CGSAP TEMARIO PCT-UD 2 I.E.S.

“LOS COLEGIALES” (ANTEQUERA)

UNIDAD DIDÁCTICA 2

FIJACIÓN, DESCALCIFICACIÓN Y REBLANDECIMIENTO TISULAR

I DEFINICIÓN Y OBJETIVOS.
II PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACIÓN.
III TIPOS DE FIJACIÓN.
IV CLASES DE AGENTES FIJADORES SEGÚN SU MECANISMO DE ACTUACIÓN:
1 FIJACIÓN POR MÉTODOS FÍSICOS:
A) CONGELACIÓN.
B) CRIODESECACIÓN.
C) CRIOSUSTITUCIÓN.
2 FIJACIÓN POR MÉTODOS QUÍMICOS:
A) FUNDAMENTO.
B) CARACTERÍSTICAS DE UN FIJADOR IDEAL.
C) REGLAS GENERALES EN EL USO DE FIJADORES.
D) TIPOS DE FIJADORES:
1) SIMPLES: FORMOL.
2) MEZCLAS FIJADORAS:
a. LÍQUIDO DE BOUIN.
b. LÍQUIDO DE CARNOY.
V. FIJACIÓN EN MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA.
VI. TÉCNICAS ESPECIALES

VII. TRATAMIENTO Y ELIMINACIÓN DE VERTIDOS

VIII. CONCEPTO DE DESCALCIFICACIÓN

IX. AGENTES DESCALCIFICANTES

1) SOLUCIONES DESCALCIFICANTES MÁS UTILIZADAS

2) DESCALCIFICACIÓN QUÍMICA: NORMAS GENERALES

X. PROCEDIMIENTOS DE DESCALCIFICACIÓN

XII. PRUEBAS DE CONTROL SOBRE EL GRADO DE DESCALCIFICACIÓN TISULAR

XII. CONSERVACIÓN DE LOS TEJIDOS

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FIJACIÓN TISULAR

I. DEFINICIÓN Y OBJETIVOS
Fijar es interrumpir los procesos de degradación que aparece tras la muerte celular.
Tiene la finalidad de conservar la arquitectura y composición tisular lo más similar al
estado vivo, evitando la autolisis o autodigestión enzimática celular y la putrefacción
producida por las bacterias. Ambos procesos son favorecidos por la temperatura.
LAVADO POST-FIJACIÓN: Para eliminar los residuos del agente fijador.

Los objetivos son:

A. Conseguir que la imagen real y la imagen equivalente sean similares.

a) Imagen real: la que mostraría el tejido cuando aún se encontraba vivo.
b) Imagen equivalente: la obtenida después de la manipulación
histológica de los tejidos.
B. La imagen equivalente debe ser:
a) Constante: igual en todos los tejidos de distintos individuos.
b) Reproducible en todas las preparaciones histológicas de un mismo
tejido.
c) Ausente de artefactos, retracciones y desgarros.

II. PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACIÓN

A. No hay un fijador universal.
B. Fijación no es equivalente a conservación.
C. Un error en la fijación es irreparable. Es inútil trabajar con un tejido mal fijado.
D. Las muestras no deben ser superiores a 5 mm.

III. TIPOS DE FIJACIÓN

A. Según el estudio:
(1) Histológica o citológica: conservación de la arquitectura y estructura de los
tejidos y células.
(2) Histoquímica: preservar la composición molecular y bioquímica de los tejidos.
B. Según las fases:
(1) Primaria o inicial: realizada de forma inmediata sobre el tejido fresco.
(2) Secundaria o refijación: colocar el tejido ya fijado sobre un segundo fijador,
para demostrar algún componente tisular específico o simplemente para
intensificar la fijación inicial.

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IV. CLASES DE AGENTES FIJADORES SEGÚN SU MECANISMO DE ACTUACIÓN

1. FIJADORES POR MÉTODOS FÍSICOS

Utilizan el enfriamiento por congelación para evitar la autolisis y la putrefacción tisular. Se
utiliza para estudios morfológicos o funcionales que precisen conservar la estructura
antigénica. La clave de la correcta fijación es que sea instantánea su realización.

