Método HPLC-PDA validado para la determinación de hibalactona en partes subterráneas de

Hydrocotyle umbellata y su optimización de extracción asistida por ultrasonido

resumen

En este trabajo, desarrollamos y validamos un método de HPLC-PDA para la cuantificación de

hibalactona en Hydrocotyle umbellata L., Araliaceae, extractos de partes subterráneas y
optimizamos su extracción asistida por ultrasonido. Se llevaron a cabo separaciones
cromatográficas con una fase móvil isocrática de acetonitrilo/metanol/agua (10:65:25), un
flujo de 0,8 ml min-1, detección a 290 nm y una columna C18 (250 × 4,6 mm, 5 um). Los
parámetros de validación del método se determinaron de acuerdo con la legislación brasileña.
La optimización de la extracción asistida por ultrasonido de hibalactona se realizó utilizando la
metodología de diseño y respuesta de superficie de Box-Behnken. El método de HPLC para la
cuantificación de la hibalactona demostró ser selectivo, lineal, preciso, exacto y robusto,
siendo útil para el análisis de la hibalactona en extractos de partes subterráneas de H.
umbellata. Las condiciones óptimas de extracción asistida por ultrasonido se obtuvieron con
una relación sólido/líquido de 1:5 g ml-1, una fuerza etanólica del 70% (v/v) y una temperatura
de 65 ◦C. Los resultados pueden servir de apoyo para el control de calidad y la normalización
de las materias primas de H. umbellata.

Introducción

Hydrocotyle umbellata L., Araliaceae, también conocida como acaricoba, es una especie
herbácea originaria del continente americano que crece principalmente en suelos húmedos
(Lorenzi y Matos, 2002; Snedden y Steyer, 2013). Acaricoba es una planta con múltiples
aplicaciones en los campos de la fitorremediación acuática, la cosmética y la medicina (Reis y
otros, 1992; Sooknah y Wilkie, 2004; Rocha y otros, 2011). Esta especie también se reconoce
en la medicina popular y ayurvédica (india) debido a sus efectos ansiolíticos (Ficher et al.,
1994).

Los compuestos activos de la acaricoba de los que se ha informado incluyen flavonoides,

saponinas, taninos, poliacetilenos, lignanos y aceites esenciales en las hojas y las partes
subterráneas (Martins y otros, 2008; Rojas y otros, 2009; Oliveira y otros, 2017). En un
trabajo reciente se demostró que la hibalactona de lignanos, aislada de las partes subterráneas
de la planta, era el posible compuesto activo responsable de los efectos antinociceptivos,
antiinflamatorios y de tipo ansiolítico de la especie (Oliveira et al., 2017).

hibalactona (1), también conocida como sabina, es un lignano dibencilbutirolactona presente

principalmente en las especies de plantas leñosas (Takaku et al., 2001). Además de la actividad
relativa a la H. umbellata, la hibalactona presenta un amplio espectro de actividades
biológicas, como propiedades insecticidas (Matsubara, 1972), antimicrobianas (Bastos y otros,
1999), antitumoral (Chang y otros, 2000), antiestrogénica (Lee y otros, 2005), la actividad
anticolinesterásica y neuroprotectora (Yoon y otros, 2008; Jung y otros, 2015).

Debido al potencial medicinal de la hibalactona, se desea un método analítico apropiado para

su determinación para los extractos estandarización de especies como H. umbellata, así como
por su bioproductos. Sin embargo, hay una falta de estudios que informen de que abordan los
métodos analíticos para la determinación de la hibalactona. Sólo se desarrolló un método LC-
MS/MS para su determinación, sin embargo, para el material biológico (Song et al., 2012). La
HPLC ha sido descrito como un método de elección para el análisis de lignanos en planta
material, además de ser accesible a la mayoría de los laboratorios (Willfor y otros, 2006).

Por otra parte, las fuentes naturales a menudo no proporcionan comercialmente cantidades
de lignanos (Calvo-Flores et al., 2015), que impide la obtención de materias primas de H.
umbellata rica en la hibalactona. En consecuencia, un método de extracción eficiente y una
investigación de los factores involucrados en la extracción de hibalactona del material vegetal
son necesarios.

