UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MATERIA DE MICROBIOLOGÍA NOVIEMBRE 2020

Docente: ADRIANA SANTA CRUZ R.
Estudiante: RUVINA REQUE TORRICO

ACTIVIDAD PRACTICA 15
Identificación de Enterobacterias
Para trabajar en un laboratorio de microbiología debemos tener todos los protocolos de trabajo
escritos. Por lo tanto, al terminar la presente práctica, cada estudiante deberá elaborar un POE
(Procedimiento operativo estandarizado) para la identificación de enterobacterias.
En este POE deberán incluir un flujo de trabajo que resuma el proceso y deberán también
contemplar los métodos de control de calidad que se deben aplicar.

IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Objetivo General
Describir los procedimientos de cultivos e identificación de bacilos Gram negativos fermentadores: E.
coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Morganella, Yersinia y otros.
Apoyo del laboratorio
Para la identificación, de las distintas Enterobacterias, se puede procesar; urocultivos, coprocultivos,
cultivos de heridas y otros.
A través del cultivo e identificación por pruebas bioquímicas de las colonias desarrolladas en agar de las
bacterias.
Condiciones generales
Las bacterias Gram negativas se desarrollan en agar sangre de carnero y agar Mc Conkey, pero en
agar sangre de carnero no podemos hacer mayor diferenciación entre las colonias, sin embargo, en el
agar Mc Conkey podemos diferenciar las colonias lactosa positivas y lactosa negativas.
Agar Mac Conkey
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de
agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los
agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Fórmula (en gramos por litro):

 Peptona 17.0
 Pluripeptona 3.0
 Lactosa 10.0
 Agar 13.5
 Rojo neutro 0.03
 Cristal violeta 0.001
 pH final: 7.1 0.2
Preparación:
Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales biliares 1.5
mezclar hasta uniformar. Calentar Cloruro de sodio 5.0 suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta
disolver. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Resultados:
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color
del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los
microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Medio de cultivo selectivo y diferencial

Salmonella Shigella Agar
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp.
La selectividad, está dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias
Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial
debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de
sodio.
Fórmula (en gramos por litro)

 Pluripeptona 5.0
 Extracto de carne 5.0
 Lactosa 10.0
 Mezcla de sales biliares 8.5
 Citrato de sodio 8.5
 Tiosulfato de sodio 8.5
 Citrato férrico 1.0
 Agar 13.5
 Verde brillante 0.00033
 Rojo neutro 0.025
 pH final: 7.0 0.2
Preparación
Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar.
Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y
distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.
Resultados
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio
haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.
Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de
cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como
colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro.

Tetrationato Caldo
Utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp.
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano,
y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos. La selectividad está dada por la
presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-
iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima
tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
Fórmula (en gramos por litro)

 Peptona 5.0
 Sales biliares 1.0
 Carbonato de calcio 10.0
 Tiosulfato de sodio 30.0
 pH final: 8.4 0.2
Solución iodo iodurada

 Iodo 6.0
 Ioduro de potasio 5.0
 Agua 20.0
Preparación
Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullición.
Enfriar a 45 C o menos. Agregar 20 ml de solución iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en
tubos estériles. No debe calentarse luego de agregar la solución iodada. El medio base puede
mantenerse a 4 C, dura varios meses, pero una vez agregada la solución iodada debe usarse en el
mismo día.
Para evitar la proliferación de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina,
antes de la solución iodada

Pruebas bioquímicas
a. TSI(Utilización de lactosa,sacarosa,glucosa)
b. LIA (Descarboxilación de lisina)
c. SIM (producción de sulfuro, formación de indol y movilidad)
d. Utilización del citrato
e. Producción de ureasa
Procedimiento General

 Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mc Conkey.

 Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero de Bunsen.
 Enfriar el asa.
 Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del medio de
cultivo ni otra colonia vecina.
 Sembrar por estría en los medios diferenciales empezando por el agar citrato, urea (en la
superficie), TSI, LIA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo, retirar por el
mismo trazo y sembrar en estría la parte inclinada), caldo para la prueba de indol.
 Sembrar por puntura en el centro del agar movilidad hasta una profundidad aproximada de 1.5
cm.
 Incubar a 35 – 37° C de 18 a 24 horas.

a. TSI

Agar hierro de Kligler

Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y
Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína.
Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa.
Productos: Ácidos mixtos y H2S.
Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+.
Medio de cultivo
Agar hierro de klinger (AHK) Composición:

 Extracto de carne
 Extracto de levadura
 Peptona
 Proteasa
 Lactosa
 Dextrosa
 Sulfato ferroso Cloruro de Na
 Tiosulfato de Na
  Agar
 Agua destilada
 Indicador: Rojo fenol
 Ácido: amarillo A
 Alcalino: Rojo
 Medio no inoculado: naranja rojizo, pH 7.4
Procedimiento
Inoculación: picadura y estría en pico de flauta. Tiempo: 18-24 hrs Temperatura:35-37°C
Resultados
Es importante hacer la lectura entre las 18 - 24 horas para no obtener resultados erróneos.La lectura se
hace sobre la base de tres características:
 Utilización de hidratos de carbono:
− Utilización de lactosa: Reacción ácida en el pico de flauta (color
amarillo).Abreviatura: (A).
− Utilización de glucosa: Reacción ácida en la columna del medio (color
amarillo).Abreviatura: (A).
− No hay utilización del carbohidrato: Se puede observar una reacción
alcalina (color rojo) o que no hay cambio de color (permanece del
mismo color que el medio no inoculado).Abreviaturas: (K) o (N).
 Producción de gas de glucosa:
− Se considera positivo: Presencia de una sola burbuja de gas, burbujas en el medio, división del medio,
desplazamiento completo del medio del fondo del tubo dejando un área clara o una ligera muesca del
medio en el costado del tubo.

 Producción de ácido sulfhídrico:

− Se manifiesta por un color negro distribuido por toda la columna del medio de cultivo o sólo en la parte
superior.
Controles
Columna vertical (fondo) Superficie inclinada (Pico de flauta)
E. coli (lactosa positivo) amarillo/ gas amarillo
Shigella amarillo/sin gas rojo
Salmonella paratyphi B amarillo/negro/con gas rojo
 b. LIA
Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para
formar una amina con la consiguiente alcalinidad.
Medio base de descarboxilasas u otros medios como LIA.
Sustrato: Aminoácidos (lisina,).
Enzimas: Descarboxilasas.
Producto: Amoníaco.
Indicador: Púrpura de bromocresol.
Medio de cultivo
Base de descarboxilasa de Moller Composición:

 Peptona Extracto de carne Piridoxal

 L-lisina Citrato de amonio
 Tiosulfato de sodio Glucosa
 Agua destilada
 Agar Indicador de pH: Purpura de bromocresol
 Ácido: Amarillo pH 5.2
 Alcalino: Púrpura pH 6.8
 Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0
Procedimiento
Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano. Temperatura: 35-37°C Tiempo 18-24 hrs
Resultado

 Ensayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillento

 Ensayo negativo: color amarillo
Tuvo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentador
de glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)

Negativo Positivo

c. SIM (H2S, indol, motilidad)

Medio SIM (medio semisólido)

Sustratos: Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína y triptófano.
Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y tiptofanasa.
Producto: H2S e Indol.
Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA).
Reactivos
Caldo triptófano (triptófano al 1%)
  Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g
 Cloruro de sodio 0,5 g
 Agua destila da 100 ml
Reactivo de Kovac

 Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml

 p-dimetilaminobenzaldehido 10 g
 HCI concentrado 50 ml
Reactivo de Ehrlich

 p-dimetilaminobenzaldehido 2 g
 Alcohol etílico 190 ml
 HCI concentrado 40 ml
Procedimiento
Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e incubar a 35 °C durante 18 a 24 horas.
Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared
del tubo. Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de
xilol. Esto no es necesario con el reactivo de
Resultados
Producción de H2S
En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados,
algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína
desulfurilasa. El gas incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado
negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.

