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Valentina García Franco, 2Juan José Valencia Henao.

Fecha de presentación: 16/ Noviembre /2023 Docentes: Yaned Milena Correa N. - Juan David Rivera G.

1. RESUMEN Y PALABRAS CLAVES.

Se realizó la determinación de ácidos orgánicos en cifrut de mora utilizando cromatografía líquida de alta
eficiencia (HPLC). La preparación de la muestra involucró centrifugación, filtración y almacenamiento
adecuado. Se empleó un cromatógrafo UltiMate 3000 con detector VWD y una columna ODS. Se generó
una curva de calibración con cinco puntos y tres inyecciones por nivel para cuantificar un ácido específico.
Los datos se procesaron en el software del equipo, permitiendo la interpolación del área del pico de la
muestra en la curva de calibración para obtener información precisa sobre la cantidad de ácido en el jugo
analizado. El objetivo fue identificar y cuantificar los ácidos orgánicos presentes en el jugo cifrut de mora.

Palabras clave: Ácidos, Orgánicos, Jugo, Mora, Concentración, HPLC.

2. INTRODUCCIÓN.

Los ácidos orgánicos son compuestos químicos fundamentales en la composición de alimentos y bebidas, ya
que influyen en su sabor, acidez y calidad. El jugo de mora, conocido por su sabor agridulce y sus
propiedades antioxidantes, es un producto que se beneficia de la determinación de los ácidos orgánicos
presentes en su composición.

La determinación de ácidos orgánicos y azúcares en los alimentos es de gran importancia. Su presencia y la

cantidad en que se encuentren puede afectar algunas características tanto químicas como sensoriales del
alimento, tales como: pH, acidez total, estabilidad microbiológica, sabor, entre otras. Adicionalmente, el
conocimiento de la composición de los alimentos puede proveer información importante acerca de cómo
optimizar determinados procesos tecnológicos que permitan prolongar la vida útil del producto. En el caso
de las frutas frescas, el almacenamiento y tratamiento post-cosecha son determinantes en la calidad del
producto final. De acuerdo a algunos investigadores (Subramanyam et al., 1975) se ha observado una
correlación entre el contenido de ácidos y el tiempo de almacenamiento, siendo éste último más corto en
frutos con baja acidez, y más largo en frutos con mayor acidez.

Los ácidos orgánicos son usados en el procesamiento de alimentos con varios propósitos, por ejemplo:
controlar el pH, ajustar la acidez de las materias primas o los productos terminados; también pueden
funcionar como condimentos para realzar o disimular sabores o actuar como conservantes. Así, el ácido
cítrico proporciona frescura, mientras que el ácido succínico agrega sabor amargo y salado a los alimentos
preparados (Gratzfeld-Hüsgen; Schuster, 2001). De igual manera, los antioxidantes como las vitaminas C
y E, los carotenos y el 2,6-di-ter-butil-4-metilfenol (butilhidroxitolueno [BHT]) retardan la degradación

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oxidativa de los lípidos en los alimentos preparados, previniendo la rancidez y la producción de olores y
sabores desagradables (Bristian, 2002). Además, los azúcares fructosa, glucosa, lactosa, maltosa y sacarosa,
entre otros, son fuente primordial de energía y se emplean en la elaboración de productos alimenticios
debido a que acentúan el sabor dulce y le confieren cuerpo y textura a estos (Stanton; Willians, 2001).

La técnica de Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) ha sido empleada por varios investigadores
para determinar el contenido tanto de azúcares como de ácidos orgánicos en frutas (Medlicott, 1985; Pérez
etal., 1997; Tovar et al., 2001; Thanaraj et al. 2009; Cevdet et al, 2009), jugos de fruta (Chinnici et al.,
2005), y miel (Suárez et al., 2002), obteniendo resultados precisos y consistentes. El alto grado de precisión
de ésta técnica, unido a su simplicidad y condiciones de operación adecuadas (bajas temperaturas de trabajo
pequeña cantidad de muestra y tiempos de operación cortos) convierten a la cromatografía líquida de alta
eficiencia en la técnica más atractiva para el análisis cuantitativo de ácidos y azúcares en frutas. El objetivo
principal de esta práctica es determinar la concentración de ácidos orgánicos, como el ácido cítrico, málico,
tartárico y otros, en el jugo de mora.

3. OBJETIVOS.
● Aprender el manejo y los componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia
(HPLC).
● Identificar los ácidos orgánicos presentes en el cifrut de mora.
● Determinar la concentración de los ácidos orgánicos presentes en el cifrut de mora.

4. METODOLOGÍA.

4.1. Materiales y equipos:

● Balones volumétricos
● Balanza analítica
● Beacker
● Centrífuga
● Cromatógrafo líquido de alta eficiencia
● Filtros de muestra
● Filtros para solvente
● Jeringa
● Pipetas
● Tubos para centrífuga
● Viales

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4.2. Reactivos :

● Agua tipo I
● Jugos de fruta
● Ácido málico

4.3. Procedimiento:

Como se ilustra en la Fig. 1, la práctica se divide esencialmente en cuatro etapas, la preparación de la

muestra, la preparación de estándares del ácido asignado, la configuración del método de trabajo en el HPLC
y la cuantificación. Inicialmente se efectúa la preparación de la muestra, para la cual comprende varias
etapas. En primer lugar, se procede a la centrifugación del jugo a una velocidad de 6000 rpm durante un
período de 10 minutos (Fig.2). Luego, se toma 1 mL del sobrenadante resultante y se transfiere a un balón
volumétrico de 5.0 mL, donde se afora con agua tipo I (Fig.3). A continuación , para preparar los estándares
necesarios para la creación de una curva de calibración, se deben realizar los cálculos basados en una
concentración de 1000 mg L^-1 del ácido málico (Tabla 1). Para llevar a cabo este proceso, se utilizaron
cinco balones volumétricos de 5 ml y de acuerdo a ello, el volumen inicial calculado según la Tabla 1 se
añadió a cada balón para luego aforar hasta 5 ml (Fig.4). A continuación, se procedió a filtrar esta solución,
para ello, el filtrado se realizó desde la menor concentración hasta la mayor concentración, asimismo,
utilizando una jeringa, se filtraron estos estándares y se depositaron en los viales designados (Fig.5), no
obstante, es importante destacar que se hace la filtración con el uso de un filtro micrométrico tipo cono
para jeringa de inyección, para reducir la cantidad de partículas sólidas no disueltas en la disolución que
puede causar un daño en el detector, además, de otorgar un vacío que le permita a la muestra ir sin
presencia de gases disueltos o burbujas que pueden dar cromatogramas con tiempos de retención no
reproducibles por la variación en la presión del líquido en análisis .
Posteriormente, la muestra se filtra con ayuda de un filtro desechable con un poro de 0.22 µm y se almacena
en un vial adecuado para su posterior análisis mediante cromatografía líquida, para ello son llevados al
cromatógrafo líquido y se ubican los estándares con la muestra (Fig.6).
Del mismo modo, se configura el método de trabajo en el HPLC como se ilustra en la Fig.7, por
consiguiente, el análisis instrumental se lleva a cabo utilizando un cromatógrafo líquido UltiMate 3000,
equipado con un sistema de procesamiento de datos Chromeleon 7.2, . El proceso de inyección se
automatiza con un inyector automático con un loop de 20.0 μL. El detector de onda variable VWD se ajusta
a una longitud de onda de 210 nm. La columna utilizada es de tipo ODS con una partícula de 5.0 μm y
dimensiones de 250 x 4.6 mm, mientras que el horno se mantiene a una temperatura constante de 30.0 ºC. La
fase móvil consiste en una solución de ácido sulfúrico 1.0 mM en modo isocrático, con un flujo de 0.6 mL
min^-1, y el tiempo total de ejecución de cada corrida es de 10 minutos, finalmente, se inyecta un volumen
de 10.0 µL en cada análisis.

En cuanto a la cuantificación, antes de proceder, es esencial identificar los ácidos presentes en el jugo
mediante la comparación de los tiempos de retención de los ácidos conocidos y el cromatograma de la
muestra de jugo. Se elige el ácido de interés para la cuantificación y se establece una curva de calibración
con cinco puntos. Posteriormente, se procesan los datos utilizando el software del equipo, que, a partir del
área de los picos de cada concentración del ácido en cuestión, genera la curva de calibración. Finalmente, se
interpola el área del pico seleccionado en la muestra, permitiendo obtener la información sobre la cantidad
del ácido presente en el cifrut de mora.

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Fig 1. Diagrama de flujo. Determinación de ácidos orgánicos en jugos por cromatografía líquida de alta eficiencia.

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 4.4. Imágenes y evidencias.

Fig 2. Centrifugación del jugo a Fig 3. Aforado de la muestra con Fig 4. Preparación de estándares
una velocidad de 6000 rpm después agua tipo 1 y su almacenamiento de ácido málico en cinco
de un período de 10 minutos en un vial. balones volumétricos de 5 ml

Fig 5. Filtrado de los estándares Fig 6. Ubicación de las muestra Fig 7. Configuración del
de ácido málico a través de un y estándares en el cromatograma método de trabajo en el HPLC
filtro desechable de 0,22 μm y por HPLC
posterior almacenamiento en un
vial apropiado para su análisis en el
HPLC.

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5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Tabla 1. Datos obtenidos al preparar 5 estándares a diferentes concentraciones (20, 40, 60, 80 y 100 mg/l) a
partir de una solución madre de 1000 mg/l.

Concentraciòn 1000 mg/L

Àcido màlico

Volumen 2 5 mL

Concentraciòn 2 10 20 40 60 80 100 mg/L

Volumen 1 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 mL

Fig.8 Cromatograma obtenido para el cifrut de mora

Tabla 2. Resultado de la determinación de ácido màlico en cifrut de mora por cromatografía líquida de alta
eficiencia (HPLC).

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 Fig 9. Curva de calibración entre la concentración y el área para el ácido málico .

Tabla 3. Datos obtenidos a partir de la función estimación lineal para el ácido málico.

Tabla 4. Datos obtenidos de LOD, LOQ y concentración para el ácido málico.

Concentraciòn 76,3692 mg/L

àcido màlico

LOD 15,3446736 mg/L

LOQ 51,1489119 mg/L

● Concentración de ácido málico: 76,3692 mg/L* 10 (Factor de dilución)= 763,69 mg/L

Tabla 5. Resultado de la determinación de ácido ascórbico en cifrut de naranja por cromatografía líquida de
alta eficiencia (HPLC).

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 Grupo 9

Muestra Concentración Tiempo de Área

(mg/L) retención (mUA.min)
(min)

Á. Ascórbico 10 3,953 0,1777

Á. Ascórbico 20 3,953 2,1573

Á. Ascórbico 40 3,955 8,7502

Á. Ascórbico 60 3,957 15,0891

Á. Ascórbico 80 3,955 20,1489

2,425 0,9613

2,58 0,2335
Cifrut Naranja
3,958 2,5835

6,947 8,6979

Fig 10. Curva de calibración entre la concentración y el área para el ácido ascórbico .

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 Tabla 6. Datos obtenidos a partir de la función estimación lineal para el ácido ascórbico.

Estimación Lineal

m 0,2947 -3,1127 b

Sm 0,0095 0,4657 Sb

R2 0,9969 0,5422 Sy/x

Tabla 7. Datos obtenidos de LOD, LOQ y concentración para el ácido ascórbico.

Concentraciòn 23,993 mg/L

àcido ascórbico

LOD 4,741 mg/L

LOQ 15,803 mg/L

● Concentración de ácido ascórbico : 23,993 mg/L* 10 (Factor de dilución)= 239,93 mg/L

En la Figura 8 del análisis cromatográfico del Cifrut de mora, se observan tres picos, indicativos de la
posible presencia de distintos ácidos. Tras el análisis, se logró identificar dos ácidos a partir de los tiempos
de retención establecidos en la Tabla 2 para el ácido málico y en la Tabla 5 para el ácido ascórbico. Se
constató un desfase aceptable de 0,1 al comparar los tiempos de retención con el segundo pico, lo que
permitió confirmar la identificación precisa de estos ácidos. Sin embargo, para el tercer pico no se encontró
correspondencia con ninguno de los ácidos propuestos en la práctica (málico, ascórbico, cítrico y tartárico).
Es probable que la señal detectada se deba a alguna interferencia.
Tras la identificación cualitativa de estos ácidos, se procedió a realizar un análisis cuantitativo para
determinar la concentración de los ácidos en la muestra. A partir de lo anterior , se construyó una curva de
calibración que relaciona la concentración con el área, como se ilustra en las Figuras 9 y 10. Luego,
utilizando los datos obtenidos a partir de la función de estimación lineal para el ácido ascórbico y málico,
detallados en las Tablas 3 y 6, respectivamente, se calculò el Límite de Detección (LOD) y el Límite de
Cuantificación (LOQ) como se muestra en la Tabla 4 y 7.

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Los resultados experimentales indican una concentración de ácido málico de 76,37 mg/L en el primer pico
identificado, ajustada a 763,69 mg/L con un factor de dilución de 1/10. El Límite de Detección (LOD) y el
Límite de Cuantificación (LOQ) para el ácido málico se determinaron como 15,34 mg/L y 51,15 mg/L
respectivamente (Tabla 4). La concentración medida de ácido málico (76,37 mg/L) es detectable y
cuantificable de manera confiable, superando el LOQ. En relación al ácido ascórbico, se registró una
concentración de 23,993 mg/L en el segundo pico identificado, ajustada a 239,93 mg/L con un factor de
dilución de 1/10. El LOD y LOQ para el ácido ascórbico se establecieron en 4,741 mg/L y 15,803 mg/L
respectivamente (Tabla 7). La concentración medida de ácido ascórbico (23,993 mg/L) también es detectable
y cuantificable de manera confiable, superando el LOQ establecido.

La concentración resultante de ambos ácidos revela el interés significativo en la composición de ácidos

orgánicos de los jugos, dado su impacto en las propiedades sensoriales de la bebida (Schvab et al., 2013). En
el caso particular de la mora, se ha documentado que es considerada una fruta blanda, lo que puede reducir
sus niveles de ácidos durante la maduración, influenciada principalmente por factores externos, como la
temperatura (Seymour, 1993). Esta condición podría explicar la ausencia de predominancia de ciertos ácidos
en el jugo analizado. Según Azcón (1996), se ha observado que los ácidos cítrico y málico tienden a
interconvertirse en frutos verdes, mientras que el metabolismo del ácido cítrico decrece durante la
maduración de la mora. En contraposición, un estudio de (Jaramillo; Torres; Pinzón; Franco, s.f) caracterizó
y cuantificó ácidos no volátiles en materiales de mora utilizando cromatografía de HPLC, encontrando una
predominancia de ácido cítrico, seguido por ácido málico, ácido ascórbico y ácido succínico en proporciones
menores.Estos hallazgos contrastan con nuestros resultados, donde se identificó ácido málico en mayor
proporción y ácido ascórbico en menor cantidad, sin la presencia de ácido cítrico, en contraposición con lo
reportado por estos autores.

La ausencia de ácido cítrico en el jugo de mora puede estar relacionada con varios factores como la
variabilidad en el proceso de maduración ( Días; Sequeira; Veloso; Morais; Sousa; Peres, 2014), el caso de
la mora, como se mencionó previamente, es considerada una fruta blanda que tiende a disminuir sus niveles
de ácidos durante la maduración, lo que podría influir en la cantidad de ácido cítrico presente en el jugo.
La concentración de ácido ascórbico en el jugo de mora resultó mayor que en el jugo de limón, pero menor
que en el jugo de naranja, con una cantidad medida de aproximadamente 23,993 mg/100 ml. Otros estudios
mostraron fluctuaciones en el contenido de ácido ascórbico, desde 23.69 mg/100 ml para el jugo de limón
hasta 56.01 mg/100 ml para el jugo de naranja, confirmando la similitud entre el contenido de ácido
ascórbico en el jugo de limón según lo reportado por (Alfadul; Hassan, 2016).

6. CONCLUSIONES

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 ● El estudio permitió adquirir conocimientos sobre el manejo del cromatógrafo HPLC, lo que facilitó
la identificación exitosa de ácidos orgánicos en el jugo de mora. Se cumplió con éxito el objetivo de
aprender el manejo de esta técnica y utilizarla para identificar los ácidos presentes.
● Los resultados obtenidos permitieron determinar con precisión las concentraciones de ácido málico y
ácido ascórbico en el jugo de mora.
● La aplicación del HPLC demostró ser una herramienta eficaz y precisa para el análisis de ácidos
orgánicos en alimentos, específicamente en el jugo de mora.

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