Los métodos clásicos, como la maceración, la percolación y el reflujo, se suelen notificar en los
estudios de extracción de hibalactona (Lim y otros, 2009; Cuca-Suarez y otros, 2015; Jung y
otros, 2015). Sin embargo, en los últimos años, algunos autores han empleado la extracción
asistida por ultrasonido (EAU) para extraer hibalactona de diversas especies de plantas (Yoon
et al., 2008; Jeong et al., 2014). A pesar de ello, todavía no se ha informado de ningún estudio
de optimización de sus EAU. En los Emiratos Árabes Unidos, el fenómeno de la cavitación
provoca la ruptura de la pared celular, reduciendo así el tamaño de las partículas y
aumentando la transferencia de masa a través de la membrana, lo que lo convierte en un
método rápido y eficaz (Luque de Castro y Piegro-Capote, 2007; Wang et al., 2013). El objetivo
del presente estudio fue desarrollar y validar un método de HPLC-PDA para la cuantificación de
la hibalactona en los extractos de las partes subterráneas de H. umbellata y optimizar los EAU
de este lignano en las materias primas de H. umbellata.

Materiales y métodos

Productos químicos y reactivos

Hexano P.A. (Neón), diclorometano (Química), acetato de etilo 99,5% P.A. (Neón) y metanol
P.A. (Neón) se utilizaron en la columna cromatografía (CC). El CDCl3 99,8% se utilizó para el
análisis de RMN. El La hibalactona utilizada como estándar en el análisis HPLC fue aislada en
nuestro laboratorio para este propósito. Metanol (Tedia, grado HPLC), acetonitrilo (Tedia;
grado HPLC) y agua filtrada a través de un Milli-Q (Millipore) se utilizaron en preparaciones de
muestras y de fase móvil para el análisis de HPLC.

Aparato

La cromatografía en columna se realizó en gel de sílice G60 (0,05-0,2 mm, Vetec, Brasil). Las
fracciones fueron monitoreadas por cromatografía en capa fina (TLC) usando gel de sílice F254
(Vetec) y gel de sílice CC 60G 0.05-0.2 mm (Vetec). Para observar los constituyentes químicos
en las placas de TLC se utilizó luz ultravioleta a 254 y 365 nm, lo que reveló una solución de
ácido sulfúrico y vainillina seguida de calentamiento. Se obtuvieron los espectros de RMN 1H
(500 MHz) y RMN 13C (125 MHz), así como datos de HSQC y HMBC en un espectrómetro
Brüker Avance III. En los EAU se utilizó un dispositivo ultrasónico (USC 1800A, 40 kHz, Uniques)
equipado con un temporizador digital y un controlador de temperatura. Se realizaron
separaciones cromatográficas utilizando una columna de fase inversa Zorbax Eclipse XDB-C18
(250 × 4,6 mm, 5 um). Se utilizó un Waters Alliance con un módulo de separación e2695, un
detector de matriz de fotodiodos (PDA) 2998 y el software Empower (versión 2.0). Las fases
móviles se filtraron a través de una membrana de PVDF de 0,45 um (Merck) y se desgasificaron
mediante un baño de ultrasonidos. Las muestras y las soluciones analíticas estándar se
filtraron previamente a través de una membrana de PTFE de 0,45 um (Millex).

Material vegetal

Hydrocotyle umbellata L., Araliaceae, las partes subterráneas se recogieron entre diciembre de
2013 y enero de 2014 en el Jardín de Plantas Medicinales de la Facultad de Farmacia de la
Universidad Federal de Goiás, situado en 16◦40'33''S y 49◦14'39''O a una altitud de 768 m
sobre el nivel del mar. La autenticidad del material vegetal fue verificada por el Dr. Heleno Dias
Ferreira y el Dr. José Realino de Paula, se depositó una muestra de comprobante en el
Herbario de la Universidad de Goiás con el número de registro UFG-22394. El material se lavó
con agua, se secó en el 40 ◦C y se molió en un molino de Willye. El polvo se refrigeró a -6 ◦C y
se almacenó en contenedores capaces de proporcionar protección contra la humedad y la luz.

