en soluciones.
• Conocer los fundamentos de la espectrofotometría y las variables involucradas en la ley
de lambert-beer-bourger.
• Seleccionar la longitud de onda apropiada para determinación de absorbancia.
• Determinar el coeficiente de absortividad y la concentración de una muestra problema.
3. DEFINICION
3.1 ESPECTROFOTOMETRO
Deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la palabra griega phos o photos,
que significa luz. Utiliza las propiedades y su interacción con otras sustancias, para determinar la
naturaleza de las mismas.
4. ESPECTROS DE ABSORCIÓN
4.1 ESPECTROFOTOMETRIA DE UV Y VISIBLE
Las bandas del espectro del UV y visible generalmente son anchas y no poseen un alto grado de
especificidad para la identificación de sustancias. Sin embargo, existen ensayos adecuados para
la cuantificación de muchas sustancias, así como ensayos adicionales para la identificación de
sustancias.
En la ley de Lambert-Beer la absorbancia (Aλ) de una solución a una longitud de onda dada, λ,
es definida como el logaritmo en base 10 del inverso de la transmitancia (Tλ):
𝟏 𝑰𝑨
𝑨𝑨 = 𝐥𝐨𝐠 𝟏𝟎 ( ) 𝒚 𝑻𝑨 =
𝑻𝑨 𝑰𝑨𝑶
Donde:
En la ausencia de algun otro factor fisico o químico, Aλ es proporcional al camino óptico, b, por
el cual la radiación atraviesa, y la concentración de la sustancia en solución, c, de acuerdo a lo
siguiente:
𝑨 𝝀 = 𝜺𝝀 𝒄 𝒃
Donde:
𝜺𝝀 = absortividad molar
c = concentración de soluto
b = camino óptico
La expresión 𝐴11 %
𝑐𝑚 representa la absorbancia específica de una sustancia disuelta, referida a la
absorbancia de una solución de 10 g/L en una celda de 1 cm de longitud a una longitud de onda
definida:
𝜺𝑨
𝑨𝟏𝟏 %
𝒄𝒎 = 𝟏𝟎𝒂 𝛌 = 𝟏𝟎
𝑴
EQUIPO
Consta de un sistema óptico capaz de producir luz monocromática en la región de 200 a 800 nm,
un dispositivo para seleccionar una banda angosta de longitudes de onda, una celda para
contener la muestra y un detector apropiado para determinar la absorbancia. Cuando se emplean
aparatos de doble haz, la celda que contiene el blanco se coloca en el haz de referencia. Las
celdas empleadas para la solución muestran y el blanco deben tener las mismas características
espectrales.
Los equipos empleados para registrar los espectros ultravioleta y visible indicados en esta
Farmacopea deben cumplir con los siguientes ensayos:
• Control De Absorbancias
Secar el dicromato de potasio hasta peso constante a 130°C. Para el control de absorbancia a
235 nm, 257 nm, 313 nm y 350 nm, disolver entre 57,0-63,0 mg en ácido sulfúrico 0,005 M y diluir
a 1000,0 mL con el mismo solvente. Para el control de la absorbancia a 430,0 nm disolver entre
57,0-63,0 mg de dicromato de potasio en ácido sulfúrico 0,005 M y diluir a 100,0 mL con el mismo
solvente.
Registrar el espectro de la Solución de dicromato de potasio y determinar las absorbancias a las
longitudes de onda especificadas en la Tabla. Los valores de deben estar dentro de las
tolerancias especificadas.
La luz parásita o espúrea puede ser detectada a una determinada longitud de onda acorde a los
filtros o soluciones: por ej. la absorbancia de una solución de cloruro de potasio al 1,2 %, medida
a 200 nm con un paso óptico de 1 cm, empleando agua como blanco, debe ser mayor de 2.
Podrían utilizarse otros materiales de referencia certificados.
Registrar el espectro de una solución de tolueno al 0,02 % v/v en hexano. La relación entre el
máximo de absorbancia a 269 nm, y el mínimo a 266 nm no debe ser menor de 1,5.
• Celdas
Las absorbancias de las celdas de lectura, cuando se llenan con el mismo solvente, deben ser
iguales. Si este no es el caso, debe aplicarse una corrección apropiada. La tolerancia en el paso
óptico de las celdas empleadas es ± 0,005 cm. Las celdas deben limpiarse y manipularse con
cuidado.
• Solventes
• Determinación De La Absorbancia
Cuando un ensayo indica el empleo de una Sustancia de referencia, se deben realizar las
medidas espectrofotométricas con la solución preparada a partir de la Sustancia de referencia y
luego con la solución correspondiente preparada a partir de la muestra. Efectuar las medidas en
sucesión inmediata, empleando las mismas condiciones experimentales y de preferencia la
misma celda.