Prueba positiva Prueba negativa

Producción de indol
Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y ácido
indol acético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido
formado un compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en la
superficie del medio.

Prueba positiva Prueba negativa

Movilidad
El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento
del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos
inmóviles solo crecerán en la zona inoculada.

d. Prueba de citrato
Para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para su
metabolismo.

 Medio de Citrato de Simmons Sustrato:

Prueba negativaCitrato de sodio.
Prueba positiva
 Vía: Varias dependientes del pH del medio.
 Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO 2, lactato/Acetoína y CO 2 en
condiciones ácidas.
 Indicador: Azul de bromotimol.
Medio de cultivo
El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la fórmula de Simmons. El medio se coloca en
tubos inclinados (agar en pico de flauta).
La fórmula del medio de citrato de Simmons es la siguiente:

 Fosfato de amonio dihidrogenado 1 g

 Fosfato dipotasico 1 g
 Cloruro de sodio 5 g
 Citrato de sodio 2 g
 Sulfato de magnesio 0 ,20 g
 Agar 15 g
 Azul de bromotimol 0 ,08 g
 Agua destilada 1 L
 pH final = 6,9
Procedimiento
Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en
forma de estría única en el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35
°C durante 24 a 48 horas.
Resultados
a) Prueba positiva: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta, o presencia de colonias
en ausencia del color azul.
b) Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color (verde).

a. Hidrólisis de la urea (producción de ureasa)

Caldo urea o agar urea de Cristensen.

Sustrato: Urea.
Enzima: Ureasa.
Producto: Amoníaco.
Indicador: Rojo de fenol.
Es una diamida del ácido carbónico Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de
amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo
que produce alcalinización y aumento de pH del medio.
Medios de cultivo
Caldo urea de Stuart

 Extracto de levadura 0,1 g

 Fosfato monopotasico 9,1 g
 Fosfato disodico 9,5 g
 Urea 20 g
 Rojo fenol 0,01 g
 Agua destilada 1 L
 pH final = 6,8
Agar urea de Christensen

 Peptona 1g
 Glucosa 1 g
 Cloruro de sodio 5 g
 Fosfato monopotasico 2 g
 Urea 20 g
 Rojo fenol 0 ,012 g
 Agar 15 g
 Agua destilada 1 L
 pH final = 6,8
Procedimiento
El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar. La superficie
inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estría con el microorganismo por probar. Ambos
medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas.
Resultados
Caldo de Stuart: Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrolisis de la urea.
Agar de Christensen: Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el
medio. Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo solo en el pico
de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.
Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original.

Controles
Negativo: E.coli
Positivo: Klebsiella pneumoniae
Flujo de trabajo

- Pseudomonas
- Salmonella

+ Glucosa Providencia
(-)Moviles Urea +
Proteus

Lactosa (-)Inmoviles SH2 (-) - Shiguella

- Enterobacter
- Urea

- Indol + Klebsiella o Proteus

- Echerichia
+ Citrato

+ Citrobacter
Bibliografía
Sacsaquispe CR. Manual de procedimientos bacteriológicos en infecciones
intrahospitalarias [Internet]. [Citado 5 Noviembre 2020]. Disponible
en:file:///C:/Users/PERSONAL/Downloads/Manual%20de%20procedimientos
%20bacteriologicos%20en%20infecciones%20intrahospitalarias.pdf
Slideshare. [internet]. Gonzales G; 2014. [Citado el 6 de Noviembre 2020].Disponible en:
https://es.slideshare.net/SusanaGG/pruebas-bioqumicas
Slideshare. [Internet]. Medios De Cultivo Y Pruebas Bioquímica 2008. [Citado el 6 de
Noviembre 2020].Disponible en: https://es.slideshare.net/SusanaGG/pruebas-
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