PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES EXTRACCIN DE VITAMINA E: 1. EXTRACCIN DE ACEITES DE LAS ALMENDRAS: Materiales y Reactivos: 1. Almendras dulces; 2. Hexano 3.

Agua destilada; 4. Acetona 5. cido actico 6. Vaso Precipitado 200 mL, 100 mL 7. Esptula 8. Escobilla 9. Mortero y pistilo 1.1 Molienda de las Almendras:
Vaso Precipitado

10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

Vidrio reloj Pipeta aforada de 10 mL, 5 mL Pipeta Graduada de10 mL, 5 mL Baln fondo plano Pinzas para Baln Erlenmeyer 250 mL Equipo destilacin simple Equipo Soxleth Bomba de vacio Capsula de porcelana

Adicionar Almendras + 100 mL de H2O a 80C Dejar en remojo durante 15 min. Secar y pelar Moler y obtener extracto.

Tomado de: Hernndez, S.; Zacconi, F. 2009.

1.2 Extraccin del aceite de almendras a temperatura ambiente:

Erlenmeyer
Masar 15 g de Almendras molidas + 20 mL Hexano

Agitacin magntica. 15 min

Filtrar al vaco

Lavar slido con 10 mL hexano

Extracto- Trasvasar a un Baln previamente masado

Tomado de: Hernndez, S.; Zacconi, F. 2009

Realizar destilacin
Masar aceite obtenido : 0,92 g/cm3

1.3 Extraccin del aceite de almendras a reflujo:

Baln Plano Baln Fondo Fondo Plano

Masar 15 g de Almendras molidas + 20 mL Hexano

Conectar Refrigerante

Calentar Bao Mara

Reflujo disolventeHexano P.ebll: 69 CDurante 15 min. Dejar enfriar

Suspender agitacin y calentamiento

Filtrar almendras

Lavar slido con 10 mL hexano

Extracto- Trasvasar a un Baln previamente masado

Realizar destilacin

Masar aceite obtenido : 0,92 g/cm3

Tomado de: Hernndez, S.; Zacconi, F. 2009

2. MATERIALES Y MTODOS PARA LA CUANTIFICACIN DE VITAMINA E: Materiales y reactivos (+) -tocoferol (90%) (+) -tocoferol (99%) (+) -tocoferol (67%) Estigmasterol (95%) -sitosterol (90%) Disolventes: hexano metanol acetona 2-propanol)

Las soluciones de trabajo para la cuantificacin de vitamina E son de 1000 ppm para TOCOFEROL Y FITOSTEROL, estas se preparan en hexano grado HPLC. Posteriormente se hacen soluciones ms diluidas para ser utilizadas durante los ensayos experimentales en el mismo disolvente. 2.1 Preparacin de la muestra: extraccin en fase slida (SPE) La materia insaponificable del aceite se separa de la fraccin total de lpidos por un cartucho 2-OH de 3 cc, que fue previamente acondicionado con cinco ml de hexano. A 400 mg de aceite de almendras crudas de la muestra, ya sea enriquecida con los analitos, se disolvi en cinco ml de hexano, pasado a travs del cartucho y, a continuacin, se eluy a sequedad. La fraccin de hexano se pierde. La elucin de los analitos retenidos en el cartucho son llevados con 3 ml de metanol seguido de una evaporacin total del disolvente bajo corriente de nitrgeno. Por ltimo, el residuo se reconstituy a un volumen de 1 ml con 2-propanol. Esta muestra se encapsula en virtud corriente de nitrgeno y protegido de la luz para su posterior anlisis cromatogrfico. 2.2 Anlisis cromatogrfico HPLC (Correa, S.; Busto, O.; Guasch, J.) Los tocoferoles y fitoesteroles se separaron en una columna de HPLC C18 Luna, 250mm x 4.60mm i.d., 5 m tamao partcula, utilizando una fase mvil de 85% de metanol y 15% de acetona en condiciones isocrticas con una velocidad de flujo de 1 ml min-1. La determinacin se realiza con 20 l de la muestra a 20 C y se detectan los analitos a una longitud de onda de 208 nm. Todos los analitos se eluyeron en menos de 20 minutos. Se realizaron inyecciones por triplicado para cada muestra. 2.2.1 Validacin del Mtodo:

Las curvas de calibracin

Las curvas de calibracin se construyeron utilizando cinco concentraciones y tres repeticiones por cada uno. El nivel de las concentraciones utilizadas fue: 0 a 40 ppm en 2-propanol para -tocoferol, -tocoferol y -tocoferol 0-200 ppm en 2-propanol para estigmasterol y sitosterol. Mtodo de adicin estndar

El procedimiento de adicin estndar se utiliz para la cuantificacin de tocoferol y contenido de fitosteroles en aceite de almendras. Cinco niveles de concentraciones se dispararon a una solucin compuesta de 400 mg de aceite de almendras se disolvi en 5 ml de hexano. Los niveles de concentracin de la adicin de esta solucin fueron 1-10 ppm para la -tocoferol tocoferol y -tocoferol, y de, 10 a 50 ppm y para estigmasterol y -sitosterol. Con el fin de trazar las lneas de calibracin, tres repeticiones de cada nivel de concentracin fueron preparadas. Efecto Matrix Efecto de la matriz se determin mediante la comparacin de la pendiente de las curvas representa con mtodo del estndar externo y el mtodo de adicin de patrn con el ULC Software (univariante lineal de calibracin), al nivel de significacin 0,05% por cada compuesto a analizar La Curva de calibracin estndar externa, as como las curvas de adicin de patrn se trazan para cada analito estudiado. La pendiente y la interseccin de cada curva se calculan por regresin lineal de mnimos cuadrados, con el coeficiente de determinacin (R2) Y el error estndar de los coeficientes se determin. Recuperacin del proceso de extraccin

