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espectrofotometría UV

Análisis cualitativo por
Espectrofotometría UV de fármacos
de abuso en plasma.
Cepeda, A.; Paseiro, P. y Simal, J.

Palabras clave: Sep Pak C18, espectroscopía UV, barbitúricos, ácido salicílico, cafeína, teofilina.
Se propone un método rápido y sencillo para la determinación cualitativa en plasma de barbitúricos
(amobarbital, aprobarbital, barbital, butabarbital, butalbital, dial, fenobarbital, pentobarbital y secobarbital), ácido salicílico, cafeína y teofilina, basado en un proceso de purificación de la muestra mediante la utilización de las minocolumnas Sep PakR C18 y el examen del residuo al UV.
A quick and simple method is proposed for the qualitative determination of sorne Barbiturates in plas- ·
ma (Aprobarbitone, Amylobarbitone, Barbitone, Dial, Pentobarbitone, Phenobarbitone, Qinalbarbitone, Secbutotabarbitone and Talbutal), Salicylic acid, Cafeine and Theophylline. This method is based
on the purification process of the example by the use of the cartridge Sep Pak™ C18 and the examination of the purified at the spectroscopy UV.

Introducción
El incesante incremento del uso de medicamentos ha hecho que a parte de los beneficios obtenidos por su utilización se produzcan envenenamientos e intoxicaciones, siendo los barbitúricos los fármacos más frecuentemente implicados en sobredosis agudas tal y como lo demuestran Frati y colabs.
(1983) en un estudio en España durante los años

Departamento de Química Analitica, Nutrición y
Bromatología.
Universidad de Santiago de Compostela.

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• 1

1974-1980. Otros fármacos, como los salicilatos, han
sido causantes de intoxicaciones accidentales principalmente en niños menores de 5 años (Levine,
1982).
La necesidad de procedimientos analíticos rápidos para la identificación de fármacos a niveles
tóxicos ha hecho que se apliquen numerosas técnicas analíticas en el campo de la Toxicología Forense, entre ellas, la espectrofotometría UV, descrita ampliamente en la bibliografía. Clarke (1969); Corner
(Fiorey, 1972); Jain y Cravey (1974) la aplican para
determinar barbitúricos en materiales biológicos mediante el desplazamiento del máximo de absorción
a diferentes valores de pH . Gupta y Lundberg (1973)
determinan teofilina en sangre en presencia y ausen-

técnicas de LABORATORIO • no 141

9535.5 mm de diámetro interno. dial.1 mg. . aprobarbital. -Indicador de pH universal Merck art.7 Parte experimental Material y aparatos - Minicolumnas de fase «reversa•• Sep Pak C18.Se preparan de manera que cada mi contenga el nivel tóxico del fármaco correspondiente para 2. butabarbital. -Balanza analítica que aprecie hasta 0. art. pentobarbital. 1976) y las más recientes como son las minicolumnas de fase «reversa» Sep Pak C18 (AIIan y colabs.5 mi de plasma técnicas de LABORATORIO • n• 141 190 220 250 280 310 340 nm Figura 1. Otros autores utilizan columnas de purificación basadas en principios cromatográficos como son las resinas XAD-2 (Eiahi. .Bomba de vacío. 39 . fenobarbital). de espesor.Soluciones patrón concentradas de cada fármaco en hidróxido sódico 0. 1983) analiza cafeína en suero midiendo la absorbancia a 273 nm.Baño María. Serva (teofilina). los procesos de purificación del plasma son muy variados. Así mismo. secobarbital. 51910) . Para la realización de este trabajo hemos combinado la purificación de la muestra con minicolumnas Sep Pak C18 y la determinación cualitativa en plasma de varios fármacos de abuso mediante espectrofotometría UV. Merck (cafeína).Espectrofotómetro UV Hitachi modelo 100-60 y registrador Hitachi de doble canal modelo 561 .Material de uso común en el laboratorio. columnas Extrelut (Breiter y colabs. . Barcia (barbital. Routh (Sunshine.. amobarbital. . 1980). barbitúricos.1N. Espectro de absorción al UV de un "blanco de plasma».espectrofotometría UV cía de. Sandoz (butalbital). -Tubos de centrífugas de fondo conico graduados de 10 mi.Jeringa de vidrio de capacidad 5 mi con aguja hipodérmica de 8. 1980). (Watters. -Centrífuga que alcance 4000 rpm. White y Graves (1974) extraen con cloroformo y reextraen con hidróxido sódico para separar fármacos áci9os y neutros. 0. . Reactivos Los reactivos utilizados son de calidad analítica y todos los fármacos empleados cumplen las normas USP XIX/BP proporcionados por Analar (ácido salicílico). -Cubetas apareadas de cuarzo de 1 cm.5 cm de longitud y 0.

e < i.2 mu estr2 1 ~ 1 0. 1 190 220 250 2 80 310 340 nm 190 220 250 280 310 34 0 nm Figura 2. :¡ ¡ 40 técnicas de LABORATORIO • n° 141 1 .1 0.pH= _ '1 1 pH = 1 0 1 1 1 \ o .e < ::. 0.g comparado con su espectro patrón para cada componente.3 patrón \\ 1 1 1 cr.4 l 0.7 _____ . Espectro de absorción al UV del grupo de Jos barbitúricos obtenido de muestras de plasma sobrecargadas con 125 p.3 1 1 1 1 1 1 l 1 1 A240 1 1 1 '1 1 ' 1 0.1 o. . .2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.51 1 1 1 1 0.p H= 0.6 1 0.5 A240 1 1 1 1 1 0. 1 0.¡ l r 1 espectrofotometría UV 0.4 1 1 1 cr.61 r H= 1 0 - -----..