PROCEDIMIENTOS:

A. CONGELACIÓN: con ISOPENTANO (2 metilbutano) a -50º C, enfriado en nitrógeno líquido

a – 70º C durante 10 segundos, en tejido de no más de 3 cm2 de superficie y 3 mm de
espesor evitándose la formación de cristales y desgarros.
Inconveniente: el enfriamiento más lento, en nitrógeno líquido, provoca microcristales
intratisulares de hielo que producen rotura del tejido y dificultan el diagnóstico, al volver
el tejido quebradizo.

B. CRIODESECACIÓN O LIOFILIZACIÓN: fijación instantánea en nitrógeno líquido y posterior

desecación por sublimación del agua congelada (a vapor) en cámara de liofilización
Inconveniente: necesita utensilios caros y el procedimiento es complicado.
Ventaja: eliminación completa del agua tisular deteniendo completamente la autolisis.

C. CRIOSUSTITUCIÓN: sustitución lenta y progresiva del agua congelada en isopentano por

un líquido fijador, que a veces es el mismo medio de inclusión, como una mezcla de etanol,
acetona y Polietilenglicol. El intercambio se produce en condiciones de congelación.

2. FIJACIÓN POR MÉTODOS QUÍMICOS

A. FUNDAMENTO
Los fijadores químicos actúan desnaturalizando o insolubilizando las proteínas tisulares, para
detener la autolisis por inactivación enzimática. No destruye la célula.

B. CARACTERÍSTICAS DE UN FIJADOR QUÍMICO IDEAL

1) Producir un bloqueo inmediato de la autolisis: cuanto mayor sea esta
capacidad, mejor agente fijador. Depende de la velocidad de penetración o rapidez
para entrar en el interior del tejido, influyendo el tamaño de la pieza, y de la velocidad
de fijación o reacción química entre el fijador y proteínas, viene determinado por el
tiempo que el fijador tarda en precipitar y estabilizar los componentes químicos del
tejido. El formol entra rápido en el tejido (0,9-1 mm/h) pero lo fija lentamente.
2) Efecto bactericida: impide la putrefacción.
3) No provocar retracciones ni distorsiones, proceso que depende de la presión
osmótica de los tejidos (según el contenido en sales y proteínas). Si la presión osmótica
del tejido es superior que la del fijador, el agua es arrastrada hacia el interior del tejido,
produciéndose su hinchamiento, en caso contrario, el agua fluye hacia el fijador y
ocurre una retracción tisular. El tejido tiene P osmótica de unos 300 miliOsmoles.

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4) Debe inducir cambios en la textura y composición tisular que favorezca la

inclusión corte y coloración del material histológico. Depende sobre todo de su
capacidad para provocar desnaturalización proteica que determine el
endurecimiento óptimo.
5) Algunos fijadores tienen efecto mordiente.

C. REGLAS GENERALES EN EL USO DE FIJADORES

1. Colocar el tejido lo más rápidamente posible en el fijador (en el momento de la

extracción), para evitar la autolisis.
2. Las muestras deben de ser de poco espesor (<5 mm). Si son piezas quirúrgicas realizar
incisiones para favorecer la penetración o inyectar el fijador.
3. Proporción tejido/fijador: ideal 30 o 40 veces el volumen de la pieza, y mínimo 1/20.
4. La presión osmótica y el pH del fijador deben ser lo más aproximados al del tejido, se
añaden soluciones tampón pH 7,4 para evitar la retracción o hinchamiento del tejido.
5. El fijador debe estar en frascos etiquetados, de boca ancha y hermética, y añadir el
tejido sobre el fijador y no al revés.
6. Cada fijador tiene un tiempo de actuación que no se debe sobrepasar.
7. El tiempo de fijación depende del tipo de fijador y del tamaño de la pieza, varia de
horas hasta varios días. Su rapidez no mejora ni con calor, ni con frio.
8. La permanencia prolongada en el fijador perjudica la confección de los cortes, la
calidad, y la brillantez de las coloraciones.

D. LAVADO POST-FIJACIÓN

Consiste en el aclarado que se realiza después de la fijación. Tiene como objetivos:

▪ Limitar el tiempo de actuación del fijador.

▪ Impedir el contacto del fijador con los medios de inclusión.
▪ Se realiza con agua corriente, durante 24 a 48 horas, previa inmovilización de la muestra
(colocada en el fondo de un embudo, dentro de una muñequilla de gasa, y todo en un frasco
de boca ancha) Se deja caer un hilillo de agua continuamente.
▪ En caso de fijadores con a. pícrico, a. tricloroacético o alcohol, no usar agua para lavar, sino
alcohol de 70º en 3 baños de hora y media cada uno.

