PRÁCTICA 7.

OBTENCIÓN DE LOVASTATINA A PARTIR DEL ORGANISMO

FÚNGICO ASPERGILLUS TERREUS

1.1 Objetivo general

Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico en los procedimientos generales para

la obtención de principios activos de interés terapéutico a partir de organismos fúngicos
selectos.

1.2 Objetivos particulares

1. Fermentar en medio sólido a la especie fúngica Aspergillus terreus Thom

(Trichocomaceae) utilizando las técnicas microbiológicas apropiadas.
2. Preparar el extracto orgánico a partir del cultivo sólido aplicando las técnicas de
maceración y de partición.
3. Establecer la identidad química del constituyente de importancia terapéutica presente
en el extracto orgánico, la lovastatina, mediante la comparación de sus propiedades
fisicoquímicas y cromatográficas con aquellas de una muestra auténtica.

1.3 Antecedentes

Aspergillus es un género de hongos filamentosos perteneciente a la Clase Ascomycota.

Estos organismos se caracterizan por tener reproducción sexual o asexual, además de
ser es uno de los principales productores de micotoxinas, metabolitos secundarios
producidos y secretados por el hongo durante el proceso de degradación de la materia
orgánica y como mecanismo de defensa contra otros microorganismos. La especie
fúngica Aspergillus terreus (Figura 1), es un organismo saprótrofo de climas cálidos,
particularmente de regiones tropicales y subtropicales, y que se utiliza ampliamente en
la industria para producir ácidos orgánicos importantes, tales como el ácido itacónico,
cis-aconítico y aspártico, así como algunas enzimas, como la xilanasa. En la industria
farmacéutica su uso es de particular interés para la obtención de la lovastatina (Figura
1), fármaco inhibidor de la HGMO reductasa y utilizado para disminuir los niveles de
colesterol en sangre (Goswami et al., 2012). Cabe destacar que este metabolito fúngico
fue la primera estatina aceptada por la US Food and Drug Adminstration (FDA) en 1987
para su uso clínico como agente hipocolesterolemiante (Jahromi et al., 2012).

1.4 Procedimiento experimental

1.4.1 Preparación del cultivo en pequeña escala

A partir de un cultivo axénico del microorganismo objeto de estudio, Aspergillus terreus

(ATCC 20542), se inoculan 15 mL del medio líquido YESD que contiene extracto de
levadura (1%), peptona de soya (2%) y dextrosa (2%), y se fermenta durante 5 días a
temperatura ambiente y en agitación constante (100 rpm), con la finalidad de incrementar
la biomasa. Transcurrido este período de incubación, el cultivo líquido se vierte sobre un
sustrato sólido estéril compuesto por arroz (15 g de arroz/30 mL agua), contenido en un

Práctica 7
matraz Erlenmeyer de 250 mL. El proceso de fermentación se realiza durante 21 días a
temperatura ambiente y con fotoperiodos de luz-oscuridad 12/12 horas.

A) B)

HO O
H
O
O

O
H

Figura 1. Aspergillus terreus (ATCC 20542) (A) y estructura de la

lovastatina (B).

1.4.2 Preparación del extracto orgánico

La preparación del extracto orgánico a partir del cultivo en pequeña escala obtenido en
el inciso 1.4.1 se realiza mediante un proceso de maceración con 100 mL de una mezcla
CHCl 3 -MeOH 1:1 y con agitación constante (100 rpm) durante 8 horas. Al término de la
maceración, el extracto resultante se filtra al vacío en un embudo Büchner, se agregan
80 mL de H 2 O y se somete a un proceso de partición. La fracción orgánica se concentra
a presión reducida. El residuo obtenido se resuspende con 60 mL de una mezcla de
ACN-MeOH (1:1) y se somete a un proceso de reparto con hexano (2 × 60 mL). Las
soluciones de hexano se descartan y la solución de ACN-MeOH se concentra a presión
reducida hasta sequedad.

1.4.3 Análisis cromatográficos del extracto orgánico

El extracto orgánico seco obtenido en el inciso 1.4.2 se analizará mediante cromatografía

en capa fina (TLC) y de líquidos de ultra eficiencia (UPLC) acoplada a espectrometría de
masas por electroespray (ESIMS). Como referencia se empleará a la lovastatina (Sigma-
Aldrich PHR1285).

1.4.3.1 Análisis por TLC

Soporte: Gel de sílice F 254 Merck.

Fase móvil: CH 2 Cl 2 -AcOEt (7:3).

Práctica 7
Preparación de la muestra: Se disuelven 5 mg del extracto orgánicos seco de A. terreus
en 1 mL de MeOH.
Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de la referencia de lovastatina
en 0.5 mL de MeOH.
Revelador: Solución cromógena de sulfato cérico amoniacal.
Procedimiento: (1) Se aplican sobre la superficie de la placa el extracto orgánico y la
referencia correspondiente en forma de banda y con la ayuda de un capilar, en carriles
independientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá
existir una separación de por lo menos 10 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el
proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la
cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254
y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Se rocía la
cromatoplaca con solución reveladora y se calienta hasta la aparición de manchas
coloridas. Las bandas correspondientes a la muestra y referencia deben coincidir en su
posición (R f ) y coloración.

1.4.3.2 Análisis por UPLC-ESIMS

Para los análisis por UPLC-ESI-MS se utilizará una columna Acquity BEH C18 (100 ×
2.1 mm i,d., 1.7 µm), utilizando como fase móvil un gradiente de CH 3 CN (A) y ácido
fórmico 0.1% acuoso (B): 0 min 15% A; 8 min 100% A; 9.5 min 100% A; 10 min 15% A;
Flujo: 0.3 mL/min; volumen de inyección: 3 μL y una longitud de onda de detección de
254 nm. El sistema cromatográfico esta equipado con un detector de arreglo de diodos
(PDA) y un detector de masas Waters SQD2 (cuadrupolo simple) con ionización por
electroespray y detección en modos positivo y negativo (ANEXO). Las condiciones de
análisis son las siguientes: electroespray en modo positivo (ESI+); Voltaje Capilar 3.0 kV;
Voltaje Cono 35 V; Temperatura Desolvatación: 350°C; Gas Desolvatación N 2 : 300 L/hr;
Gas Cono: 10.0 L/hr.

1.5 Resultados

1.5.1 Elabore un diagrama de flujo que sintetice el proceso de obtención del extracto
fúngico, en particular, analice el uso del hexano durante este proceso.
1.5.2 Analice los resultados obtenidos a partir del análisis del cromatograma realizado.
Calcule los correspondientes factores de retención (R f ) del componente mayoritario
presente en el extracto fúngico analizado. Compare los valores observados para las
muestras analizadas e indicar si el extracto contiene al producto utilizado como referencia.

1.6 Bibliografía

- Goswami S., Vidyarthi A.S., Bhunia B., Mandal T. A review on lovastatin and its
production. Journal of Biochemical Technology, 4, 581-587, 2012.
- Jahromi M.F., Liang J.B., Ho Y.W., Mohamad R., Goh Y.M., Shokryazdan P. Lovastatin
production by Aspergillus terreus using agro-biomass as substrate in solid state
fermentation. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, 1-11, 2012.

Práctica 7
1.7 Material y equipo

Número de sesiones: 1

1.7 Material y equipo

Número de sesiones: 1

Material
1 rotaevaporador placas cromatográficas de aluminio de
20 × 20 cm
1 probeta graduada de 100 mL bomba de aspersión
2 vaso de precipitado de 250 mL aspersor
1 espátula cromo-níquel algodón
1 embudo de filtración rápida lámpara de luz UV
1 embudo Büchner papel aluminio
1 vidrio de reloj capilares
3 pipeta Pasteur con bulbo agitador
2 pinza de tres dedos con nuez asa microbiológica
1 matraz Kitasato bisturí
2 matraz Erlenmeyer de 250 mL caja de Petri con el cultivo fúngico ATCC
20542 en medio PDA
Reactivos
lovastatina (Sigma-Aldrich PHR1285)
hexano (C 6 H 14 )
cloroformo (CHCl 3 )
acetonitrilo (CH 3 CN)
acetato de etilo (AcOEt)
diclorometano (CH 2 Cl 2 )
metanol (CH 3 OH)
sulfato cérico amoniacal (NH 4 ) 4 Ce(SO 4 ) 4 -2H 2 O
arroz comercial
medio YESD (extracto de levadura, peptona de soya y dextrosa)

Práctica 7
 Anexo

Cromatograma en capa fina del extracto orgánico (a) de A. terreus, co-elución

(b) y referencia de la lovastatina (c): UV (254 nm) (izq.), UV (365 nm) (centro), y
con solución cromógena de sulfato cérico amoniacal (der.).

Práctica 7
A

Cromatogramas de UV (254 nm) (A) y de corriente total de iones (TIC) por ESI en
modo positivo (B) del extracto orgánico de A. terreus; y de la lovastatina (t R 7.4 min)
((C) y (D), respectivamente).

Práctica 7
A

Espectro de masas ESI+ (A) y en el UV (B) de la lovastatina (t R 7.4 min, m/z 405.8
[M+H]+).

Práctica 7