.2.5 p..1 1 1 1 1 1 1 1 1 \~ f ...3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ~~ 1 .0 1 ::::> 1 i 1 1 1 '1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l1 1 \1 0.1 1 11 11 1 \' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.p H = 10 1 0. 1 1 1 1 1 .6 1 1 1 1 0. \ 1! 1 0. 1 1 1 1 1 1 1 cr.7.. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 37.!J '11 1 ~ !1 1 1 190 220 250 2 8 0 310 340 nm 1 1 1 l~~ 1 1 190 220 250 280 310 340 nm Figura 3.p H = 10 .pH= 1 1 1 . 1 1 < 1 1 1 1 1 1 cr... . técnicas de LABORATORIO • n° 141 41 . 1 1 0...4 1 1 1 1 1 1 1 1 J 1 < 1 ' 1 1 :::::> patrón 1 1 1 1 .6 0..3 0.2 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.. 0. A274 1 1 1 ____ _pH= • 1 1 A270 1 A274 ' ~~~ ____ .5 0.5. 1 1 muestre. • 1' o.espectrofotometría UV (' :\ A270 . 7_ '1 0.g de cafeína comparado con su espectro patrón.

......2 1 1 1 1 1 '1' 1 1 1 1 ' ' ' 1 1 1 1 1 1 1 ' 1 l \ 0.. ..¡g/mi salicílico.o < ::::> 11 1 0... .5 '1 0....7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ----................. . ..........¡g/mi 50 ¡.. .¡g/ml cafeína . .....4 A273 1 muestra 1 1 1 1 1 1 Cll .4 patrón 1 1 1 1 1 Az73 0.¡g/mi teofilina .e -..1N y 0....... ... ..... El plasma se descongela en baño de técnicas de LABORATORIO • n° 141 1 f 1 i t ...Plasma humano fresco congelado de donante único proporcionado por el Hospital General de: Galicia. barbitúricos ..... .7 0. .. .. ...... 500 ¡..Se preparan por dilución 1 a 10 de las anteriores 42 y ajustadas a pH 10. ......... (Stead y Moffat.. ....3 ' Cll 1 1 1 1 1 0...pH= 1 -p~!= 10 1 1 1 1 o. ácido . ....s 0.. ....... -Metano! -Etanol -Hidróxido sódico 0...espectrofotometría UV 0....pH= 1 0. ..5 ¡.. ..6 0. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 50 pg de teofilina comparado con su espectro patrón...01N....3 1 1 1 1 1 1 1 1 0.. 1983). 1 1 l 190 220 250 280 310 340 nm 190 220 250 280 310 340 nm Figura 4.... ..2 1 1 1 1 'l 1 1 1 1 1 o.... 125 ¡...1 1 0..Soluciones patrón de trabajo de cada fármaco.. . < ' ... . 37.6 -pH=10 1 1 1 ----.

-.2 0.6 -pH= 10 1 r. 1 :\ (:..2 o' 1 o.4 ____ pH= A235 \ 1 .. -Acondicionamiento de las minicolumnas de fase «reserva» Sep Pak C18: Se pasa a través de la minicolumna 5 mi de metano! seguidos de 5 mi de agua destilada y 5 mi de técnicas de LABORATORIO . se lava el tubo con 5 mi de agua acidulada a pH 3.7 . 1 1 1 - ' r~ 1 (/) 1 .e < 0. Preparación de las muestras de plasma tipo. -Purificación con las minicolumnas Sep Pak C18. ·Al objeto de eliminar el agua contenida en el volumen muerto de la minicolumna se realiza una pequeña succión a vacío. 1 190 220 250 280 310 340 190 220 250 280 310 340 nm nm Figura 5.p H = 10 0.O • -1 i 0.3 1 0.Para cada fármaco se añade 1 mi de solución patrón concentrada a 2. se recoge el sobrenadante con la jeringa.5 mi de plasma y se diluye hasta 5 mi con agua destilada. La solución de plasma se acidifica con 4-5 gotas de ácido clorhídrico 1N hasta pH aproximadamente de 3.3 1 . - agua a 30 °C. 5 1 ____ _pH= '. Espectro de absorción al UV de una muestra de plasma sobrecargada con 500 pg de ácido salicílico comparado con su espectro patrón. Posteriormente se eluye con 2 mi 43 .L 0. La muestra y las aguas de lavado se pasan a través de la minicolumna Sep Pak C18 a razón de 2 ml/min. se centrifuga a 4000 rpm durante 5 min .4 muestra 1 l 1 1 0.. Procedimiento Con la muestra de plasma.n• 141 agua acidulada a pH 3 con ácido clorhídrico.J patrón 0.. 61 .5 1 1 1 11 1 11 1 1 1 11 i 11 1 \: 1 1 1 1 0.