E. TIPOS DE FIJADORES

SIMPLES
Mecanismo de acción:
a. POR RETICULARIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
b. POR DESHIDRATACIÓN TISULAR
c. POR CAMBIOS EN EL ESTADO COLOIDAL
d. POR FORMACIÓN DE SALES

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MEZCLAS FIJADORAS
e. MEZCLAS FIJADORAS QUE CONTIENE FORMOL
f. MEZCLAS FIJADORAS QUE NO CONTIENEN FORMOL

1. FIJADORES SIMPLES

a. POR RETICULARIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS.

Fundamento: son fijadores que actúan por rotura de los puentes de hidrógeno de la
estructura helicoidal de las proteínas tisulares y posterior formación de una malla
polipeptídica, por asociación de grupos activos que han sido desenmascarados por el fijador.
Más comunes: Formol, Glutaraldehido y Tetróxido de Osmio.

FORMOL O FORMALDEHÍDO (CHOH): es un gas tóxico irritante para las mucosas que se
disuelve muy bien en agua. El que mejores prestaciones presenta. Reconocido como
potencial carcinógeno en humanos. Comercialmente lo podemos encontrar diluido al 35-40%
en agua y estabilizado con metanol, conocido como Formalina o Formol. La concentración de
formaldehído más utilizada es del 4% en tampón fosfato, como partimos de una solución de
formalina, esta concentración se obtiene diluyendo una parte de esta con nueve de agua.

Ventajas

1. Barato.
2. Buen fijador único. Ideal para estudios estructurales y de mielina (t. nervioso); fijador
excelente del tejido adiposo; para diferenciar sustancias amiloideas y ante cualquier
impregnación argéntica.
3. Buen conservante, ya que es un buen desinfectante y no endurece los tejidos en
exceso. Es óptimo para conservar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas.
4. Escasa retracción tisular (no deshidrata los tejidos).
5. Velocidad de penetración intermedia 0,9-1 mm a la hora.
6. Puede acelerarse o retrasarse la fijación modificando la temperatura. A temperatura
ambiente se consigue la fijación completa en 36 horas. A 55º C en solo 3 horas.
7. Es compatible con la mayoría de las tinciones.

Inconvenientes

1. Produce vapores irritantes en mucosas y conjuntiva. Gran toxicidad.

2. Se transforma progresivamente en ácido fórmico por acción de la luz y del oxígeno, el
cual disuelve la cromatina, dando núcleos “fantasma”, por lo que debe guardarse en frascos
opacos o emplearse en forma de solución neutra o tamponada.
3. Se consume durante el proceso, siempre debe ir en exceso.
4. Aparición del pigmento formólico (de color negro o pardo), en tejidos con sangre
como el bazo, que precipita y puede originar confusiones. Se elimina sumergiendo los cortes
en alcohol amoniacal.

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5. Debido a la baja presión osmótica de la formalina provoca una incorporación de agua

en el tejido que hace que su peso y volumen después de fijarlo aumente. Este efecto se
previene utilizando formol amortiguado con tampones.
6. Con el frío tiende a precipitar dando paraformaldehído, pero es reversible al
calentarlo y también con unas gotas de NaOH.

b. POR DESHIDRATACIÓN TISULAR

Desnaturaliza las proteínas al deshidratarlas, alterando su estructura, pero altera poco la
composición antigénica, química y los hidratos de carbono. Endurecen mucho. Los más
comunes son etanol y acetona. El etanol se usa al 50% en spray, para fijar en citología y la
acetona para preservar la estructura antigénica en inmunohistoquímica.

c. POR CAMBIOS EN EL ESTADO COLOIDAL DE LAS PROTEÍNAS

Al modificar el pH, se modifica el estado coloidal y precipitan las proteínas inhibiendo la
autolisis. Son ácidos como el ácido acético glacial, tricloroacético y el crómico.

d. POR FORMACIÓN DE SALES

Un catión como el cromo o el mercurio en estado ácido, se une a las proteínas formando
sales (proteinatos de Cr o Hg, o picratos de proteínas). Presentan baja penetración y alta
fijación y gran endurecimiento, por lo que se usan en mezclas de fijadores.

