PRACTICA Nº 5

Tema: Espectrofotometría
I. INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben
las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende
de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que
pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta
práctica se darán a conocer las características generales y conceptos relacionados con
la espectrofotometría. A continuación y tras la explicación del funcionamiento del
espectrofotómetro se harán espectros de absorción con el fin de determinar la
longitud de onda donde la muestra presenta la máxima absorción así como la
determinación del rango de concentración adecuado y del coeficiente de extinción
molar.
II. OBJETIVOS

- Determinar la longitud de onda de máxima absorción, los niveles de concentración

adecuados para el análisis cuantitativo por espectrofotometría y el coeficiente de
extinción molar.

III. FUNDAMENTO
La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis que se emplean con más
frecuencia dentro del campo del análisis de los alimentos: las regiones del espectro
más usadas en dicho campo son el ultravioleta y el visible, y en algunos casos el
infrarrojo cercano.
La determinación cuantitativa por espectrofotometría se basa en la ley combinada de
Lambert - Beer.
A = a.b.c
Dónde:
A = Absorbancia, o extinción o densidad óptica.
a = Absortividad
b = Longitud de paso o recorrido de la luz
c = Concentración
Esta expresión muestra que existe una relación lineal entre la absorbancia (A) y la
concentración (c) de una solución dada, siendo constante la longitud del trayecto
óptico y la longitud de onda. Esta relación se cumple y por lo tanto el análisis
espectrofotométrico cuantitativo se puede aplicar cuando:
 a) Todos los cuantos de energía tienen la misma posibilidad de ser absorbidos por la
sustancia, es decir, la luz empleada debe de ser monocromática y a la de máxima
absorción.
b) Todas las moléculas de la sustancia deben tener la misma posibilidad de absorber
los cuantos de energía, es decir, la sustancia debe estar lo suficientemente diluida
para que ninguna molécula quede oculta o a la sombra de otra. Se estima como
promedio una concentración de 1 x 10-2 mol/L.
De no cumplirse estos requisitos, se estaría produciendo desviaciones de la ley de
Beer obteniéndose en consecuencia resultados erróneos o inexactos en la
determinación cuantitativa.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS.

4.1. Materiales y Equipos.
- Ácido oxálico, ácido ascórbico, 2,6 Diclorofenolindofenol, agua destilada.
- Espectrofotómetro UV – VIS, Celda de Cuarzo , Fiolas, Pipetas volumétricas,
Embudo de vidrio. papel filtro, papel Tissue.

4.2. Métodos
4.2.1. Manejo del Espectrofotómetro.
De acuerdo a las instrucciones en práctica.
4.2.2. Procedimiento
a) Preparación de reactivos
a.1 Preparar una solución de ácido oxálico al 0.4 % pesar 4g de este ácido
y llevar a volumen de 1000 ml. Con agua destilada.
a.2 Soluciones estándar (madre) de ácido ascórbico: Preparar una
solución de 0.1 % de ácido ascórbico en una solución ácida de 0.4 %
de ácido oxálico. Pesar 100 mg. de ácido ascórbico y llevar a volumen
de 100 ml. con una solución de ácido Oxálico al 0.4 %.
a.3 Estándares de trabajo (ET): Los grupos 1, 2 y 3 tomará 2, 3 y 4ml de la
solución madre de ácido ascórbico respectivamente y llevará a
volumen de 100 ml. con una solución de ácido oxálico al 0.4 %. Estas
soluciones contendrán 2, 3 y 4mg de ácido ascórbico por 100 ml.
respectivamente.
a.4 Solución coloreada (Colorantes) al 0.0012%: pesar 12 mg. de 2,6 DFIF,
disolver y llevar a 1000 ml. de volumen con agua destilada. Utilizar
agua destilada hirviente. Almacenar en botella de color oscura y en
refrigeración.
 b) Determinación de la longitud de onda de máxima absorción.
- Tomar 4 tubos de prueba y enumerarlas de I al IV y agregar lo
siguiente:
I 10 ml. de agua destilada
II 1 ml. de ácido oxálico al 0.4%
III 1 ml. de estándar de trabajo (ET) + 9 ml. de agua
IV 1 ml. del estándar de trabajo (ET) Nº 1
- Ajustar a cero la Absorbancia usando I y el filtro seleccionado.
- Al tubo II añadir 9 ml. del colorante y exactamente después de 15
segundos, leer la absorbancia (L1).
- Ajustar a cero la absorbancia con la solución del tubo III.
- Al tubo IV añadir 9 ml. del colorante y exactamente después de 15
segundos, leer la absorbancia (L2).
- Leer la absorbancia vs longitud de onda desde 200 – 720nm,
incrementando de 40 en 40nm.
- Graficar la absorbancia vs la longitud de onda para cada una de las
concentraciones realizadas.
c) Determinar el coeficiente de extinción molar ().
- Preparar una solución de ácido ascórbico al 0.005M y realizar la
lectura de absorbancia a la longitud de onda de máxima absorbancia
obtenida en la parte b, siguiendo el procedimiento de la parte
anterior.
- Con los datos de: c (concentración molar, mol/L), d( espesor de la
cubeta, cm) y la A (absorbancia), calcular el coeficiente de extinción
molar (, L mol-1 cm-1), para el ácido ascórbico a la longitud de onda
establecida, aplicando la Ley de Lambert –Beer, siguiente:
λ = A / dc
V. RESULTADOS DE DISCUSIÓN
Presentar resultados mediante cuadros y gráficos y sus respectivos cálculos.
VI. BIBLIOGRAFÍA.
 Skoog, F. James Holler, Stanley R. Crouch. (2009). Principios de análisis
instrumental. 6ta edición. Ediciones Paraninfo. España
 Herrandez Hernádez y Claudio Gonzáles. (2002). Introducción al Análisis
Instrumental. Editorial Ariel, S.A. España
 Mauri Aurejo, María Llobat Estélles, y Rosa Herráez Hernández. (2010). Laboratorio
de Análisis Instrumental. Editorial Reverte, S.A. España.
 Pecsok R. y Donald Shields. (1990). Métodos Modernos de Análisis Químico.
Editorial Limusa. México.