UNIDAD 5: APLICACIÓN DE TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS Y

ENZIMOHISTOQUÍMICAS

Módulo profesional: Procesamiento citológico y tisular

INTRODUCCIÓN
En esta unidad didáctica se concreta el proceso de tinción histoquímica para la detección específica de
sustancias, describiendo las técnicas más habituales para la identificación de glúcidos, lípidos,
proteínas, ácidos nucleicos, pigmentos, iones metálicos y enzimas. La diferenciación de enzimas,
debido a su importancia fisiológica, tiene un papel protagonista en esta unidad, en donde incluso se
describen los principales tipos de enzimas presentes en nuestro organismo.

Cabe destacar que, actualmente, muchas de las tinciones histoquímicas han sido sustituidas por
técnicas moleculares de detección, más fiables y rápidas y menos laboriosas.

1. TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS DE TINCIÓN

La Histoquímica es una rama de la Histología que busca la localización microscópica tisular in situ de
sustancias mediante reacciones químicas. Dentro de la Histoquímica existe una subdivisión que no se
encarga de medir biomoléculas o estructuras químicas, si no que evalúa las actividades enzimáticas de
las proteínas tisulares, es la llamada Enzimohistoquímica o Histología Enzimática.

Los mecanismos de tinción de tipo histoquímico se dividen en dos grupos: directos e indirectos. En las
tinciones histoquímicas directas el colorante posee la capacidad de teñir directamente la sustancia en
estudio, mientras que en las tinciones indirectas el colorante, al entrar en contacto con su objetivo,
reacciona químicamente con él, tiñéndolo.

Las técnicas histoquímicas se emplean cuando los colorantes tradicionales no permiten la

diferenciación y localización de sustancias específicas. Con el objetivo de obtener un resultado clínico
fiable, es importante realizar el procesado del tejido teniendo en cuenta el tipo de tinción histoquímica
que se va a aplicar, ya que algunos reactivos empleados durante la fijación o inclusión podrían dañar la
estructura de la molécula que queremos identificar, enmascarando su presencia en el tejido.

En el análisis de una tinción histoquímica es indispensable un buen diseño experimental mediante el

uso de ciertos controles que permitan la concreción de los resultados. Se define el control positivo
como aquella muestra, analizada paralelamente a la muestra problema, en la que se conoce a priori la
presencia de la molécula a detectar, es decir, confirma el buen funcionamiento de la técnica de
detección, tanto a nivel de protocolo como de los reactivos empleados. Si en el control positivo no se
detecta la molécula significa que ha habido algún problema y no podemos confirmar si la muestra
problema posee la molécula o no. El control negativo o control basal se realiza sobre una preparación
en la que se sabe previamente que no existe la molécula en estudio, es decir, se obtiene el nivel de
tinción que habría en las muestras sin la molécula en cuestión. Por ejemplo, si aparece señal intensa de
marcaje en el control negativo, el resultado obtenido en el análisis paralelo de la muestra problema no
sería fiable, ya que se dudaría de si se debe a la presencia de la molécula o a algún artefacto.
La interpretación de los controles experimentales junto con la muestra problema tiene como finalidad
evitar los errores de diagnóstico, sobre todo el llamado falso negativo. En este caso, la muestra sí
contiene la molécula en estudio pero por un error de manipulación, no se ha detectado. Esto provocaría
que la muestra se diagnostique como no patológica cuando sí lo es, con el consiguiente problema a la
hora de la detección precoz de la enfermedad. Además, habitualmente, cuando el resultado del análisis
es negativo, no se suele repetir, a no ser que haya indicios de que algo se ha hecho mal. En el resultado
de tipo falso positivo, debido a un artefacto o a una contaminación, la muestra en estudio aparece con
señal específica de la molécula patológica, por lo que se diagnostica como patológica. En ese caso sí
que suele realizarse un segundo análisis o contraanálisis para confirmar el resultado, por lo que se
podría detectar el error experimental.

Tinción PAS para glúcidos

2. TIPOS DE TINCIONES HISTOQUÍMICAS

Las tinciones histoquímicas se clasifican en función de las moléculas que detectan específicamente.
Así, existen tinciones específicas para visualizar glúcidos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos,
pigmentos o iones metálicos.

Además, otras técnicas histoquímicas, detectan diversos tipos de actividades enzimáticas.

2.1 Glúcidos o hidratos de carbono : son polialcoholes oxidados formados por Carbono,
Hidrógeno y Oxígeno. Según su tamaño, los glúcidos se dividen en monosacáridos, oligosacáridos y
polisacáridos. Los monosacáridos y oligosacáridos son los glúcidos más sencillos y, debido a su
elevada solubilidad en agua, son biomoléculas que se disuelven durante el procesado del tejido, por lo
que no pueden ser detectados mediante el protocolo histológico tradicional. Los polisacáridos, por el
contrario, son insolubles en agua, y pueden ser detectados histoquímicamente al permanecer en las
preparaciones histológicas.

Los polisacáridos se clasifican en dos grandes grupos según su composición química: simples y
complejos. Los simples o homopolisacáridos son moléculas lineales con ramificaciones esporádicas
formadas por repeticiones de la misma subunidad, en cambio, los complejos o heteropolisacáridos,
están conformados por biomoléculas de diferente naturaleza.

Principales tipos de glúcidos presentes en animales y algunos ejemplos de cada uno de ellos:
∙ Monosacáridos: glucosa, fructosa, ribosa.
∙ Disacáridos: sacarosa, maltosa, lactosa.
∙ Oligosacáridos: el grupo más importante de los oligosacáridos es el de los disacáridos, o azúcares
dobles, que son la unión de dos monosacáridos, mediante pérdida de una molécula de agua formando
así un enlace tipo éter
∙ Polisacáridos:
o Homopolisacáridos: Glucógeno.
o Heteropolisacáridos: Ácido hialurónico.
▪ Mucopolisacáridos
▪ Ácidos
▪ Neutros
o Mucolípidos
o Mucoproteínas

En la detección tisular de cada tipo de glúcidos se emplea preferentemente un determinado colorante.

La identificación de los glúcidos en muestras clínicas es muy importante porque ciertas alteraciones
patológicas se caracterizan por la acumulación anormal de glúcidos como el glucógeno, principal
molécula glucídica de reserva energética existente en células animales.

La tinción histoquímica más habitual para glúcidos es la tinción de PAS o del Ácido Peryódico de
Schiff. El llamado reactivo de Shiff, preparado a partir de fucsina básica y ácido sulfuroso, es un
colorante incoloro que, en contacto con los grupos aldehídos, produce una reacción colorimétrica rojiza.
Más concretamente, el ácido peryódico en disolución acuosa oxida los grupos hidroxilos presentes en
determinados glúcidos y los transforma en aldehídos, que se unirán covalentemente al reactivo de Shiff
para formar un precipitado rojizo intenso. Cabe destacar que cuando la señal observada sea
insuficiente o excesiva, puede modificarse el tiempo y/o la temperatura de incubación para optimizar
el resultado del marcaje.

Antes de iniciar la tinción, se debe atemperar el reactivo de Schiff, ya que se conserva en oscuridad en
el frigorífico para mantener su estabilidad. En el primer paso del protocolo se sumerge la preparación
en ácido peryódico durante 5-10 min para oxidar los grupos hidroxilos. Tras un lavado en agua
corriente durante un tiempo similar, se aplica el reactivo de Schiff al 1% durante 1-20 min a
temperatura ambiente. Posteriormente se introduce en bisulfito sódico 3-5 min para aclarar el reactivo
de Schiff y se vuelve a lavar con agua corriente. Finalmente, se tiñe con hematoxilina de Carazzi durante
3-5 min, que otorgará contraste para los núcleos. Una vez realizado el último lavado con agua corriente
y tras el montaje, la preparación está lista para ser visualizada: se observan los núcleos azules, el
glucógeno morado/magenta intenso y el material positivo para PAS de color rosado. La tinción PAS se
emplea para el diagnóstico clínico de patologías renales y de algunos cánceres que acumulan
glucógeno.

Tinción PAS para glúcidos.

Identificación de depósitos de glucógeno y polisacáridos no ácidos
Los polisacáridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido peryódico al poseer radicales ácidos en
lugar de hidroxilo. Para la identificación de este tipo de glúcidos se usa la tinción con azul alcián. Este
colorante, con carga positiva, formará uniones de tipo electrostático con las regiones aniónicas de los
colorantes ácidos. El protocolo habitual se inicia con una acidificación débil durante 5 min con ácido
acético, aplicando a continuación el azul alcián 1% durante 20-30 min. Tras un lavado con agua
corriente, se aplica el colorante nuclear (hematoxilina de Carazzi) y se lava con agua destilada. Los
glúcidos ácidos se tiñen con una coloración que va desde azul a verde, adoptando los núcleos una
tonalidad grisácea oscura.

Tinción azul alcián para polisacáridos ácidos

Los polisacáridos más representativos y la técnica más habitual para identificar su presencia:
∙ Glucógeno:
Localización: hígado, músculo esquelético, corazón.
Técnica: PAS

∙ Mucina neutra:
Localización: glándulas duodenales y gástricas.
Técnica: PAS

∙ Mucolípidos:
Localización: generalizada (membranas).
Técnica: PAS

∙ Mucoproteínas:
Localización: generalizada (membranas).
Técnica: PAS

∙ Mucina ácida:
Localización: epitelio calciforme intestinal.
Técnica: PAS

∙ Ácido hialurónica:
Localización: cordón umbilical, tejido conectivo dérmico.
Técnica: azul alcián, azul toluidina.

∙ Glucógeno:
Localización: cartílago.
Técnica: azul alcián, azul toluidina
Con una finalidad similar a la del azul alcián, es frecuente el empleo de azul de toluidina. Este
colorante, de tipo orto-metacromático, tiñe los polisacáridos ácidos de tonalidades que van del propio
azul al rojo, pasando por el violeta
En la mayoría de estudios histológicos, para describir la diversidad de glúcidos presentes, se aplica al
mismo tiempo la tinción PAS y el azul alcián, ya que son compatibles metodológicamente. Asumiendo
un lavado tras cada colorante, el protocolo aplica sucesivamente azul alcián, ácido peryódico, reactivo
de Schiff y hematoxilina de Harris. Así, mediante esta técnica diferencial se detecta la presencia de
mucopolisacáridos ácidos, teñidos de azul, mucopolisacáridos neutros y glicoproteínas teñidos de
rojo-rosa y, usando hematoxilina para las regiones ácidas, el resto de glúcidos adoptan una coloración
violácea. La tinción de PAS/azul alcián se emplea para la identificación de adenocarcinomas o
metaplasias premalignas.

Tinción diferencial PAS/azul alcián para polisacáridos

Existen otras técnicas de tinción de glúcidos o análogos, como por ejemplo, la tinción con hierro
coloidal, empleada para la detección de mucinas ácidas en escasa proporción, o la tinción con Rojo
Congo, utilizada para la identificación de amiloidosis.

Tinción con Rojo Congo para la detección de amiloidosis en riñón

2.2 Lípidos o grasas : sustancias total o parcialmente insolubles en agua pero solubles en
cloroformo, etanol o acetona. Esta solubilidad en disolventes orgánicos dificulta el procesado del tejido
para la visualización de lípidos porque el protocolo tradicional emplea, ente otros, etanol y xilol. Por
este motivo es primordial aplicar protocolos especiales de fijación, inclusión y tinción que eviten la
destrucción de los lípidos de la muestra. Por ejemplo, se realiza la fijación por congelación y/o con
formalina, la inclusión se lleva a cabo en bloques de gelatina y las técnicas colorantes están diseñadas
específicamente para los lípidos.

Desde un punto de vista fisiológico los lípidos mantienen la temperatura corporal funcionando como
aislantes térmicos, protegen mecánicamente ciertas estructuras y, sobre todo, funcionan como
depósitos energéticos, siendo utilizados una vez que ya se han consumido los glúcidos de reserva.

Histológicamente, los lípidos conforman un tipo de tejido conjuntivo en cuyas células o adipocitos se
acumula materia grasa compuesta por una mezcla de ácidos grasos, triglicéridos y colesterol. En los
tejidos, además, pueden aparecer grandes acumulaciones de lípidos en forma de gota o inclusiones.
Los lípidos presentan una distribución corporal muy amplia, abundando a nivel subcutáneo, en las
palmas de las manos, plantas de los pies y en la zona adyacente a los riñones.

Existen varios criterios para la clasificación de los lípidos. Según su composición química se dividen
en lípidos homofásicos o sencillos y lípidos heterofásicos o complejos.

Los lípidos homofásicos o sencillos poseen ácidos grasos como estructura característica y se
encuentran en el citoplasma formando gotas bien definidas debido a su carácter hidrófobo. Son
ejemplos de lípidos homofásicos los triglicéridos o el colesterol.