Son:
- Sublimado o cloruro de mercurio: se usa de elección para estudios hematopoyéticos y
renales, cuyo diagnóstico está basado en finos detalles nucleares y citoplasmáticos.
- Dicromato potásico
- Ácido pícrico
- Acetato de uranilo

2. MEZCLAS FIJADORAS
La combinación de diversos fijadores simples en soluciones complejas llamadas mezclas
fijadoras pretende sumar las ventajas de cada uno de ellos amortiguando sus inconvenientes.
Se clasifican en dos grandes grupos dependiendo de que contengan o no formaldehído en su
composición:

●MEZCLAS FIJADORAS QUE CONTIENEN FORMOL

⮚ Líquido de Bouin: se usa como alternativa a la formalina, cuando está indicado el sublimado y
no se desea emplear mezclas con sublimado, por su endurecimiento. Está compuesto por:
formol, ácido pícrico y ácido acético. Útil para médula ósea, piel, bazo, tejido endocrino y
embrionario o testículo. Contraindicado en las biopsias renales porque provoca severa
distorsión.
⮚ B-5: usado para médula ósea y riñón, contiene cloruro de mercurio y se añade en el
momento de uso formol.

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●MEZCLAS FIJADORAS QUE NO CONTIENEN FORMOL

⮚ Líquido de Carnoy: el mejor fijador conocido para el glucógeno, y en general para los hidratos
de carbono simples y para las proteínas fibrilares, sobre todo para las miofibrillas, en hígado y
músculo. Su acción fijadora es extremadamente rápida.
Contiene etanol, cloroformo y ácido acético glacial.

V. FIJACIÓN EN MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

• En microscopía electrónica (ME) es imprescindible la conservación de las células en el estado
más próximo al vivo y por otra parte, la obtención de cortes extremadamente finos, de
menos de 1 mm y máximo de 2 mm con hoja de bisturí nueva, sobre una superficie dura y sin
presionar el tejido . La primera condición obliga a realizar la fijación de forma inmediata, es
decir, dentro de los primeros instantes que siguen a la extracción del tejido vivo.

Se puede realizar una fijación simple o doble:

• En fijación simple se utiliza:

GLUTARALDEHIDO como fijador de elección, en tampón fosfato para citoquímica, y tampón

cacodilato en citología. Las muestras para ME deben ser fijadas inmediatamente en
glutaraldehido al 3% y buffer cacodilato 0,2 M a PH 7,3 que se preparan en frascos separados
y se mezclan en el momento de poner la muestra de biopsia. Las muestras en el fijador deben
permanecer en refrigeración a 4 ºC. El Glutaraldehído es un excelente fijador citoplasmático.
Indicado para pequeñas piezas, que deben cortarse dentro del propio fijador.

TETRÓXIDO DE OSMIO. Como segundo fijador, el tiempo de fijación es 1 hora. El Tetróxido de

Osmio es el mejor fijador de estructuras citoplasmáticas, aunque produce vapores tóxicos y
tiene un alto precio.

• En la doble fijación:

Primero se fija en glutaraldehido durante 4-16 horas, lavarlo en solución tampón con 3
cambios de 5 minutos, y se vuelve a fijar en tetróxido de osmio durante una hora a
temperatura ambiente; después de 2 lavados en agua destilada, ya se puede incluir en resina.

VI. TÉCNICAS ESPECIALES

PROCEDIMIENTO PARA FIJACIÓN DE BIOPSIAS DE GANGLIOS LINFÁTICOS

Las muestras se recibirán en gasa húmeda (suero fisiológico), sin fijador. Cortar el ganglio por la
mitad y realizar improntas o frotis en cubreobjetos, mínimo dos placas y enviar para la
coloración May Grunwald-Giemsa; luego cortar en finas rebanadas de 2 mm de espesor, varios
cortes. Los cortes se colocan inmediatamente en formol buferado.

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PROCEDIMIENTO PARA FIJACIÓN DE BIOPSIAS DE MÉDULA ÓSEA

Las muestras serán colocadas en formol buferado. Después colocar la biopsia en descalcificador
especial, EDTA dos horas, porque no altera los antígenos celulares de las muestras de médula
ósea, que generalmente requieren Inmunohistoquímica.

VII. TRATAMIENTO Y ELIMINACIÓN DE VERTIDOS

Los vertidos y salpicaduras en pequeña cantidad de formol, pueden absorberse mediante

papel, proceder a su evaporación en vitrina y posterior quemado del papel.
Si se producen en gran cantidad, se cubrirá la zona afectada con bisulfito sódico, adicionando
una pequeña cantidad de agua y mezclando y tras dejar pasar una hora, verter por el desagüe
con exceso de agua. La zona contaminada puede tratarse con agua jabonosa.
Para la eliminación de residuos acumulados en un contenedor, puede contarse con dos
procedimientos:
• Absorción sobre vermiculita e incineración en incinerador abierto.
• Disolución en un disolvente inflamable, acetona por ejemplo, y pulverización en el quemador
de un incinerador equipado con postquemador.