Debido a la falta de tocoferol libre y aceites de fitosterol y la evidencia de efecto de la matriz, la recuperacin del proceso de extraccin se calcul utilizando una comparacin de las reas de los picos en lugar de concentraciones, como se describe a continuacin. El estudio de la recuperacin fue desarrollado en cuatro niveles de concentracin y tres rplicas cada uno, siguiendo el mtodo de adicin estndar con una menor modificacin. Los niveles de concentracin de la adicin de unos 400 mg de aceite de almendras en cinco ml de solucin de hexano fueron 3-10 ppm para el -tocoferol, -tocoferol y -tocoferol, y, 10 a 50 ppm para el estigmasterol y -sitosterol. En primer lugar, cada conjunto de rplicas se aadieron a cada nivel de concentracin despus de que se haban sometido a una tcnica de extraccin en fase slida. Las reas del pico obtenido para cada analito se llama A1. Luego, fue otro conjunto de rplicas enriquecida para cada nivel de concentracin antes de que se someti a la extraccin proceso. Las reas del pico obtenido para cada analito, en este caso, eran denominado A2. Por ltimo, la tasa de recuperacin (%) para el proceso de extraccin para cada nivel de concentracin se calcul usando la siguiente frmula: % Recuperacin de SPE = (A2 / A1) x 100

de la concentraciones preparadas Lmites de deteccin y cuantificacin

La deteccin instrumental y lmites de cuantificacin se calcularon a partir de la cantidad de cada analito requerida para proporcionar una relacin seal-ruido de 3 y 10, respectivamente. Estos lmites se calcularon utilizando soluciones de trabajo diluidas en 2 - propanol de cada tocoferol y fitosterol analizados.

2.3 Anlisis Cromatogrfico de Gases (GC):

Reactivos Solucin de pyrogallol al 3% en etanol absoluto (grado HPLC) Solucin etanlica de dihidrocolesterol (DHC), que es el patrn interno, aproximadamente a 250 ppm. Solucin acuosa de KOH saturada. Hexano HPLC Agua milliQ Solucin derivantizante: Disolver 1 ml de la solucin comercial de N-metil-bis trifluoroacetamida (BSTFA) con Trimetil clorosilano (TMCS) (99:1) en un 1 ml de pyridina anhidra. Agitar en un vrtex. Solucin Hexano/Acetato de etilo (90:10, v/v) Solucin Etanol/Eter (50:25:25 v/v/v) etlico/Hexano

Metodologa para Fitoesteroles libres por GC:

300 mg Aceite Almendras Adicionar 50 l de sln etanlica de DHC-250 ppm + 8 ml de una sln etanlica de Pyrogallol al 3% y 0.5 ml de una sln acuosa de

KOH saturada.
Agitar vortx Bao mara a 80C30 min

Enfriar a T- ambiente

4. Se extrae totalmente la fraccin insaponificable (fase orgnica) lavando con 12 ml de agua milliQ, y 10 ml de hexano. Se agita por 5 minutos y se espera a que se separen las fases. Se repite el lavado con hexano dos veces ms. 5. El extracto que contiene la fraccin insaponificable se lleva a sequedad con una corriente con nitrgeno. 6. Se derivatizan los analitos con 250 l de la solucin derivatizante. Se agitan por 30 segundos en el vrtex y se colocan en un bao de agua a 70C por 30 min. 7. Se analiza 1l de la solucin derivatizada por GC-FID a las siguientes condiciones: Rampa de temperatura: 40C/min Temperatura final: 270C por 40 minutos Temperatura del inyector: 250 C Temperatura del detector: 300 C Metodologa para Fitoesteroles libres por GC (Cunha et al) 1. Se pesan en balanza analtica aproximadamente 300 mg de aceite de frutos secos y se disuelven en 1 ml de una solucin de Hexano /Acetato de etilo (90:10, v/v). 2. La solucin se carga en un cartucho de SPE de silica de 6 mg que previamente fue acondicionado con 5 ml de Hexano. 3. Una vez cargada la muestra, se agregan 2.5 ml de la solucin de Hexano/Acetato de etilo (90:10, v/v) y se guarda la fraccin (fraccin de fitoesteroles esterificados). 4. A continuacin se lava el cartucho con 5 ml de la solucin de Hexano/Acetato de etilo (90:10, v/v) seguido de 3 lavados de 5ml de una solucin de Etanol/Eter etlico/Hexano (50:25:25 v/v/v). Todos los eluyentes se recogen. (fraccin de fitoesteroles libres) BIBLIOGRAFIA: Flujo de helio: 1 ml/min Presin de la columna: 7 psi o 50 kPa

Correa, S.; Busto, O.;. Guasch, J. (2007) Simultaneous quantification of phytosterols and tocopherols in almond oil by reversed-phase high-performance liquid chromatograpy. Grupo de Qumica Analtica y Alimentos (Unitat dEnologia del CeRTA), Universitat Rovira i Virgili. Tarragona Espaa.
C.M. Lpez-Ortiz et al. (2008). Comparative study of tocopherol homologue content in four almond oil cultivars during two consecutive years . Journal of Food Composition and Analysis N21, 144 151. Hernndez, S.; Zacconi,F. (2009). Aceite de almendras dulces: extraccin, caracterizacin y aplicacin. Instituto de Investigaciones en Qumica, Universidad Nacional del Sur- Revista Nova vol.32 N5.