Los lípidos heterofásicos o complejos, por el contrario, están constituidos por la unión de un lípido
sencillo con otro tipo de molécula. Así, por ejemplo, los fosfolípidos incorporan un ácido fosfórico, los
glucolípidos añaden diferentes hidratos de carbono y las lipoproteínas son el resultado de la
conjugación de un lípido con una porción proteica. Es importante destacar que la caracterización
histoquímica de los lípidos complejos resulta difícil debido a la diversidad molecular que los conforma.

En relación con la diversidad de lípidos existentes, los ácidos grasos son considerados como los
grasas de reserva. Su degradación aporta energía, en caso de requerimiento energético y, en caso
contrario, son almacenados en forma de triglicéridos para un uso posterior. Los fosfolípidos son los
lípidos más abundantes y constituyen la mayoría de estructuras membranosas a modo de bicapa
lipídica. El colesterol (colesterina) es un lípido de origen exógeno y endógeno que puede provocar
oclusiones arteriales debido a su depósito inadecuado. Finalmente, como se ha mencionado con
anterioridad, los glucolípidos y lipoproteínas predominan en la estabilización y transporte de las
membranas celurares

El fundamento de las tinciones para lípidos consiste en que las moléculas colorantes empleadas deben
ser más solubles en los lípidos que en la disolución comercial en la que están disueltos, es decir, las
moléculas de colorante poseen más afinidad por los lípidos, por lo que provocan su coloración al
disolverse en ellos. Además, hay que tener presente que los lípidos, al ser apolares, no reaccionan con
los grupos iónicos cargados de los colorantes hidrosolubles vistos hasta el momento, y se deben
emplear sustancias no polares.

Las tinciones de lípidos suelen dirigirse a los lípidos de tipo homofásico, empleando colorantes tipo
Sudán y el Oil-Red-O. La tinción de Oil-Red-O emplea propilenglicol para la estabilización de las grasas,
que tiñe los lípidos de rojo y la hematoxilina, colorea los núcleos de azul.

Tinción con Oil-Red-O para la identificación de lípidos en hígado

Respecto a los tintes Sudán, existen varios tipos: Sudán III, Sudán IV o Escarlata R y Negro Sudán. La
tinción Sudán III (con hematoxilina) es una de las más empleadas, sobre todo en triglicéridos, tiñendo
los lípidos de rojo intenso y los núcleos de azul.
 Tinción con Sudán III para la identificación de lípidos en parénquima pulmonar

2.3 Proteínas: Las tinciones histoquímicas de proteínas están actualmente en desuso ya que los
métodos inmunohistoquímicos caracterizan más eficientemente los tipos de proteínas, no por
reacciones químicas, sino mediante el empleo de anticuerpos específicos. En su momento, el método
más habitual de tinción era la combinación Schiff-ninhidrina. La ninhidrina provoca una sustitución de
los grupos amino de las proteínas por grupos carbonilos, químicamente similares a los grupos
hidroxilo. De este modo, el reactivo de Schiff reaccionará con los grupos carbonilo provocando su
coloración, análogamente a lo que ocurre en la técnica PAS para glúcidos.

Tinción con Schiff-ninhidrina. Marcaje con rojo/púrpura intenso de las regiones proteicas

2.4 Ácidos nucleicos: son las moléculas encargadas de contener y gestionar la información
genética de la célula. Los ácidos nucleicos están compuestos por unos monómeros denominados
nucleótidos que, químicamente, están formados por la conjugación de una pentosa (ribosa o
desoxirribosa), una base nitrogenada (guanina, citosina, adenina, timina o uracilo) y el ácido fosfórico,
que con su carga neta negativa, otorga el carácter ácido a estas biomoléculas.

Los ácidos nucleicos se dividen en dos grupos en función de la pentosa que conforma el nucleótido.
Así, los que contienen desoxirribosa forman el ácido desoxirribonucleico (ADN) y los que incluyen
ribosa el ácido ribonucleico (ARN). A su vez, dentro del ARN existen varios tipos según sus funciones
fisiológicas y localización, como por ejemplo, el ARN mensajero (ARNm), el ARN ribosómico (ARNr) o el
ARN de transferencia (ARNt). En cuanto a la estructura general, la del ADN, es de doble cadena
helicoidal, la estructura más frecuente del ARN es monocatenaria.

Las tinciones dirigidas a los ácidos nucleicos nucleares tienen como objetivo definir la morfología del
núcleo. Por ejemplo, la técnica de Feulgen detecta ADN realizando una fase de hidrólisis inicial que deja
en superficie los grupos carbonilo y, posteriormente, detecta dichos grupos añadiendo el reactivo de
Schiff. Además, como la distancia existente entre grupos carbonilo del ADN y ARN es diferente, siendo
menor en el ARN, se produce un impedimento estérico para que el reactivo de Schiff no reaccione con el
ARN, por lo que teñirá de rosa exclusivamente las moléculas de ADN.

Otras técnicas, como la tinción verde metilo-pironina, logran discernir entre ADN y ARN mediante una
coloración diferencial, llegando incluso a la obtención de un resultado semicuantitativo. Este protocolo
se basa en la aplicación simultánea de dos colorantes básicos con diferente tamaño molecular y a un
determinado pH para que se unan específicamente a los grupos fosfato de cada tipo de ácido nucleico.
El catión de verde metilo, al poseer más necesidad electrostática, desplazará a la pironina y se unirá
rápidamente a la doble hélice del ADN que posee mayor carga neta negativa, por otro lado, la pironina,
debido a su estructura aplanada y menor carga positiva, no logra entrar en la doble hélice del ADN y se
unirá a las monocadenas del ARN. El resultado de la tinción en el núcleo logra una coloración azul
verdosa en la cromatina (ADN) y rojo brillante en el nucléolo, tiñendo además de tonos rojizos el ARN
citoplasmático.

En la actualidad ha disminuido notablemente la frecuencia de uso de las técnicas histoquímicas

propiamente dichas, es decir, las que sólo están regidas por la detección química-enzimática, para la
detección y diferenciación de ácidos nucleicos debido, sobre todo, a la dificultad de elaboración de los
protocolos y a la aparición de técnicas moleculares e inmunológicas de marcaje.

Tinción diferencial para ácidos nucleicos mediante la técnica verde metilo en la que se observa en la célula central
la tonalidad rojiza que indica un exceso de ARNr en el citoplasma.
2.5 Pigmentos: sustancias que poseen coloración de manera natural. Según su procedencia, los
pigmentos se clasifican en pigmentos endógenos, cuando se originan en el propio organismo a partir
de sustancias no coloreadas, y pigmentos exógenos, que son aquellos que proceden del medio externo.
Se consideran pigmentos exógenos las partículas de polvo en suspensión, el humo del tabaco, los
tintes empleados en un tatuaje…
Los pigmentos endógenos se clasifican en dos grandes grupos según si tienen su origen en la
molécula de la hemoglobina o no. Entre los pigmentos hemoglobinógenos destacan la hemoglobina y la
hemosiderina, ambos con una base férrica, y la hematoidina y la bilirrubina como no férricos.
El subgrupo de los llamados no hemoglobinógenos está formado principalmente por la melanina, la
lipofucsina y el ceroide:
∙ Hemoglobinóbenos:
o Hemoglobina (bencidina)
o Hemosiderina (azul de Perls/asul de Turnbull)
o Pigmentos no férricos
▪ Hematoidina (Gmelin)
▪ Bilirrubina (Gmelin/Hall)
∙ No hemoglobinógenos
o Melanina (Masson-Fontana)
 o Lipofucsina (Sudán negro)
o Ceroide (Ziehl-Neelsen)

Principales pigmentos:
∙ La detección de la hemoglobina, proteína transportadora de oxígeno de los hematíes, se basa, por un
lado, en la propiedad que posee dicha proteína para catalizar la descomposición del agua oxigenada en
agua y oxígeno molecular, y por otro, en la rápida oxidación que sufre un compuesto llamado bencidina,
originando benzopurpurina, con una coloración azul verdosa. Así, sobre la muestra se aplica agua
oxigenada y, a continuación, bencidina. Si existe hemoglobina, ésta acelerará la descomposición del
agua oxigenada y provocará la aparición de oxígeno molecular que hará que la bencidina vire a
azul-verde. En caso de ausencia de hemoglobina, no aparece esta coloración característica.
∙ La hemosiderina es un pigmento amarillo oscuro que aparece asociado al hierro en forma de cristales
citoplasmáticos. Cuando un individuo posee exceso de hierro puede llegar a ser patológico en la
llamada hemosiderosis. La detección de la hemosiderina se realiza indirectamente a través de la
detección de hierro, ya que están íntimamente relacionados. La tinción del azul de Perls, también
llamado azul de Prusia, pone de manifiesto las acumulaciones del catión férrico (Fe+3) en los tejidos a
través de una reacción con ferrocianuro potásico y ácido clorhídrico que produce un precipitado azul
turquesa. Otra técnica empleada para la detección de hemosiderina es la tinción con azul Turnbull que,
en este caso, identifica el catión ferroso (Fe+2), en general, poco abundante en los tejidos, salvo en
casos patológicos.

Tinción con azul de Perls para la detección de hemosiderina.

∙ La hematoidina y bilirrubina son pigmentos amarillentos no férricos procedentes de la

descomposición de la hemoglobina. Pueden ser detectados en conjunto mediante la técnica de Gmelin,
que consiste en la aplicación de ácido nítrico, el cual transforma ambos en biliverdina, generando un
color verde azulado. Si el objetivo es la diferenciación de ambos pigmentos, la bilirrubina puede
identificarse de manera específica mediante el método de Hall, en el que se añade el reactivo de
Fouchet, sustancia que sólo transformará la bilirrubina en biliverdina, con el cambio de color de
amarillo a verde intenso.

Tinción de Hall para la detección de bilirrubina.

∙ La melanina es un pigmento no hemoglobinógeno presente de forma natural en el cabello, piel e iris,
que puede ser identificado gracias a la técnica de Masson-Fontana. Esta tinción se basa en el fenómeno
de argentinidad según el cual la melanina es capaz de reducir el catión de plata Ag+ a plata sólida, por
lo que precipita en su superficie como un granulado negro. Los depósitos de plata indicarían la
presencia de melanina sin embargo, en la actualidad, es una técnica en desuso, ya que se detectaron
numerosos falsos positivos cuando se intentaban asociar los depósitos de melanina con ciertas
enfermedades tumorales.

Tinción de Masson-Fontana para la detección de melanina.

Otros pigmentos no hemoglobinógenos menos importantes desde un punto de vista clínico son la
lipofucsina, rara vez asociado con patologías y que se detecta con colorantes tipo Sudán; y el ceroide,
que es un pigmento amarillento característico de hígados con cirrosis que se detecta típicamente con la
tinción de Ziehl-Neelsen.

2.6 Iones metálicos: La detección de iones metálicos mediante técnicas histoquímicas son
procedimientos poco empleados en la actualidad, por lo que simplemente describiremos algunos
protocolos utilizados para la identificación tisular de dos de los cationes más analizados: calcio y
cobre.

Las sales de calcio forman parte de manera natural de las estructuras duras del organismo (huesos y
dientes), sin embargo, hay que tener presente que su aparición como calcificaciones en otras regiones
puede ser un signo de un proceso carcinogénico. La técnica de Von Kossa añade una sal de plata
(nitrato) y se produce una sustitución del catión de calcio del tejido por el de plata, coloreando de negro
las regiones con depósitos cálcicos iniciales.

El cobre es un elemento químico que debería aparecer acumulado exclusivamente en el hígado. Al igual
que ocurre con el calcio, la presencia de cobre en otras localizaciones está asociada a procesos
patológicos. La técnica del ácido rubeánico o de la rodamina detecta los depósitos de cobre como
acumulaciones granulosas de color verde muy oscuro o marrón rojizo, respectivamente.

3. FUNDAMENTOS, CONTROLES Y APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE

HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA
Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica responsables de la catálisis de las reacciones
químicas existentes en nuestro organismo. El mecanismo de acción de las enzimas se inicia con la
unión al sustrato y, tras una fase intermedia en la que aparece el complejo enzima-sustrato, finaliza con
la transformación de los reactivos en productos primarios de la reacción.
 Esquema general del mecanismo de acción de las enzimas.

La histoquímica enzimática o histoenzimología se define como la rama de la Histología que tiene como
objetivo la detección de enzimas en preparaciones tisulares. Esta técnica se fundamenta en la
capacidad que poseen ciertas enzimas para mantener funcional su centro activo tras el procesado de la
muestra. Este hecho hace que, añadiendo un determinado sustrato, la enzima lo metabolice
produciendo una coloración, directa o indirectamente. De este modo, mediante la histoenzimología se
logra la localización específica de la enzima en la preparación histológica.

El producto primario de reacción generado por la enzima puede poseer intrínsecamente coloración,
siendo la identificación sencilla y directa, o puede ser incoloro, en cuyo caso debe ser asociado con un
cromóforo que le otorgue coloración para su posterior visualización.

La interpretación correcta de un análisis histoenzimático requiere el empleo de controles positivos y

negativos ya que la posibilidad de marcajes inespecíficos o el mal funcionamiento de la técnica
provocarían un diagnóstico erróneo como falso positivo o falso negativo, respectivamente. En el falso
negativo no se detectaría la proteína, existiendo y en el falso positivo se detectaría sin existir.

El control negativo consiste en analizar, paralelamente a la muestra problema, una preparación en la

que está confirmada la ausencia de la enzima en estudio, por lo que no existirá marcaje. Análogamente,
el control positivo se realiza analizando una preparación en la que sabemos que está presente dicha
enzima y la señal de marcaje está asegurada. Si en el control positivo aparece señal y en el negativo no,
el resultado de la muestra problema debería ser fiable. En algún caso podría ocurrir que, siendo
correctos los controles y existiendo la enzima en la muestra problema, no apareciese señal debido a su
indetectable cantidad por el procedimiento histoquímico. Esta posibilidad de falsos negativos es uno de
los motivos por los que las técnicas histoquímicas están siendo sustituidas por protocolos
inmunohistoquímicos e, incluso, por técnicas moleculares.

En la siguiente tabla se plantean diferentes supuestos en los que se interpretan los controles,
concretamente se analiza la presencia de una enzima exclusiva de células tumorales: el símbolo √
indica la presencia de coloración tras el protocolo histoquímico y el símbolo X la ausencia de señal:

Muestra Proteína Muestra Control + Control - Interpretación

cancerosa problema

1 Presente √ √ X Confirmada presencia

de proteína cancerosa

2 Presente √ √ √ Diagnóstico NO fiable al

existir señal en control -

3 Presente √ X X Diagnóstico NO fiable

 al no existir señal en
control +

4 Presente X √ X Falso negativo.

(escasa) Proteína no detectada por
estar en baja cantidad

5 Ausente X √ X Confirmada ausencia de

proteína cancerosa

6 Ausente √ √ √ Falso positivo

por contaminación.
Aparece señal en control -

A la hora de realizar una tinción histoenzimología es obligatorio tener en cuenta que las enzimas
poseen un óptimo de actividad a un pH y temperatura determinados. Además, durante el procesado de
la muestra está contraindicada la inclusión de la muestra en parafina convencional ya que los periodos
de deshidratación y los cambios de temperatura pueden provocar el deterioro de los centros activos,
impidiendo así la detección de una enzima que inicialmente existía en el tejido (falso negativo).

El desarrollo del protocolo de la tinción histoenzimología debe ser muy preciso porque es necesario
controlar el pH de la reacción enzimática, que habitualmente será un pH fisiológico neutro. Además, la
concentración del sustrato añadido debe ser la adecuada para que no existan impedimentos
estequiométricos y tanto el sustrato como la enzima deben ser insolubles en el medio en el que se
produce la reacción porque, en caso contrario, la coloración se detectaría en una posición diferente a la
que ocupaba la enzima inicialmente. Por último, es importante sopesar la presencia de inhibidores de
la actividad enzimática que podrían enmascarar la presencia de la enzima en estudio.

La técnica de tinción consiste en una incubación de la muestra con una cierta cantidad de sustrato en
unas condiciones físico-químicas controladas. El medio de incubación suele estar formado por el
sustrato característico de la enzima buscada y un cromógeno que, en presencia del producto
enzimático, colorea la región. Si no existe la enzima no habrá producto y, en consecuencia, no habrá
coloración.

Las enzimas detectadas habitualmente mediante las técnicas histoenzimológicas son las peroxidadas,
deshidrogenasas, fosfatasas, diaforasas, acetilcolinestarasas y esterasas, en general. En el siguiente
apartado se describen brevemente las características de estas enzimas empleadas en el diagnóstico
clínico de cortes histológicos.

Aplicaciones de técnicas histoenzimológicas. Detección de actividad cloroacetato esterasa en azul (izquierda).

Marcaje de actividad peroxidasa en azul (derecha).

4. CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA PARA

LA CONSERVACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La diversidad de enzimas existente es tan amplia que la definición de una nomenclatura universal y
precisa es indispensable. En 1964 la Organización de Enzimas, organismo incluido en la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, redactó la normativa a seguir para la identificación de
cada enzima El nombre de una enzima está compuesto por el nombre del sustrato característico, el
nombre de la reacción química que cataliza, y el sufijo –asa. Por ejemplo, la enzima glutatión
transferasa realiza una reacción de transferencia de un grupo funcional en la molécula de glutatión.
Además, esta organización clasificó las enzimas según su función en seis grandes grupos:
oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.

Clasificación de las enzimas y reacción que catalizan

El principal problema de las técnicas histoenzimológicas es la dificultad para mantener intacto el

centro activo de las enzimas durante el procesado de la muestra en estudio. Cualquier degradación o
modificación del centro activo provocaría la no detección de la enzima en la muestra, dando lugar al
denominado falso negativo. Este error en el diagnóstico es el más grave ya que, suponiendo que la
presencia de una determinada enzima está relacionada con una patología, al no detectarse la enzima
se entiende que el paciente no sufre la enfermedad, hecho que conlleva un retraso en el diagnóstico
precoz.

El procesado de estas muestras no sigue el protocolo tradicional de fijación en formalina e inclusión en

parafina porque tanto el formol como el xilol alteran los residuos aminoacídicos de las enzimas,
limitando la funcionalidad del centro activo. Además, el incremento de temperatura necesario para la
elaboración de los bloques de parafina también inactivaría la reacción enzimática.

El protocolo general para histoenzimología varía el método de fijación, aplicando formol cálcico,
paraformaldehido o criogenizando la muestra con nitrógeno líquido. Los cortes se realizan en
vibratomo o en el criostato, según el método de fijación empleado previamente y, a continuación, se
realiza la incubación en recipientes que contienen el sustrato específico y las condiciones óptimas para
cada reacción enzimática
 Protocolo de procesado para la determinación de una actividad enzimática

La dificultad de puesta a punto de los protocolos unida a la frecuente aparición de falsos positivos y
negativos debidos al desplazamiento por difusión de las enzimas, a marcajes inespecíficos o a
contaminaciones bacterianas ha provocado el abandono progresivo de estas técnicas en favor de las
inmunohistoquímicas, mucho más fiables y específicas.

5. HISTOQUÍMICA DE LAS LECTINAS Y APLICACIONES

Las lectinas son unas biomoléculas de base proteica y con origen no inmune que poseen regiones
aminoacídicas capaces de reconocer y unirse de manera específica a ciertos residuos de una molécula
concreta. La distribución y función de las lectinas es muy variable, tanto en animales como en plantas.
Por ejemplo, en animales, intervienen en la gestión de las células defensivas de los tejidos dañados. En
Histología la principal aplicación de las lectinas se centra en el reconocimiento específico de diferentes
tipos de glúcidos porque las técnicas histoquímicas descritas hasta el momento los detectan en
conjunto, sin aclarar los tipos presentes en la muestra.

Existe un gran número de lectinas comerciales capaces de reconocer específicamente los diferentes
tipos de glúcidos. Estas moléculas reconocen monosacáridos, disacáridos o residuos específicos
dentro de una cadena mayor y, además, logran la detección específica de glúcidos tanto en su estado
libre como de aquellos conjugados en glucoproteínas o glucolípidos.

Empleo de lectinas para la determinación de los tipos de glúcidos intercalados en un epitelio. Detección de
glucosamina revelada con peroxidasa, produciendo coloración marrón (izquierda). Distribución de fucosa revelada
con fosfatasa alcalina, produciendo color azul (derecha)
Si bien la identificación del glúcido por la lectina es altamente efectiva, no lo es tanto su detección
visual. Para solucionar esta contrariedad se han asociado distintos marcadores fluorescentes o
inmunohistoquímicos a las lectinas para facilitar así la localización e identificación de cada tipo de
glúcido. Además, al igual que ocurría en el resto de protocolos histológicos, es necesario el
establecimiento de controles positivos, tomando como referencia muestras en las que se conoce
exactamente la composición y localización de cada tipo glúcido.

Aunque su principal aplicación es la diferenciación de glúcidos, las lectinas también se emplean para la
identificación de síntomas carcinógenos en la superficie de células sospechosas de sufrir procesos
neoplásicos. Asimismo, se usan para el estudio de los determinantes antigénicos en cualquier tipo de
proceso biológico, como por ejemplo, para estudios citogenéticos o en la definición de los grupos
sanguíneos.

Empleo de lectinas conjugadas con un fluoróforo verde para la determinación de glucoproteínas de membrana.