VIII. CONCEPTO DE DESCALCIFICACIÓN

► Eliminación completa de las sales de calcio presentes en los tejidos que la contienen
tras haber realizado su fijación.

► Este procedimiento técnico se realiza de forma sistemática sobre tejidos mineralizados:

dientes y hueso.

► Esporádicamente sobre material anatomopatológico con calcificaciones, que dificultan o

impiden la observación microscópica de las lesiones.

► Sólo está desaconsejado descalcificar el tejido en las enfermedades óseas metabólicas,

puesto que es imprescindible valorar el equilibrio entre síntesis y destrucción de matriz
ósea y su grado de calcificación.

En este último caso, se realizan cortes de tejido sin descalcificar empleando un microtomo
específico para seccionar tejidos duros incluidos en plástico.

IX. DESCALCIFICACIÓN QUÍMICA

► Se hace con productos químicos.

► Todas estas sustancias tienen la ventaja de ser estables, baratas y de fácil disponibilidad.

► El descalcificador ideal debe reunir las siguientes cualidades:

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- Producir una eliminación completa de los depósitos de calcio.

- No provocar efectos indeseables o artefactos sobre los tejidos tratados

- No interferir con los procesos de tinción que se emplearán posteriormente.

A. AGENTES DESCALCIFICANTES

1. ÁCIDOS FUERTES:

- Ácido Nítrico más rápido y eficaz.

- Ácido Clorhídrico menos rápido y eficaz, pero produce menos agresión tisular y no precisa
lavado postdescalcificación.

2. ÁCIDOS DÉBILES: Ácido Sulfuroso

3. ÁCIDOS ORGÁNICOS: Ácido Fórmico, Ácido Acético Y Ácido Tricloroacético

Producen escasos artefactos tisulares y apenas interfieren en los resultados finales de tinción.
Actúan lentamente y requieren la renovación frecuente del líquido descalcificante. Indicados
exclusivamente cuando la muestra es tejido óseo esponjoso

4. SOLUCIONES FIJADORAS CON PODER DESCALCIFICANTE

Líquido de Bouin , Líquido de Bouin-Hollander , Líquido de Zenker y Líquido de Pernyi

Fijan y descalcifican de forma simultánea. Todos poseen débil capacidad descalcificadora, por lo
cual se emplean casi exclusivamente como descalcificantes de los cilindros biópsicos de médula
ósea o para eliminar pequeñas calcificaciones distróficas.

5. SOLUCIONES DESCALCIFICANTES MÁS USADAS

► SOLUCIÓN ACUOSA DE ÁCIDO NÍTRICO (5%)

- Ventajas: Provoca una rápida descalcificación y causa menos retracción tisular y mejor
coloración que el formol-nítrico. No es necesario neutralizar.

- Inconvenientes: a concentración alta produce gran destrucción tisular y el exceso de

descalcificación anula la fijación.

► SOLUCIÓN DE FORMALINA-ÁCIDO NÍTRICO

- Ventajas: Es de acción relativamente rápida, provoca menos alteraciones tisulares que la

solución de ácido nítrico y es fácil de manejar, es la más utilizada.

- Inconvenientes:

Dificulta la tinción nuclear (colorante nuclear: hematoxilina)

Es necesaria la neutralización del tejido con sulfato sódico y posterior lavado con agua.

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B. NORMAS GENERALES EN EL PROCESO DE DESCALCIFICACIÓN

1) El hueso y los tejidos blandos deben ser disecados y cortados a un tamaño

susceptible para una fijación primaria (en formol buferado), para luego ser nuevamente
cortados a un espesor entre 0,3 y 0,5 cm y 3 cm de largo, antes de la descalcificación.

2) Para una adecuada fijación los especímenes óseos no requieren más de 24 horas.
Es muy recomendable cortar, con sierra eléctrica, delgadas secciones previas a la fijación.
Antes de la descalcificación el tejido debe estar completamente fijado, al menos 2 horas
para disminuir en lo posible los efectos adversos del descalcificador. La descalcificación
puede alterar la naturaleza de los antígenos tisulares.

3) El tiempo de fijación depende sobre todo del tamaño y naturaleza del hueso:
- el hueso calloso con estructura trabecular abierta se fija en un tiempo menor.
- El hueso cortical (compacto) es mucho más denso y no permite una penetración fácil del
líquido descalcificador, por ello el tiempo es más prolongado, al igual que el hueso
endurecido debido a cambios patológicos.

4) Las sales de calcio son solubles a pH 4,5. El pH de la mayoría de las soluciones

ácidas descalcificantes están entre 0,5 y 3 (diluciones). Un espécimen óseo de no más de 3,5
cm de grosor descalcificará en una solución ácida de un pH de 1, a un rango de 0,l cm /
hora. Sin embargo, especímenes entre 0,3 y 0,7 cm de espesor el tiempo se extiende a 2
horas.

5) Debe usarse un volumen óptimo de líquido descalcificador, mínimo de 1:20. Un

espécimen que mida 0,5 x 1 x 0,4 cm debe ser colocado en l00 ml de solución, si la misma
muestra es colocada en la mitad (50 ml) del descalcificante la solución será inefectiva.

6) La concentración del agente descalcificante debe ser óptima, de manera que pueda
alcanzarse un equilibrio entre la mayor rapidez de las soluciones concentradas y el menor
efecto alterativo tisular que producen las soluciones diluidas.

7) El líquido descalcificador será renovado con frecuencia para acelerar el proceso y las
muestras deben ser suspendidas en el centro del recipiente con papel secante o en bolsas
perforadas, amarradas con una cinta parafinada, ya que el fondo acumula la mayor
concentración de sales cálcicas solubles.

8) La temperatura ideal para realizar la descalcificación se encuentra en torno a los 25º C.

Por encima el proceso de descalcificación se acelera, pero también la descomposición del
tejido.

9) La agitación suave, manual o mecánica, del agente descalcificante generalmente acelera el

proceso: unas dos a tres veces al día.

10) La adición de alguna resina de intercambio iónico (sales de amonio o resinas sulfonadas)
al medio de descalcificación acelera igualmente el proceso, al producir un atrapamiento
progresivo de los iones cálcicos liberados por el descalcificador químico.

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11) Después de cualquier descalcificación química en el que se haya empleado ácido, el

exceso de este ha de ser eliminado mediante lavados en soluciones neutralizantes, la mejor
el agua corriente. Para disminuir el edema de las fibras colágenas, el primer lavado se realiza
en solución de sulfato sódico al 5%.

12) La coloración de tejidos descalcificados puede ser interferida por un exceso residual de
los ácidos empleados en la descalcificación. Por ello, un pre-tratamiento de los cortes con
solución acuosa de carbonato de litio al 1% asegura la neutralización completa.

13) La aceleración de la descalcificación química mediante ultrasonidos ha caído en

descrédito, debido principalmente a los graves efectos destructivos que las ondas
ultrasónicas provocan en las estructuras celulares.

X. PROCEDIMIENTOS DE DESCALCIFICACIÓN

A) DESCALCIFICACIÓN MEDIANTE QUELANTES QUÍMICOS

► Los quelantes químicos son sustancias capaces de combinarse con iones metálicos en
solución o en forma de sales, para constituir nuevos compuestos, generalmente solubles
en agua.

► El quelante más utilizado es el ácido EDTA. El EDTA se hace combinar con sodio y al
introducir el tejido con calcio, éste se recombina con el EDTA y queda el tejido sin calcio.

► EDTA-Na + Tejido-Ca EDTA-Ca + Tejido

► Inconvenientes: Se trata de un proceso lento

► Ventaja: No produce artefactos tisulares si ha sido fijado previamente.

B) DESCALCIFICACIÓN ELECTROLÍTICA

Se basa en el empleo de una corriente eléctrica continua para provocar la ionización de la

solución descalcificante en la que se encuentra sumergido el tejido.

Las sales insolubles de calcio presentes en el tejido son desplazadas por influjo del campo
eléctrico creado, emigrando los cationes cálcicos hacia el polo electronegativo. Los radicales
ácidos migran, aunque más lentamente, hacia el polo electropositivo, de forma que mientras
persistan sobre el tejido aceleran el ritmo de descalcificación.

► Este proceso suele realizarse a temperaturas entre 30 y 45° C.

► Se completa entre 45 y 60 minutos.