Extracción, fraccionamiento y aislamiento

El extracto etanólico se obtuvo por maceración con agitación, empleando 400 g de material en
polvo y 2 l de etanol al 95% (v/v) como disolvente extractor, durante 4 h. Para obtener un
proceso extractivo eficiente, la maceración se realizó más veces, obteniéndose así el extracto
etanólico crudo, que se concentró en un evaporador rotativo (MA 120, Tecnal) en 40 ◦C y
después se almacenó en -6 ◦C lejos de la luz. El extracto crudo (30 g) se disolvió en 250 ml de
solución de metanol-agua (7:3). La mezcla fue sometida a partición líquido-líquido con
disolventes de polaridad cada vez mayor (es decir, hexano, DCM y EtOAc) (Ferri, 1996). La
hibalactona se aisló de la fracción de DCM (1,5 g) según Oliveira y otros (2017), lo que da 25
mg de sustancia pura. RMN 1H, RMN 13C, HMBC y HSQC Se utilizaron datos espectrales para
identificar el compuesto aislado.

Análisis HPLC-PDA

Ensayos preliminares para el desarrollo del método HPLC-PDA El método analítico HPLC-PDA
para la cuantificación de la hibalactona en los extractos se desarrolló sobre la base de los
trabajos anteriores de Schmidt y otros (2006) para identificar este marcador, variando la
composición de la fase móvil (acetonitrilo/metanol/agua) y los flujos que van de 0,5 a 1 ml
min-1. Para evaluar las condiciones de la prueba, se analizaron un estándar de hibalactona
(200 ug ml-1 en metanol) y un extracto etanólico de las partes subterráneas de H. umbellata.
El volumen de la inyección fue de 10 ul y los experimentos se realizaron por triplicado. Para la
proposición de este método se emplearon las condiciones que proporcionaron la mejor
separación de hibalactona del extracto etanólico de la planta.

Instrumentación y condiciones cromatográficas

El sistema de HPLC consistía en una Alianza de Aguas con un módulo de separación e2695 y un
detector de matriz de fotodiodos (PDA) 2998. La adquisición de datos se realizó utilizando el
software Empower (versión 2.0). Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo
utilizando una columna de fase inversa Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 × 4,6 mm, 5 um). La
columna de temperatura se mantuvo como 25 ◦C y el volumen de inyección fue de 10 ul. Se
obtuvo una separación satisfactoria con una fase móvil isocrática con
acetonitrilo/metanol/agua (10:65:25) a un flujo de 0,8 ml min-1. La longitud de onda de
detección fue de 290 nm. Las fases móviles fueron previamente filtradas a través de una
membrana de PVDF de 0,45 um (Merck) y desgasificadas utilizando un baño de ultrasonidos.

Preparación estándar

Para preparar las soluciones estándar, 8,15 mg de hibalactona aislada

se disolvieron en metanol y luego se diluyeron a 10, 25, 50, 100, 150 y 200 ug ml-1. Antes de la
inyección en el sistema de HPLC, las soluciones

fueron filtrados a través de una membrana de PTFE de 0.45 um (Millex)

Preparación de la muestra

Para evaluar el desarrollo y la validación del método, se extrajeron por ultrasonido 2 g de las
partes subterráneas de H. umbellata secadas en polvo con 20 ml de etanol al 80% (v/v)
durante 30 min en 25 ◦C. Antes de la inyección en el sistema de HPLC, la solución se filtró a
través de una membrana de PTFE de 0,45 um (Millex).

Prueba de idoneidad del sistema

Los parámetros de idoneidad del sistema para el pico de hibalactona (factor de cola -TF,
resolución - Rs y número de placas teóricas - N) se evaluaron de acuerdo con las prerrogativas
de la United States Pharmacopeia and Food and Drug Administration (US-FDA, 2001) y Ribani
et al. (2004), y se expresaron como valores medios de seis determinaciones (±SD).

Validación del método HPLC-PDA

El método fue validado de acuerdo con las directrices de la Agencia Nacional de Vigilancia
Sanitaria (Anvisa - Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria de Brasil) (Anvisa, 2003). El
procedimiento de validación incluía una evaluación de los siguientes parámetros: selectividad,
linealidad, límite de detección y límite de cuantificación, precisión, precisión y robustez.
Selectividad

La selectividad del método se evaluó comparando los cromatogramas de la solución estándar,

la solución de muestra, la fase móvil y el blanco (metanol). La similitud espectral de la
hibalactona picos en el estándar y la muestra también se evaluó comparando los espectros UV
en el rango de longitudes de onda de 190-400 nm.