FUNDAMENTO
La radiación electromagnética es una forma de energía que se propaga como ondas y puede ser
subdividida en regiones de longitudes de onda características. Asimismo, puede ser considerada
también como un flujo de partículas denominadas fotones (quanto). Cada fotón contiene
determinada energía cuya magnitud es proporcional a la frecuencia e inversamente proporcional
a la longitud de onda. La longitud de onda (λ) es generalmente especificada en nanómetros, nm
(10-9 metros) y en algunos casos en micrómetros, µm (10-6 metros). En caso del infrarrojo la
radiación electromagnética puede ser también descrita en términos de número de onda y
expresada en cm-1.
De las tres regiones de infrarrojo (cercano, medio y lejano), la región comprendida entre 4000 a
400 cm-1 es la más empleada para fines de identificación. Sin embargo, en algunos casos es
utilizado con fines cuantitativos. El espectro de infrarrojo (IR) es único para cualquier compuesto
químico con excepción de los isómeros ópticos que tienen espectros idénticos. En algunas
ocasiones, el polimorfismo puede ser responsable de diferencias en el espectro IR de un
compuesto en estado sólido.
La espectroscopia infrarroja tiene dos grandes aplicaciones: Identificar moléculas en una muestra
y Determinar la composición de los compuestos moleculares en una muestra.
ANÁLISIS CUALITATIVO
ANÁLISIS CUANTITATIVO
Este análisis se basa en la ley de Beer-Lambert, mediante la cual se elabora una curva de
calibración (a determinada frecuencia), y a partir de ahí se puede conocer la concentración de un
compuesto específico en una muestra.
A =ɛpc
Donde:
EJEMPLO: El espectro de infrarrojo del agua es, quizás, el más famoso de todos los espectros,
y presenta en forma muy clara dos bandas de absorción, una muy intensa a 3500 cm-1 , asignada
al enlace O-H, y otra a 1650 cm-1 , asignada al enlace H-O-H.
Figura 1. Ejemplo
INSTRUMENTACIÓN (EQUIPOS)
Existen dos tipos de espectrómetros: dispersivo y con transformada de Fourier. El dispersivo tiene
la ventaja de ser portátil, utilizar un filtro de interferencia para la selección de longitud de onda y
una óptica de doble haz. En la siguiente figura se observan las diferencias entre un espectrómetro
dispersivo y un espectrómetro por transformada de Fourier.
Los espectrofotómetros utilizados para la obtención del infrarrojo medio y cercano consisten de
una fuente de luz, monocromador o interferómetro y detector, los cuales permiten la obtención de
espectros en la región comprendida entre 780 nm a 25000 nm (12800 cm-1 a 400 cm-1 ).
Actualmente, los espectrofotómetros de infrarrojo utilizan un interferómetro en lugar de un
monocromador en cuyo caso la radiación policromática incide sobre la muestra y los espectros
son obtenidos en el dominio de la frecuencia con ayuda de la transformada de Fourier
En este caso se mide la Absorbancia (A) del analito, esto es la luz absorbida por el analito, y esta
magnitud se relaciona con la concentración (C).
PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA
Es un método instrumental que está basado en la atomización del analito en matriz líquida y que
utiliza comúnmente un nebulizador pre-quemador (o cámara de nebulización) para crear una
niebla de la muestra y un quemador con forma de ranura que da una llama con una longitud de
trayecto más larga, en caso de que la transmisión de energía inicial al analito sea por el método
"de llama". La niebla atómica es desolvatada y expuesta a una energía a una determinada
longitud de onda emitida ya sea por la dicha llama, ó una Lámpara de Cátodo hueco construida
con el mismo analito a determinar o una Lámpara de Descarga de Electrones (EDL).
La temperatura de la llama es lo bastante baja para que la llama de por sí no excite los átomos
de la muestra de su estado fundamental. El nebulizador y la llama se usan para desolvatar y
atomizar la muestra, pero la excitación de los átomos del analito se hace por el uso de lámparas
que brillan a través de la llama a diversas longitudes de onda para cada tipo de analito.
El método del horno de grafito puede también analizar algunas muestras sólidas o semisólidas.
Debido a su buena sensibilidad y selectividad, sigue siendo un método de análisis comúnmente
usado para ciertos elementos traza en muestras acuosas.
EQUIPOS
Los análisis que se ofrecen incluyen prácticamente todos los elementos de la tabla periódica en
una amplia variedad de muestras líquidas y sólidas.
5. ESPECTROS DE EMISIÓN
El espectro de emisión se define como el conjunto de longitudes de onda emitidas por un átomo
que se encuentra en estado excitado. Al emitir radiación electromagnética, el átomo excitado
pasa a un estado energético inferior.
Cada elemento de la tabla periódica tiene un espectro de emisión único que se conoce como
firma espectral, por lo que analizando el espectro de emisión de una sustancia podemos
identificar los elementos que la componen.
En este caso se mide la luz emitida por un analito previamente excitado, la señal emitida se
relaciona con la concentración de la especie que emite luz cuando vuelve desde un estado
excitado (estado de mayor energía al que llegó absorbiendo energía) a su estado basal (estado
de menor energía posible tal como se encuentra naturalmente).
Cuando un átomo recibe energía, por ejemplo calor, los electrones absorben la energía y suben
a niveles energéticos superiores. El átomo pasa a estar en un estado excitado.
Los diferentes niveles de energía están cuantizados. La energía del electrón no puede subir o
bajar de forma continua sino a saltos entre niveles cuánticos.
El estado excitado no es un estado estable para el átomo. Siempre va a tender al estado basal.
Cuando un electrón vuelve a un nivel energético inferior, se libera un fotón, es decir, se emite la
radiación electromagnética que formará el espectro de emisión.
La energía del fotón emitido es igual a la diferencia de energía entre el estado excitado y el estado
basal, y se relaciona con la radiación electromagnética mediante la siguiente ecuación:
E fotón = h*v
Donde:
E = es la energía del fotón,
v = la frecuencia,
h = la constante de Planck.
Cada electrón de un átomo puede estar en múltiples estados excitados, pues puede subir uno, a
dos o más niveles energéticos. Por este motivo un espectro de emisión atómica se compone de
multitud de longitudes de onda, pero siempre determinadas por los estados cuánticos por los que
pasan los electrones.
Como cada elemento tiene un espectro de emisión propio y diferente al de otros elementos,
estudiando el espectro de emisión de un objeto se puede conocer los elementos que lo
componen.
Del mismo modo que cada elemento emite determinadas longitudes de onda, cada elemento
también absorbe sólo determinadas longitudes de onda. Las longitudes de onda absorbidas
forman el espectro de absorción.
El espectro de absorción y el espectro de emisión son complementarios. Las longitudes de onda
que se absorben para subir a un estado excitado, son las mismas longitudes de onda que se
emiten al volver al estado basal.
Se basa en que los átomos de numerosos elementos metálicos con suficiente energía, emiten
dicha energía a longitudes de onda (λ) particulares que son específicas de cada elemento. La
energía en la
Fotometría emisión de llama se suministra en forma de calor o energía térmica. Una determinada
cantidad o quantum de la energía térmica es absorbida por un electrón de una órbita. Ese electrón
excitado pasa a una órbita de energía superior más inestable, volviendo casi inmediatamente a
su estado basal y emitiendo ese quantum de energía en forma de un fotón de una λ dada. En la
llama sólo el 1% de los átomos presentes
Experimentan esa transmisión y emisión de energía, siendo sus máximos representantes los
elementos Na y K. Las llamas se clasifican en: a. Duras (Pequeña y caliente). Ej. Soplete de
acetileno. b. Blandas (Más anchay alcanza menos temperatura). Ej. Mechero Bunsen.
Durante muchos años, las llamas se han utilizado para obtener los espectros de emisión por
excitación de diversos elementos, y los más modernos espectrómetros de absorción atómica
están adaptados para trabajar en la modalidad de emisión de llama. Sin embargo, las llamas no
se utilizan mucho para esto, ya que la modalidad de absorción proporciona resultados tan buenos
o mejores en cuanto aexactitud, conveniencia y límites de detección para la mayoría de las
determinaciones de un único elemento. Para análisis multi elemental, las fuentes de plasma son
bastante superiores a las llamas en la mayoría de los aspectos. Por ello, la espectrometría de
emisión de llama actualmente tiene poca utilidad, excepto en la determinación de metales
alcalinos y, ocasionalmente, de calcio. Estos elementos se excitan a temperaturas relativamente
bajas para dar espectros que son notablemente sencillos y exentos de interferencias de otras
especies metálicas. Los espectros de metales alcalinos constan de unas pocas líneas bastante
intensas, muchas de las cuales se encuentran en la región del visible y que permiten
perfectamente cuantificar las medidas de emisión.
Figura 5. Esquema del equipo instrumental empleado
En este caso, son más favorables las llamas frías ya que los metales alcalinos (como el sodio) y
alcalinotérreos no necesitan mucha temperatura para excitarse y por ello no se utiliza una
temperatura tan alta. El selector encargado del aislamiento de la longitud de onda que se usa
mayoritariamente es el filtro de interferencias que está diseñado para transmitir solamente el
doblete típico de sodio, es decir líneas intensas alrededor de 589,0 y 589,6 nm. Esta longitud de
onda también permite emitir radiación del Ca y por ello hay que diferenciarlo. Así el calcio, que
también se encuentra en nuestra tapa puede generar interferencias. El detector más utilizado es
el fototubo. El instrumento se llama fotómetro de "un solo canal" porque solo puede determinar
un elemento a la vez y tiene una lectura directa de salida única.
6. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA