Medida de la concentracin de lactosa Lactosa: es un disacrido formado por una molcula de glucosa y una de galactosa.

[1]

Figura 1. Frmula de la lactosa

Medicin por DNS Los mtodos enzimticos para cuantificar lactosa estn basados en la hidrlisis de la misma a Dgalactosa y D-glucosa con -galactosidasa, seguida por la determinacin de cualquiera de los azucares obtenidos. La medida de la D-galactosa liberada es ms confiable, debido a que las preparaciones pueden contener D-Glucosa libre en mayores cantidades. Las determinaciones enzimticas de D-galactosa son muy lentas, esto se debe a la baja tasa de mutarotacin entre las formas anomericas de la D-galactosa, ya que solamente la forma es reconocida por la -galactosa deshidrogenasa, por lo que se deben usar una mayor cantidad de reactivos para llevar a cabo el proceso en forma ms gil y lograr las mediciones deseadas. Cuando se tiene la -D-galactosa se oxida por un NAD+ formando NADH y cido D-galactonico, la cuantificacin del NADH formado es estequiomtrico con la cantidad de lactosa, esta medida se realiza en un espectrofotmetro a 340 nm de longitud de onda[2] El DNS reacciona nicamente con los azcares reductores. La lactosa es un disacrido no reductor, pero tras su hidrlisis en medio cido se liberan glucosa y galactosa que s son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por mtodos espectrofotomtricos es proporcional a la concentracin de lactosa[3]. Para medir la Lactosa por mtodo de DNS es necesario realizar una desproteinizacion, as como una neutralizacin de la muestra a medir, se mezcla la muestra de lactosuero con el reactivo DNS y luego se diluye en 5 ml, la solucin se mantiene en agua hirviendo por 5 min y es enfriada para medir la absorbancia a 540 nm.[4]

Es necesario tener en cuenta para la cuantificacin de la lactosa que el mtodo posee un lmite de cuantificacin que es de 2 mg lactosa /ml, teniendo en cuenta eso se debe realizar una curva patrn con diferentes concentraciones de lactosa para tener as la correlacin y saber al momento de la medicin que cantidad de lactosa se tiene en la muestra.[5] Durante estudios previos se realizaron pruebas de DNS, para comprobar la factibilidad de la medida de la concentracin de la lactosa y el grado de hidrlisis de la misma [6], a continuacin se muestran las graficas obtenidas en la medida del DNS para lactosa, glucosa y una mezcla de estas a diferentes concentraciones y las sustancias puras.

Lactosa 4 3.5 3
Cocnentracin g/l

Glucosa 4 3.5 3
Cocnentracin g/l

2.5 2 1.5 1 0.5 0

2.5 2 1.5 1 0.5 0

0.5 1 Absorbancia (540 nm)

1.5

0.5

1 1.5 Absorbancia (540 nm)

2.5

Figura 2 a: Curva de calibracin para lactosa mediante DNS

Figura 2 b: Curva de calibracin para glucosa mediante DNS

Absorbancia (540 nm)

% Glucosa en mezcla Figura 2 c: Absorbancia de mezcla, respecto a % de glucosa

Al observar las grficas y luego de realizar una revisin bibliogrfica, se llega a la conclusin que por el mtodo del DNS no se puede cuantificar el grado de hidrlisis de la lactosa, ya que ambos azcares presentan coloracin al reaccionar con el DNS, lo que genera un ruido y una imposibilidad de saber cul de las dos biomolculas se est cuantificando y no se puede saber con exactitud la cantidad de lactosa remanente luego de la hidrlisis. El mtodo tendra gran aplicacin si se pudiera medir la absorbancia de uno de los azcares a una longitud de onda diferente, ya que se evitaran lo errores producidos por la medicin a la misma longitud de onda, pero en ninguno de los casos hallados se reporta una longitud de onda diferente para cualquiera de las biomolculas trabajadas. Analizador de Leche La funcin de este equipo es realizar un anlisis rpido de grasa (FAT), slidos no grasos (SNF), protenas, porcentaje de lactosa y contenido de agua, temperatura y en algunos caso pH, punto de congelacin, slidos y conductividad, as como la densidad de la muestra. El equipo debe ser configurado antes de ser entregado con las muestras que se desea analizar. Rangos de Medida Grasa SNF Densidad Protenas Lactosa Contenido de agua Temperatura de la leche Punto de congelacin Solidos de 0,01% a 25% de 3% a 15% de 1015 a 1040 kg/m3 de 2% a 7% de 0,01% a 6% de 0 a 70% de 1C a 40C de -0,4 a -0,7 C de 0,4 a 1,5 %

El pH y la conductividad son medidas que se deben pedir al momento de realizar la compra del equipo.[7] Procedimiento bsico de manejo del equipo y preparacin previa de la muestra En la preparacin previa de la muestra se debe tener en cuenta la procedencia de la materia prima, se debe asegurar que la muestra tenga las mismas caractersticas, es decir en el caso del lacto-suero provenga de la misma empresa y del mismo proceso de produccin, de lo contrario se deben llevar a cabo medidas de cada una de las materias primas disponibles.

Uno de los puntos que mayor influencia tienen en la calidad de los resultados obtenidos es la correcta agitacin previa de la muestra a analizar, es necesario realizar una adecuada agitacin del recipiente que almacena toda la materia prima, esta se debe agitar por no menos de 5 min, con movimientos verticales y circulares. La cantidad recomendada de muestras para tener resultados confiables debe ser no menor a 200 ml. Para la toma de las mediciones, se debe asegurar la limpieza del equipo uno de los factores ms importantes en la precisin de las medidas tomadas, luego de asegurarse de esto se enciende el equipo y es necesario esperar a que el mismo se encuentre listo para empezar a tomar la medidas, para esto se debe esperar a que se muestre el mensaje Analyzer ready, luego de esto se selecciona el modo de trabajo de acuerdo a las muestras a analizar, se pone la muestra preliminar en la probeta y se presiona el botn Enter; las medidas de esta primera muestra no se deben tener en cuenta, por ello se debe realizar un duplicado con muestra nueva para obtener resultados confiables. Despus de cada medida se debe limpiar el equipo con agua destilada y al momento de cambiar de tipo de muestra se debe realizar la limpieza con las soluciones de limpieza del equipo, para asegurar su conservacin y calibracin. Pretatamiento Bsico Durante experimentaciones anteriormente realizadas se encontr que el mejor esquema de pretratamiento para el trabajo con lacto suero, donde se remueve mayor cantidad de protenas es el siguiente [8] En este pre tratamiento se ha eliminado el procedimiento de filtracin debido a que la protena desnaturalizada del lactosuero despus del proceso de auto clavado presenta un buen tamao de floculo y puede removerse a travs de una centrifugacin a 6000 RPM por 15 minutos, si se llegara a presentar el caso de que el tamao del floculo fuese muy pequeo, la filtracin tendra que hacerse para no afectar las condiciones del sustrato final. Despus de realizado el ajuste de pH al de fermentacin (7), para fines acadmicos es necesario remover las sales que se precipitan mediante una centrifugacin a 12000 RPM, para evitar tener que centrifugar grandes volmenes de medio, se recomienda dejar reposar el medio despus del ajuste de pH durante varias horas y luego separar por decantacin el volumen rico en precipitado y el clarificado, luego, para recuperar medio lquido, se deber realizar la centrifugacin para separar completamente las sales formadas; todo lo anterior favorece a un mejor seguimiento de los microorganismos y condiciones de fermentacin. Por ltimo, para no tener que realizar un segundo auto clavado que podra degradar los azucares (Glucosa y Galactosa) que servirn como fuente de alimento para el Bacillus Megaterium y que incrementar los gastos energticos del proceso, ser necesario mantener las condiciones de asepsia en todos los pasos subsecuentes despus de la desnaturalizacin de la protena y la

hidrolisis de la lactosa, por lo tanto se recomienda mantener asptico (auto clavado) todo el material que se requerir para llevar a cabo los estudios necesarios.

Figura 3. Esquema de pretratamiento seleccionado

Pretratamiento fino Para este tipo de pretratamiento usado principalmente con fines acadmicos y para el correcto seguimiento de la cintica de crecimiento microbiana, se usara el mtodo de ultrafiltracin para separar correctamente tanto las protenas desnaturalizadas como las sales precipidadas durante el ajuste de pH. Ultrafiltracin La ultrafiltracin es el tipo de Filtracin que utiliza membranas para separar diferentes tipos de slidos y lquidos. El tamao de poro no es tan fino como en la Nanofiltracin y tampoco requiere tanta energa para efectuar la separacin, y es mas pequeo que el de las membranas de microfiltracin. La membranas de Ultrafiltracin estn dispuestas en forma de capilares y estn construidas con materiales plsticos que son porosos semipermeables

La Ultrafiltracin es capaz de concentrar slidos suspendidos, bacterias, algunas protenas, algunos colorantes y compuestos con un peso molecular mayor a 150,000 Daltons.[9] Como pretratamiento usando ultrafiltracin se propondra el esquema siguiente:

Lactosuero entero

Ultrafiltracin

Hidrolisis de la lactosa

Adicin del medio formulado

Autoclavado 121 C, 15 min

Ajuste de pH

Medio listo para fermentacin

Figura 4. Pretratamiento de lactosuero usando ultrafiltracin.

Esta primera propuesta de pretratamiento para la obtencin de un lactosuero ms puro, nos ayuda a mejorar las condiciones de la materia prima para el trabajo experimental en el laboratorio, donde se necesitan las mejores condiciones de trabajo, sobre todo al momento de realizar mediciones precisas. Consiste inicialmente en una ultrafiltracin, donde se espera remover la mayor cantidad de protenas y slidos suspendidos en el lactosuero, a continuacin se procede a realizar una hidrlisis de la lactosa presente en azucares ms simples, esta hidrlisis puede ser tanto acida, trmica o enzimtica, luego se debe realizar un ajuste de pH al valor deseado, se lleva al autoclave, para eliminar los microorganismos indeseados, finalmente se agrega el resto de los nutrientes necesarios al medio y se procede a realizar la fermentacin deseada.

Lactosuero artificial Para la formulacin de un lactosuero artificial se debe tener la caracterizacin de uno natural, del cual se pueda sacar el contenido de lactosa y adems tener conocimiento del medio formulado que se debe agregar para que los microorganismos tengas las fuentes de minerales necesarias para su crecimiento. De caracterizaciones realizadas con anterioridad en otros trabajos se presenta el contenido del lacto-suero natural y de igual manera los nutrientes y la cantidad necesaria a agregar para obtener el medio formulado. Tabla 1. Composicin de Lactosuero dulce y acido [10] Componente Lactosuero dulce [g/L] Lactosuero acido [g/L] Solidos totales 63,0 70,0 63,0 70,0 Lactosa 46,0 52,0 44,0 46,0 Protena 6,0 10,0 6,0 8,0 Calcio 0,4 0,6 1,2 1,6 Fosfatos 1,0 3,0 2,0 4,5 Lactato 2,0 6,4 Cloruros 1,1 1,1 Se sabe entonces que se debe tener una concentracin aproximada de glucosa del 5 % Tabla 2. Composicin del medio formulado REACTIVO Sulfato de amonio Fosfato dicido de potasio Fosfato cido de sodio Sulfato de magnesio heptahidratado FORMULA QUIMICA (NH4)2SO4 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4 7H2O 1 ml 10 2,25 1 0,5 2 0,23 0,2 10ml CANTIDAD (g/l) 1 1,5 9 0,2

Solucion elementos trazas Sulfato de hierro heptahidratado FeSO4 7H2O Sulfato de zinc Sulfato de cobre Sulfato de manganeso tetrahidratado Cloruro de calcio dihidratado Borato de sodio Molibdato de amonio cido clorhdrico 35% ZnSO4 7H2O CuSO4 5 H2O MnSO4 4H2O CaCl2 2H2O Na2B4O7.10H2O (NH4)2Mo7O24 HCl

REFERENCIAS 1. Jos J.B. Machado, J.A.C., Eugnia A. Macedo, Solidliquid equilibrium of a-lactose in ethanol/water. Solidliquid equilibrium of a-lactose in ethanol/water, 2000. 173: p. 121134. Scientific, T., Measuring Lactose in Milk: A Validated Method, Dionex, Editor. 2011. IMPLEMENTACIN DE METODOLOGAS ANALTICAS PARA DETERMINAR EL NIVEL DE DEGRADACIN DE LA CELULOSA EN SOPORTE PAPEL POR PROCESOS DE OXIDO REDUCCIN O HIDRLISIS. . 2006. Flix Amrita, C.R.F., Fernando Alkorta, Hybrid biosensors to estimate lactose in milk. Analytica Chimica Acta, 1997. 349: p. 153-158. Guzmn, M.B.J.J., Influencia de las protenas de la leche y su tratamiento

2. 3.

4. 5.

trmico en la actividad de la -galactosidasa de Kluyveromyces lactis, in Ciencias Biolgicas y de la Salud. 2003, Universidad Autnoma Metropolitana: IZTAPALAPA. p. 93.
6. 7. 8. Salamanca, Y.M., Produccin de PHB a partir de lactosuero. 2011, Universidad Nacional de Colomba: Manizales. Lac -S MILK ANALYZER Operation Manual, B. Germany, Editor. 2006: Hamburg. p. 91.

Rios, W.S.O.d.l., PRODUCCRIN DE PHB POR BACILLUS

MEGATERIUM UTILIZANDO LACTOSUERO SUSTRATO. . 2012, Universidad Nacional de Colombia: Manizales.

9.

COMO

S.A., A.y.A. Ultrafiltracin. Tecnologa de flitracin de membranas. 2011 01/08/2012]; Available from: http://www.ultrafiltracion.com.mx/.

10. ALAIS, CH. Ciencia de la Leche, Principios de la Tcnica Lechera. Editorial Revert

S.A. Espaa. 2003.