Pese a las ventajas del procedimiento, no se aplica de forma rutinaria en la mayor parte de los
laboratorios de anatomía patológica.

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C) DESCALCIFICACIÓN DE BLOQUES TISULARES INCLUIDOS EN PARAFINA

Durante el proceso de corte de los bloques incluidos en parafina, aparecen a menudo

calcificaciones no detectadas durante el muestreo de material, o bien restos de tejido
insuficientemente descalcificado. En estos casos se producen graves desperfectos en la cuchilla,
que pueden llegar a impedir que se realicen las secciones necesarias.

El problema puede subsanarse sumergiendo la superficie del bloque en líquido de Pernyi o en

ácido fórmico al 50%, 1 ó 2 horas antes de realizar el corte.

También puede emplearse el método de Lendrum , que consiste en exponer la superficie de

corte a la acción de una solución de ácido clorhídrico al 2% durante varias horas.

XI. PRUEBAS DE CONTROL SOBRE EL GRADO DE DESCALCIFICACIÓN TISULAR

El control exacto del tiempo óptimo de descalcificación tisular es absolutamente imprescindible.

Si el tiempo es excesivo, se origina maceración del tejido y destrucción celular y si es insuficiente,
impide obtener secciones microtómicas adecuadas. Por ello se precisan pruebas de control que
permitan establecer el momento en que el proceso se ha completado.

Para tal fin existen 3 tipos distintos de métodos: físicos, químicos y radiológicos.

Físicos: Mecánico.- Mediante el uso de un tacto fuerte y con la ayuda de un alfiler o aguja fina se
buscan las áreas calcificadas. Hay que tener mucho cuidado en no destruir el espécimen, no
desastillar la cortical y desplazar las estructuras histológicas que pueden dar una falsa imagen
microscópica. Por su gran subjetividad e inducir daño en el tejido durante estas manipulaciones,
no es aconsejable.

Radiológicos: Se utilizan rayos X. Aunque bastante sensibles, no se usan por su elevado coste y
porque requieren el empleo de instrumental complejo.

Químicos: Comúnmente de elección. Basado en la detección de iones cálcicos en el líquido

descalcificante. Cuando en los sucesivos recambios del líquido deja de encontrarse cálcicos, se
considera que el proceso ha finalizado. La prueba más utilizada es la del oxalato cálcico.

MÉTODO DEL OXALATO CÁLCICO. Consta de dos pasos:

1º PASO:

Se toma 5 ml de la solución descalcificante donde se encuentra la muestra y, agitando, se

añade amoníaco gota a gota hasta que la solución se torne neutra (pH neutro).
- Si aparece precipitado de Ca (OH)2: indica la existencia de mucho calcio en el tejido.
- Si no aparece precipitado: se continúa con el segundo paso.

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2º PASO:

Añadir 5 ml de solución saturada de oxalato amónico, agitar bien y dejar reposar 30 minutos.
- Si la solución no está clara, sino turbia, aparece formación de oxalato cálcico: la
descalcificación no ha concluido, por lo que hay que dejar actuar más tiempo
- El proceso de descalcificación ha concluido cuando la solución final permanece clara, puesto
que no se forma oxalato cálcico.

XII. CONSERVACIÓN DE LOS TEJIDOS

Cuando se practica un estudio histológico, sólo se incluye una pequeña porción del material
remitido para el análisis; el resto se guarda para estudios complementarios.

Casi nunca es posible conservar el tejido en el mismo líquido utilizado para la fijación, porque
provoca endurecimiento excesivo o por alteración creciente de la estructura antigénica.

► En todos estos casos, la solución conservante más indicada es el alcohol etílico al 70 %,

que además de iniciar la deshidratación, puede conservar durante meses sin producir
apenas cambios.

► Como alternativa, y siempre que no se desee preservar el tejido para ulteriores estudios
inmunohistoquímicos, puede emplearse como conservante formol al 10 %.

► Para demorar la inclusión del tejido en parafina, sobre todo para pequeñas muestras
muy delicadas, podemos realizar la deshidratación completa de las muestras en
alcoholes crecientes y conservarlas finalmente en butanol, que completa la
deshidratación, permite una conservación indefinida y con el tiempo incluso mejora la
textura tisular favoreciendo el corte.

► Cuando el material a conservar son órganos completos procedentes de necropsia y cuya

coloración es importante mantener, la alternativa es la solución de Jores.

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