CULTIVO DE

CELULAS Y
TEJIDOS
ANIMALES

Sustratos energéticos
Factores de crecimiento

Dr. Emmanuel Diaz

 Fases gaseosas

• Oxígeno
• El nivel de O2 disminuye desde los
niveles atmosféricos (21%) después
de la inhalación por el sistema
respiratorio (19,7% - 14,5%; 150 -
110 mmHg), el transporte a través de
sangre arterial (13,2%; 100 mmHg) y
el suministro a los tejidos corporales
(7% - 0,7% ; 50 - 5 mmHg).
 Fases gaseosas
• Dióxido de carbono

• Su propósito es disolverlo en el medio de cultivo celular donde una pequeña

proporción del mismo reacciona con el agua para formar ácido carbónico que a su vez
interactúa con su base conjugada (los iones de bicarbonato disueltos en el medio)
para controlar un pH fisiológico estable a través del sistema tampón de bicarbonato.
• Los medios de cultivo celular también se complementan con el colorante indicador
Phenol Red
 Medios de cultivo y suplementos
Manejo de amortiguadores

• Los cultivos que utilizan sistemas de amortiguación de

bicarbonato natural / CO2 deben mantenerse en una
atmósfera de 5-10% de CO2 en aire, generalmente
suministrado en una incubadora de CO2.
• El bicarbonato / CO2 es de bajo costo, no tóxico y
también brinda otros beneficios químicos a las células.

• HEPES tiene una capacidad amortiguadora superior en el

rango de pH de 7,2 a 7,4, pero es relativamente caro y puede
ser tóxico para algunos tipos de células en concentraciones
más altas (por encima de ~ 100 nM).
• Los cultivos tamponados con HEPES no requieren una
atmósfera gaseosa controlada.
 Medios de cultivo y suplementos
Control de la osmolaridad

• La osmolalidad es una propiedad física importante de los medios de cultivo que representa
la concentración de partículas en solución expresada como osmoles de soluto por kilogramo
de disolvente.
Medios de cultivo y suplementos
Control de la osmolaridad

• Las células suspendidas en el medio pueden verse afectadas por la osmolalidad según la
concentración de solutos en el citoplasma en comparación con la solución exterior.
• El plasma humano es de aproximadamente 290 mOsm / kg, por lo que es aceptable que la
mayoría de los medios de cultivo celular tengan una osmolalidad de 260 a 320 mOsm / kg.
 Medios de cultivo y suplementos
Tensión superficial y espumas

• La tensión superficial de un cultivo debe mantenerse lo suficientemente baja para evitar la

formación de espumas
• En cultivos donde hay altos niveles de aireación por burbujeo se puede generar una muerte
inmediata a las células que están cercanas a la zona de estallido (Garcia-Briones y Chalmers
1994)
• Se ha demostrado que sólo el evento de la ruptura de las burbujas puede llegar a ser el
responsable de todo el daño celular en un cultivo
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo

• Suero
• Sales inorgánicas
• Sistema de Buffer
• Carbohidratos
• Aminoácidos
• Vitaminas
• Proteínas y péptidos
• Ácidos grasos y lípidos
• Antibióticos
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Suero

• Contiene una gran cantidad de factores nutricionales y macromoleculares esenciales para

el crecimiento celular.
• La albúmina de suero bovino es el componente principal de FBS.
• Los factores de crecimiento en FBS son esenciales para el mantenimiento y crecimiento
de las células cultivadas
• FBS también contiene una variedad de moléculas pequeñas como aminoácidos,
azúcares, lípidos y hormonas.
Medios de cultivo y suplementos
Medios de cultivo y suplementos
Medios de cultivo y suplementos
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo

Sales
• Na +, K +, Mg2 +, Ca2 +, Cl−, SO42−, PO43− y HCO3− y son los componentes principales
que contribuyen a la osmolalidad del medio
• Ca2 +, son requeridos por algunas moléculas de adhesión celular (p. ej. Cadherinas), actúa
como intermediario en la transducción de señales y puede intervenir en procesos de
diferenciación
4.3 Medios de cultivo y suplementos
4.3.4 Constituyentes de los medios de cultivo

Sales

• Na +, K + y Cl− regulan el potencial de membrana

• SO4 2−, PO4 3− y HCO3 - tienen roles como aniones requeridos por la matriz y
los precursores nutricionales de las macromoléculas
• La concentración de bicarbonato de sodio está determinada por concentración
de CO2 en la fase gaseosa y tiene una significativa papel en la regulación de
pH
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo

Proteínas y péptidos

• Las proteínas más utilizadas son

1) Albúmina
2) Fibronectina
3) Transferrina
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Carbohidratos
• La principal fuente de energía se deriva de los carbohidratos
generalmente en forma de azúcares.
• Los principales azúcares utilizados son la glucosa y la galactosa; sin
embargo, algunos medios contienen maltosa o fructosa.
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Carbohidratos
• La concentración de azúcar varía desde un medio basal que contiene 1 g
/ L hasta 4,5 g / L en algunos medios más complejos.
• Los medios que contienen la mayor concentración de azúcares pueden
apoyar el crecimiento de una gama más amplia de tipos de células.
• El piruvato se incluye en la formulación de algunos medios, como fuente
de energía alternativa.
LA GLUCOSA ES EL
PRINCIPAL SUSTRATO
ENERGÉTICO

• Para la célula y para su ingreso requiere

una proteína transportadora en la
membrana celular.

• Se han descrito dos sistemas de

transporte de glucosa y de otros
monosacáridos: los transportadores de
sodio y glucosa llamados SGLT (sodium-
glucose transporters) y los
transportadores de glucosa llamados
GLUT (glucose transporters
PARA LA PRODUCCIÓN DEL
ADENOSINTRIFOSFATO (ATP)

• Es el compuesto indispensable en
muchas de las reacciones que se llevan
a cabo en la célula, se necesitan varios
sustratos energéticos, entre los cuales
la glucosa es el de mayor importancia
Debido a que ésta no difunde a
través de la bicapa lipídica, debe
ser transportada al interior de la
célula.

Este transporte lo realizan dos

grupos de proteínas: los
transportadores SGLT (sodium
glucose transporters) y los
transportadores GLUT (glucose
transporters).
TRANSPORTADORES
SGLT
• Son proteínas que efectúan un
transporte acoplado, en el que
ingresan conjuntamente a la célula
sodio y glucosa —o galactosa, en
algunos casos—.

• Se localizan en la membrana
luminal de las células epiteliales
encargadas de la absorción
(intestino delgado) y la reabsorción
(túbulo contorneado proximal) de
nutrientes
• Se aprovecha el ingreso de sodio a
favor del gradiente electroquímico,
entre el exterior y el interior de la
célula, para transportar la glucosa
en contra de un gradiente químico.

• Se han identificado tres

transportadores SGLT (SGLT 1, SGLT
2 y SGLT 3).
TRANSPORTADORES • LOS TRANSPORTADORES GLUT están
encargados del ingreso de los
GLUT monosacáridos a todas las células del
organismo.

• Se han identificado trece de ellos,

enumerados desde GLUT 1 hasta GLUT
13
• Presentan un sitio de
glicosilación en la región externa
de la membrana. Cada una de las
diferentes isoformas de los GLUT
tiene ubicación y características
cinéticas propias, adaptadas a las
necesidades metabólicas de los
distintos tejidos del organismo.
• La glucosa ingresa a la
célula en cuatro etapas:

1) se une al
transportador en la cara
externa de la membrana;
2) el transportador
cambia de conformación y la
glucosa y su sitio de unión
quedan localizados en la
cara interna de la
membrana;
3) el transportador
libera la glucosa al
citoplasma, y
4) el transportador
libre cambia nuevamente de
conformación, expone el
sitio de unión a la glucosa en
la cara externa y retorna a
su estado inicial
• El GLUT 1 es una proteína de 664
aminoácidos, codificada por un gen que
se localiza en el cromosoma 22. Tiene
una Km para la glucosa de 1,6 mM y
transporta, además, galactosa. Se
expresa en los eritrocitos, los astrocitos,
las células endoteliales, las células de la
retina y las barreras hematoencefálica y
placentaria. Durante el desarrollo fetal
hay expresión de GLUT 1 en los estadios
de oocito y blastocisto y luego en los
diferentes tejidos fetales.
• El GLUT 2 es una proteína
de 522 aminoácidos,
codificada por un gen
ubicado en el cromosoma
3. A diferencia de los
otros GLUT su afinidad
por la glucosa es baja
(Km:17 mM). Transporta
además galactosa y
fructosa. Se expresa en
células B pancreáticas, en
hepatocitos, en
enterocitos y en células
tubulares renales. En
células B pancreáticas y
en hepatocitos facilita el
ingreso de la glucosa
como respuesta al
incremento de la glicemia
• El mecanismo molecular
que media entre el
estímulo y la movilización
de la vesícula a la
membrana celular se
conoce parcialmente y es
objeto de múltiples
investigaciones.
• El efecto de la insulina es el
que se ha estudiado con
mayor profundidad; el
receptor de la insulina actúa
como una quinasa que
fosforila residuos de tirosina,
del propio receptor y de
otras proteínas.

• En ausencia de la insulina la
actividad tirosina-quinasa
permanece desconectada.
Cuando la insulina se une al
receptor se induce un
cambio conformacional en
éste, que estimula la
actividad tirosina-quinasa. El
receptor activado se
autofosforila y, a su vez,
fosforila varias proteínas en
secuencia, las cuales
inducen todos los efectos
celulares de la insulina
• Estas IRS, a su vez, activan
otras proteínas entre las
cuales se incluyen una que es
homóloga del colágeno (SHC)
y el Gab 1 (proteína asociada
al receptor del factor de
crecimiento Grb2), que
desencadenan una cascada de
eventos moleculares,
incluyendo, entre otros, la
translocación de las vesículas.
• Esta exocitosis de las
vesículas incrementa
momentáneamente el
número de GLUT 4 en la
membrana del miocito o del
adipocito y por consiguiente
la entrada de glucosa a estas
células. Cuando el estímulo
cesa se desencadena la
endocitosis, la cual involucra
la formación de trisqueliones
de clatrina y la participación
del citoesqueleto celular
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Aminoácidos
• Los aminoácidos "esenciales" deben añadirse a los medios de cultivo, ya que
las células no pueden sintetizarlos por sí mismas.
• La concentración de aminoácidos en el medio de cultivo determinará la
densidad celular máxima que se puede lograr; una vez agotadas, las células ya
no podrán proliferar.
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Ácidos grasos y lípidos

• Como las proteínas y péptidos, lípidos y ácidos grasos son aditivos críticos para los
medios sin suero, ya que normalmente están presentes en el suero.
• El colesterol y los esteroides son ejemplos de macromoléculas de esta categoría que son
esenciales para células especializadas.
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Vitaminas

• Muchos medios también están enriquecidos con vitaminas específicas que los hacen
consistentemente más adecuados para una gama más amplia de líneas celulares.
• Las vitaminas son precursoras de numerosos cofactores.
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Vitaminas

• Muchas vitaminas, especialmente las del grupo B, son necesarias para el crecimiento y la
proliferación celular, para algunas líneas la presencia de B12 es esencial.
• Algunos medios también tienen niveles elevados de vitaminas A y E.
• Las vitaminas comúnmente utilizadas en los medios incluyen riboflavina, tiamina y biotina.
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Antibióticos

• El uso de antibióticos en cultivo celular minimiza la pérdida de células,

reactivos, tiempo y esfuerzos debido a la contaminación.
 Medios de cultivo y suplementos
Constituyentes de los medios de cultivo
Antibióticos
 Medios de cultivo y suplementos
Medios definidos

• Los medios químicamente definidos (CD) consisten en materiales que son

molecularmente homogéneos o mezclas de ingredientes caracterizados y cuantificados
• El valor y las características de los medios definidos químicamente incluyen la
reproducibilidad y el control del rendimiento en el cultivo celular, la productividad y la
calidad del producto, así como la comunicación y transferencia de la formulación.
 Medios de cultivo y suplementos
Medios libres de suero

• Estos medios están específicamente formulados para apoyar el cultivo de un solo

tipo de célula e incorporar cantidades definidas de componentes purificados.

Ventajas y desventajas de medios libres de suero

• Fácil estandarización en la formulación del
medio
• El desarrollo del medio se vuelve selectivo
para un tipo de célula en particular
• Facilita la regulación de la proliferación y
diferenciación
• Proliferación celular.
• El crecimiento suele ser más lento en medios
sin suero y se logran menos generaciones
con líneas celulares finitas
 Medios de cultivo y suplementos
Medios selectivos

• Los medios selectivos permiten que ciertos tipos de organismos crezcan e inhiban el
crecimiento de otros organismos.
• Los procesos de diferenciación también requieren medios selectivos para el tipo de
linaje celular deseado.
• Es posible, utilizando medios selectivos, clonación o métodos de separación física aislar
cepas de células purificadas de tejido disgregado o cultivo primario.