Linealidad

La linealidad se determinó mediante las curvas de calibración obtenidas del análisis con HPLC
en seis niveles de concentración del estándar de hibalactona (10, 25, 50, 100, 150 y 200 ug ml-
1) en el metanol. Cada punto se realizó por triplicado, y la curva de calibración se ajustó por
regresión lineal a partir de la correlación entre las áreas de los picos y la concentración del
estándar. Se calcularon los coeficientes de regresión lineal (r) y el análisis de varianza (ANOVA).

Límite de detección y límite de cuantificación

El límite de detección (LD) y el límite de cuantificación (LQ) fueron calculada en base a la

desviación estándar (SDb) de la intercepción con el eje y y la pendiente de la curva de
calibración (S) según a las Ecs. (1) y (2):

Precisión

La precisión se evaluó en términos de repetibilidad (intradía) y precisión intermedia (entre

días), utilizando el estándar relativo desviación (RSD) como criterio. La repetibilidad fue
verificada de tres replica de las concentraciones altas, medias y bajas del estándar rango lineal,
que comprende un total de nueve inyecciones de las concentraciones de prueba. La precisión
intermedia fue evaluada por este mismo proceso, realizado en un día diferente por diferentes
analistas.
Exactitud

La exactitud se determinó mediante un análisis de recuperación. Se prepararon soluciones de

muestra, por triplicado, a tres niveles de concentración correspondientes al 50%, 100% y 150%
de la concentración estándar en el rango lineal, con y sin la adición de una cantidad conocida
del estándar de hibalactona (42,60 ug ml-1). La precisión se calculó para cada nivel mediante la
relación entre la concentración media experimental y la concentración teórica del estándar
añadido según la Ec. (3).

Concentración experimental
EXACTITUD= X 100( 3)
Concentraciónteórica

Robustez

La robustez del método se evaluó variando la temperatura del horno de la columna de 25-26
◦C y 27 ◦C; la composición de la fase móvil del acetonitrilo/metanol/agua (10:65:25) a (5:70:25)
y (10:60:30); y las dimensiones de la columna de fase inversa del Eclipse XDB-C18 de Zorbax de
(250 × 4,6 mm, 5 um) a (150 × 4,6 mm, 5 um). Los resultados se compararon con los obtenidos
con el conjunto original de condiciones cromatográficas. Las inyecciones se realizaron por
triplicado y los datos se evaluaron mediante el cálculo de la RSD.

Extracción asistida por ultrasonido

Ensayos anteriores para la optimización de los EAU

Inicialmente, los Emiratos Árabes Unidos se llevaron a cabo con una relación sólido/líquido
(SLR) de 1:30-1:10 g ml-1, fuerza etanólica (ES) de 65-95% (v/v), temperatura de extracción
(ET) de 25-55 ◦C y tiempo de extracción de 15-45 min. Los experimentos se llevaron a cabo
siguiendo un Diseño Box-Behnken asociado a la metodología de la superficie de respuesta
(RSM) con cuatro factores y tres niveles. Las condiciones que proporcionó las mayores
concentraciones de hibalactona, cuantificadas por HPLC-PDA, formaron la base para el diseño
de la optimización.

Diseño experimental
La optimización de la hibalactona EAU de H. umbellata se realizó a partir de los experimentos
establecidos en el diseño de Box-Behnken, como se muestra en la Tabla 1. Tres factores que
afectan la eficiencia de la extracción en se investigaron tres niveles (33): SLR de 1:10, 1:7.5 y
1:5 g ml-1 (X1); ES de 50, 60 y 70% (v/v, X2); ET de 45, 55 y 65 ◦C (X3). El El tiempo de
extracción se fijó en 15 minutos. El diseño completo se llevó a cabo en orden aleatorio y
consistió en diecisiete combinaciones, incluyendo cinco réplicas en el punto central para
estimar la pureza y la adecuación del modelo ajustado (Lundstedt y otros, 1998). Se utilizó un
modelo de regresión polinómica de segundo orden para expresar el contenido de hibalactona
en función de las variables independientes (Ec. (4)).

donde y es la respuesta predicha (contenido de hibalactona), β0 es una constante, y βi, βii y βij
son los coeficientes lineal, cuadrático e interactivo del modelo, respectivamente. En
consecuencia, xi y xj representan los niveles de las variables independientes. La influencia de
las variables independientes en el contenido de hibalactona fue analizada por RSM. El análisis
estadístico se realizó utilizando el programa informático Statistic versión 7.0 (StatSoft, 2004) y
los efectos se consideraron significativos para un p < 0,05.