B IOQUÍMICA

Construcción de una curva de calibración

y manejo del espectrofotómetro
Publicado por RAULILLO91 el 6 NOVIEMBRE, 2016

¿Qué nombres más raros no? Vamos a explicar un poco en que consiste cada cosa,
aviso de antemano que va a ser un poco larga, que nadie se aburra.
Una curva de calibración, a grandes rasgos, es un método que se utiliza para poder
determinar la concentración de un analito (sustancia que queremos analizar)
de concentración desconocida, ¡Obvio Raúl!.

Para ello lo primero que tenemos que hacer es construir una batería de
diluciones (ya empezamos con los nombres raros).

Consiste en diluir una muestra, de concentración conocida, varias veces para

después poder así determinar la concentración de una muestra
problema, extrapolando los datos. Para ello mediremos nuestras muestras diluidas en
un aparato llamado espectrofotómetro.

Este aparato nos da una medida, en un valor que se denomina absorbancia (es una
medida que se basa en la relación entre la intensidad de luz que incide sobre la
muestra y la intensidad de luz que es transmitida).

Es muy fácil, simplemente se meten

las muestras y vamos anotando los
resultados que nos da, pero
bueno…..habrá que construir primero
la dichosa batería, ¿no?, ¿Como se
hace?

Vamos a hacer dos diluciones seriadas

con diferentes cromógenos (son
sustancias que tiñen la muestra para
que esta pueda ser medida en el
espectrofotómetro). Pensando por
lógica, cuanto más coloreada esté una muestra mas concentración de analito tendrá.
Olé!
La primera dilución se hará con un cromógeno de color azul, de concentración 800
mg/dL, la cual constará de 5 tubos con 4 mL cada uno y un factor dilución 1/2. El
primer tubo contendrá el colorante sin diluir. Un factor 1/2 significa que hay 1 parte
de soluto y 1 parte de disolvente (1+1=2).

Entonces, si cada tubo tiene que tener un volumen final de 4 mL, ¿como diluimos
cada tubo para que nos quede ese volumen final y con ese factor de dilución? Para
esto existe una fórmula muy sencilla para calcular el volumen de paso de nuestra
muesta: Volumen final/ (Fd-1), donde Fd es el factor de dilución, en este caso es 2.

Vamos a realizarlo: 4mL/ (2-1)= 4mL. Entonces en cada tubo pondremos siempre
el volumen final de disolvente (que será agua destilada) y los 4mL que hemos
calculado de volumen de paso. Después se entenderá mas fácil con un video.

Resumiéndolo entonces, cogemos el primer tubo y añadimos 8 mL del cromógeno

azul sin diluir (Porque pasaremos después 4 mL al siguiente tubo).
Como son 5 tubos en total y ya hemos utilizado uno, en los siguientes 4 tubos
añadimos 4 mL de agua destilada.

En el segundo tubo, añadimos 4 mL del cromógeno del primer tubo, por lo que nos
quedará un volumen total de 8 mL.
Entonces en el tercer tubo añadiremos 4 mL del segundo tubo, por lo que el
segundo tubo quedará con un volumen de 4mL y un factor de dilución de 1/2 , ¿lo
entendéis? . Pues seguimos.

Cogemos el cuarto tubo y añadimos 4mL del tercer tubo, con los que el tercer tubo
quedará con 4mL y el cuarto tubo con 8mL.

Por último, cogeremos el quinto tubo y haremos lo mismo, pasaremos 4 mL del

tubo anterior. Pero si ya no hay mas tubos Raúl, y el último tubo nos queda con
8mL, ¿estas tonto? Pues muy facil, cogemos 4mL como si fuese el volumen de paso
y lo tiramos a la m…..¡Oye! Y así obtendremos un tubo con 4mL y un factor 1/2.
Que «coñazo» es de explicar pero después realizarlo es muy sencillo.
Aquí arriba he dejado un «Picasso» realizado por mí donde se explica lo anterior.

La segunda dilución la vamos a realizar con un cromógeno de color amarillo-

anaranjado, de concentración 600 mg/dL, pero con un Fd 1/3. Esta dilución estará
formada por 4 tubos con un volumen final de 3mL. Para ello utilizamos la fórmula
de antes:

Volumen final/ (Fd-1) –> 3mL/ (3-1)= 1,5mL, por lo que nuestro volumen de paso
será de 1,5mL.

Para ello como en el caso anterior cogemos el primer tubo y añadimos 4,5mL de la
disolución sin diluir (4,5= 3 mL+1,5mL del volumen de paso) y en los 3 tubos
restantes añadimos 3 mL de agua y vamos pasando el volumen calculado como
antes. Otro «Picasso» muestra este proceso:

Las dos baterías de diluciones quedarían así:

Aquí dejo un vídeo donde se ve mejor todo este proceso:
Ya tenemos las baterías de diluciones, por lo que ahora pasamos a medir cada una en
el espectrofotómetro. Cogemos la batería con el cromógeno azul y la pasamos a una
cubeta de espectrofometría.

Esta cubeta es la que se introducirá en el

espectrofotómetro y nos dará una serie de medidas.

A cada color le corresponde una determinada

longitud de onda, en el caso del azul lo mediremos
a 662 nm y en el caso del amarillo-anaranjado lo
vamos a medir en dos medidas, 398 nm y 434 nm.

Poniendo esas medidas de longitud de onda

correspondientes a la máxima absorbancia de cada
color nos aseguramos de unos resultados más
fiables.

Vamos anotando los resultados y como sabemos la

concentración de cada tubo podremos realizar una
recta en el ordenador para poder determinar la concentración de una disolución
problema, cuya concentración es desconocida.

Antes de realizar las medidas, es necesario calibrar la maquina con lo que se conoce
como Blanco de reactivo, que en este caso es el propia agua destilada que hemos
utilizado en las diluciones. Simplemente se coge una cubeta con este agua y
ajustamos el aparato a 0, por poner un símil es como si tarasemos en una báscula.

Esto se hace con el objetivo de medir realmente solo lo que nos interesa, que es la
concentración de muestra mediante la adición del cromógeno y que el valor de
absorbancia que nos salga sea ese (como si descartasemos de la media el agua
destilada).

Una vez medimos todo, procedemos a llevar los datos a una tabla de Excel y realizar
una recta, en internet hay tutoriales muy buenos donde se explica como realizarlos.

En mi caso estas son las gráficas:

Medimos ahora una cubeta con una disolución problema, igual que hemos hecho
antes, en este caso la disolución problema es con el colorante azul, por lo que solo
utilizaremos la ecuación de la recta correspondiente a este colorante.
Como en la disolución problema ha salido una absorbancia con un valor de 0.185,
sustituimos en la ecuación correspondiente, y = 0,0014x + 0,0248.
El valor de “Y” corresponde a la absorbancia y el valor “x” a la concentración.

Como queremos averiguar el valor de la disolución problema sustituimos en la

ecuación
0,185= 0,0014x + 0,0248 –> 0014x=0,185-0,0248 –> x= (0,185-0,0248)/0.0014 –
> x= 114,43 mg/dL

¡Por fin ya hemos determinado la concentración de una disolución problema!

La práctica ha quedado un poco larga, pero he intentado hacerla lo más amena

posible. Aquí dejo un video que explica mediante un espectrofotómetro unido a un
software, como se selecciona la longitud de onda de cada muestra y porqué el
colorante amarillo tiene dos longitudes de onda, ¡Echadle un vistazo por favor!: