Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Biológicas

Terapia génica con shRNA encapsulada en liposoma

para el tratamiento de ebolavirus

Terapia génica
José Armando Conchos García 1991306
Adrián Mario Méndez Guzmán 1897091

14 de Mayo 2023, San Nicolás de los Garza, Nuevo León

 Introducción

Np: Nucleo Cápside

Proteína viral (VP35), (VP40),
(VP24), (VP30)
Glicoproteína (GP)
ARN polimerasa (L)

Familia Grupo V Forma helicoidal Tamaño

1 Filovirus
2 Balrimore
3 920nm y 80nm
4 19 kb

Jains S, et all. 2021

Cuadro Clínico

Rhein B. A., et all 2015

 Liposomas
Vehículo lipídico, que
consiste en un núcleo
acuoso
Interacción con material
genético a trasferir y las
membranas celulares
Baja inmunogenicidad
Se acopla al ácido nucleico
Su producción no es
costoso

Rojas M C , et all 2022

 Hipotesis

La terapia basada en liposomas otorga una mejor

entrega de shRNA logrando asi inhibir la síntesis de la
proteína L evitando la replicación de EBOV
 Objetivos
General
Diseñar un lipopolioplex con shRNA dirigido contra el gen de la proteina L
del virus del Ébola (EVOB) para inhibir la replicación del virus, consiguiendo
una terapia eficaz
Especificos
Producir y encapsular shRNA específico para la proteina L
Evaluar los efectos del shRNA in vitro en linea celular Vero
Plásmido

pCMV: Promotor de citomegalovirus

GFP: Proteína verde fluorescente
Kan/Neo: Genes de resistencia
Kanamicina y Neomicina
Poly A: Secuencia stop y secuencia
de poliadenilación
HSV TK Poly A: Señal de
poliadenilación timidin quinasa HSV
pUC Ori: Origen de replicación
pH1 promotor: RNA H1 polimerasa

Ausubel F. et al. (1994)

 Síntesis de liposomas

Cloruro de Sodio
5 min Fase oleosa
50%
surfactante

37 C 14,000 rpm

Thi E,P. et all 2015

Trasfección celular

Alfonso K J, Et all 2018

Western Blot
 RT-PCR
Forward: CGAACTTGACCATCTTGGACTTG
Revers: TCCTCGTCGTCCTCGTCTAGAT
Efecto citopatico

Eggers et all 2015

 Resultados
Efecto citopático

A B

A) Células control
B) Células + EBOV
C) Células + EBOV +
C D RNAscramble
D) Células + EBOV + shRNA
 Resultados
A B

A) Células con EBOV + shRNA

B) Células con EBOV + shRNA con luz UV
C D
C) Células con EBOV
D) Células con EBOV con luz UV
E) Células control
F) Células con EBOV + RNAscramble

E F
 Resultados
M 1 2 3 253kDA M 1 2 3 4 5
Proteína L

42kDA 60S
β-actina

Electroforesis en gel de agarosa de la proteína L.

Western blot de la proteína L.
M) marcador molecular, 1) control positivo, 2) control
M) marcador molecular, 1) muestra con EBOV, 2)
negativo, 3) muestra con EBOV, 4) muestra con
muestra con Scramble, 3) muestra con shRNA
Scramble, 5) Muestra con shRNA
Referencias
Alfson, K. J., & Griffiths, A. (2018). Development and Testing of a Method for Validating Chemical Inactivation of Ebola Virus. Viruses, 10(3),
126. https://doi.org/10.3390/v10030126
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., and Struhl, K. (1994). Current Protocols in Molecular Biology
Eggers, Maren & Eickmann, Markus & Kowalski, Katharina & Zorn, Juergen & Reimer, Karen. (2015). Povidone-iodine hand wash and hand
rub products demonstrated excellent in vitro virucidal efficacy against Ebola virus and Modified vaccinia virus Ankara, the new European
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expression-and-silencing/shrna-process-and-shrna-diagram
Rhein, B. A., Powers, L. S., Rogers, K., Anantpadma, M., Singh, B. K., Sakurai, Y., Bair, T., Miller-Hunt, C., Sinn, P., Davey, R. A., Monick, M. M.,
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https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005263
Jain, S., Martynova, E., Rizvanov, A., Khaiboullina, S., & Baranwal, M. (2021). Structural and functional aspects of Ebola virus proteins.
Pathogens, 10(10), 1330. https://doi.org/10.3390/pathogens10101330
Thi, E. P., Mire, C. E., Lee, A. C. H., Geisbert, J. B., Zhou, J. Z., Agans, K. N., Snead, N. M., Deer, D. J., Barnard, T. R., Fenton, K. A., MacLachlan, I.,
& Geisbert, T. W. (2015). Lipid nanoparticle siRNA treatment of Ebola-virus-Makona-infected nonhuman primates. Nature, 521(7552), 362–
365. https://doi.org/10.1038/nature14442