l. Resultados Las Figuras -1 a 5. 6.. 183. 4..N. J.Breiter. Ed. El ácido salicílico da un máximo de absorción a 300 nm a pH 10 y pH 1.. Ed.C. 219-224.Stead. Martin. Florida).. J. En los barbitúricos. 12. 3. D.Gupta. Toxico!. N. (1972): ccSecobarbital sódiCO». J. of Chromat. En las Figuras restantes se recogen los espectros obtenidos de las soluciones patrón diluidas de cada uno de los fármacos estudiados así como los espectros de absorción a que han dado lugar las muestras de plasma tipo. 3.. Farmacología: acciones y reacciones medicamentosas». (1980&: ccTwo HPLC determinations for Mebendazole and its metabolites in human plasma using a rápid Sep Pak C18 extraction••. lo que permite detectar de una manera rápida y sencilla los componentes estudiados.. J. (1969): cclsolation and identification of drugs"..s. A. chromat. J. páginas 57-60. Sci. A. en Methodology for Analytical Toxicology. USA).. Ed.C.. (1973): ccQuantitative determination of Theophylline in blood by dipherential spectrophotometry. Con los patrones. (1983): ccAcute severe poisoning in Spain: Clinical outcome related to implicated drugs». Anal. 625-632. 2403-2405. Cravey.representan los espectros de absorción al UV obtenidos a pH=10 (línea continua) y pH=1 (línea punteada). 7. 7. M. Human Toxico!.. London.. y Moffat. L. R. .. N..Allan..espectrofotometría UV de etanol y la solución alcohólica se evapora a sequedad en un Baño María.. R. páginas 98-100. Se obtienen directamente los espectros a pH 10 y pH 1 con las soluciones patrón de trabajo.Frati. Florey (Academic Press. En la Figura -1. H. K. La cafeína y teofilina presentan máximos de absorción en la zona en la que absorbe la interferencia plasmática. (1974): «The identification of barbiturates from biological specimens»... J. 10. Sci. Helger.. Forensic Sci. y Lundberg... Anal. Con la solución anterior se consiguen los espectros a pH 10 y a pH 1 (acidificando con ácido clorhídrico 1N) entre 340 y 190 nm. 11.Levine. -Obtención de los espectros. 5. Chem.. Marruecos.T.Jain. Human Toxico!. J. R. (1983): ceA collection of therapeutic toxic and fatal blood drugs concentration in man .E. 311-319. mas que la utilización de las minicolumnas Sep Pak C18 dan lugar a una purificación satisfactoria de las muestras de plasma. . Goodman.C.. 45. 12.1 mi de hidróxido sódico 0. 437-464... (1983): ccCaffeíne. Ed. técnicas de LABORATORIO • no 141 .. este mismo efecto se produce en las muestras de plasma tipo. Barcelona. Porta. así mismo. Salva!. Páginas 343-345. M.. A la vista de los resultados obtenidos..Elahi.Routh. J.01N y se diluye a 10 mi ajustando el valor de pH a 10. El residuo obtenido se disuelve en 0. concluí- 44 Bibliografía 1.Corner. H. R.. y Graves. Agradecimientos · Nuestro reconocimiento al Hospital General de Galicia por habernos facilitado de forma gratuita el plasma para realizar las muestras.L. Sunshine (CRC Press. 2. M.. 8. Lang..H. lo que hace posible su detección.R. Se puede detectar la presencia de estas sustancias (a sus niveles tóxicos) por el incremento cuantitativo que se produce en los valores de absorbancia con relación al ccblanco de plasma. E. of Chromat.. Además en el caso de la teofilina se produce un desplazamiento del máximo de absorción de 274 nm (pH 10) a 270 nm (pH 1). 2. Por último se comparan los espectros obtenidos para la muestra con los patrones respectivos. (1976) ccThe detection of sedative/hypnotics drugs in the impaired driver». (1982): . M. Laporte. J.White. sin embargo no se ha observado el máximo de absorción a 235 nm a pH ácido como aparece en el patrón. página 323... 12.. Discusión El ccblanco de plasma" da lugar a una interferencia plasmática con un máximo de absorción a 273 nm que no depende del pH del medio.se recogen los correspondientes a un ··blanco de plasma . 1. (1980): ccEncapsulated XAD-2 extraction procedure technique for a rápid screening of drugs of abuse in urine». 9. (14).. 228-231.Clarke. agradecemos a la firma comercial Sandoz por suministrarnos también de forma gratuita el fármaco butalbital. The Pharmaceutical Press. H (1976): ccEvaluation of column extraction: A new procedure for analysis of drugs in blody fluids». 4. se observa que en los patrones desaparecen el máximo de absorción al cambiar la solución de pH 10 a pH 1. R.. en Analitical Profiles of Drugs Sustances. 26-30. . H. 131-140. debido a la presencia de fondo interferente plasmático.