TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

CURSO: HISTOLOGÍA
DRA. CARMEN MEDINA GARCIA
DRA. CARMEN ANALIZ MEDINA GARCIA
Médico – Cirujano.
Especialista en Anatomía patológica
Docente de esta facultad.
 HISTOLOGIA
OBJETIVO DEL CURSO

GUIAR AL ALUMNO SOBRE EL CONOCIMIENTODE LA MICROANATOMÍA DE LOS

TEJIDOS Y CORRELACIONAR LA ESTRUCTURA CON LA FUNCIÓN DEL TEJIDO EN
ESTUDIO
 HISTOLOGIA
▪ EVALUACIÓN TEORICA: Pre test (De los temas de cada
semana)

▪ EVALUACIÓN PRÁCTICA: Evaluación de los dibujos y su descripción en

todas las sesiones de aprendizaje.

▪ EVALUACION PARCIAL Y FINAL : De contenido teórico y práctico de

manera presencial .
DEFINICIONES
 HISTOLOGIA
CIENCIA QUE ESTUDIA DE LOS TEJIDOS Y SU FUNCIÓN

Método de estudio
histológico

EL MICROSCÓPIO
Estructura Microscópica

Objeto de estudio: imágenes de los preparados de tejidos fijados y coloreados.

 TECNICAS HISTOLÓGICAS
Conjunto de procedimientos que tienen por objeto procesar los
tejidos humanos de modo tal que se conserven sus
características fundamentales y permitir por lo tanto su estudio
microscópico a través de preparados histológicos
 PREPARADO
HISTOLÓGICO

Rebanada de tejido
colocada sobre una
lámina portaobjetos,
coloreada y cubierta por
una lámina cubre-objetos.
Pasos de la Técnica:
Para su realización se efectúan una serie de pasos secuenciales ordenados
1. Obtención de la muestra
2. Fijación de la muestra
3. Deshidratación
4. Aclaramiento
5. Inclusión
6. Corte
7. Coloración
8. Montaje
1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

BIOPSIA: NECROPSIA: PIEZAS

QUIRÚRGICAS:
(del griego “bios”= vida y Consiste en la toma de un
“opsis”= visión), consiste en la fragmento de tejido de un ser
toma de un fragmento de muerto, lo cual es recomendable
tejido de un ser vivo, a través que se obtenga inmediatamente Tejidos que han sido extraídos de
de una intervención quirúrgica después de la muerte. las intervenciones quirúrgicas,
generalmente tumores u
para diagnosticar una
órganos inflamados.
determinada lesión.
Tipos:
• Incisional Tipos:
• Excisional
• Por sacabocados ▪ Medicolegales
• Por punción y aspiración ▪ Hospitalarias
• Por raspado
BIOPSIA

Procedimiento realizado con el propósito de obtener tejido o

células del cuerpo para examinarlos con el microscopio.
 • La biopsia endoscópica

• La biopsia de la médula ósea

• La biopsia excisional o inscisional

• La biopsia de aspiración por medio de una

Tipos de biopsias:
aguja fina

• Una biopsia de perforación

• La biopsia de raspado

• La biopsia de la piel
BIOPSIA EXCISIONAL: BIOPSIA INCISIONAL:
Resección de toda la lesión para su estudio. Resección de una parte de la lesión.
Cuando la lesión es bien delimitada y mide Cuando la lesión es de gran tamaño.
menos de 1 cm de diámetro.
BIOPSIA POR SACABOCADO (PUNCH):

Cuando la lesión es de pequeño tamaño.

El sacabocado es un instrumento que
consta de un mango cilíndrico que tiene en
uno de sus extremos una cuchilla circular
con un diámetro fijo.
PUNCIÓN ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA:
Con aguja fina y una jeringa que se le acopla para aspirar
algunas células que serán teñidas y analizadas. Este estudio se
llama citología.

BIOPSIA ASPIRACIÓN CON AGUJA GRUESA: se realiza con una

aguja gruesa que permite obtener una o varias muestras de
tejido. La técnica consiste en introducir una aguja desechable
en la lesión y a continuación accionar el dispositivo de disparo
para obtener una muestra.
Fuente:

http://healthlibrary.brighamandwomens.org/enespanol/relateditems
BIOPSIAS TRANSOPERATORIAS

Se realiza rápidamente durante el ACTO QUIRÚRGICO

para decidir un CONDUCTA MEDICOQUIRÚRGICA.

El tejido en fresco sin fijación se

congela a BAJAS temperaturas con
la utilización de un aparato llamado
CONSTA DE UN MICRÓTOMO TIPO MINOT
CRIOSTATO. INCLUIDO EN UNA CÁMARA DE
CONGELACIÓN.
 •La médula ósea.
•Los senos.
•El tracto gastrointestinal.
•El riñón.
Los sitios comunes •El hígado.
para las biopsias son: •El pulmón.
•Los nódulos linfáticos.
•La piel.
•La tiroides.
•El cerebro.
2. FIJACION

-Tiene por objeto la CONSERVACIÓN CELULAR, EVITANDO SU DESTRUCCIÓN.

- Método histológico destinado a obtener preparados duraderos que

conservan la estructura morfológica y química de las células
 OBJETIVO DE FIJACIÓN
▪ Evita los procesos de autólisis (degradación por enzimas propias) y putrefacción (degradación
bacteriana).

▪ Conservar las estructuras de la manera más fidedigna posible al estado vivo.

▪ Endurecer el material

▪ Eliminar bacterias u otros agentes.

▪ Protege de los efectos traumáticos y evita la retracción de los tejidos.

CUALIDADES QUE DEBE TENER UN FIJADOR:

• Actuar con rapidez

• Buen poder de penetración, que en contados instantes se
introduzca con rapidez en el espesor de la muestra.
• Buen poder de difusión, que alcance las porciones más profundas
de la muestra.
• Producir cierta dureza a los tejidos, sin que provoque excesiva
retracción o hacerlos quebradizos y friables.
• De fácil manipulación.
• No debe disolver componentes celulares.
• Que sea de fácil conseguir y que sea barato.
• pH neutro en el rango de 6 a 8, por eso el formaldehído se
tampoco con un buffer llegando a un pH 7.
 4. El fijador empleado
1. CANTIDAD DE FIJADOR: 2. TIPO DE FRASCO: rutinariamente es el formol
Debe de ser aprox 10 a 20 veces el Preferible de plástico, de boca ancha. tamponado (bufferado) al 10%.
volumen de la muestra:

3. ROTULADO CORRECTAMENTE: 5. El tiempo de fijación: varía

• Código depende del fijador y el tamaño de
• Nombre del Paciente la muestra. Con el fijador de uso
• Rótulo de la Muestra común, las biopsias pequeñas
• Fecha pueden tomar 6 horas y las
grandes hasta 36 horas.
Fijación por Inmersión: El tejido se sumerge en las soluciones fijadoras.
TIPOS DE FIJADORES
TIPOS DE FIJADORES
 SIMPLES COMPUESTOS

▪ Formol al 10%, • Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-

▪ Alcohol etílico absoluto o de 96%, se
usa generalmente en microquímica. acética.
▪ Alcohol metílico, se lo emplea con
• Líquido de Zenker, mezcla bicromato-
frecuencia para fijar frotis desecados
(sangre, médula ósea, ganglio, bazo, sublimado-acética.
líquidos de punción, etc.)
• Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
▪ Ácido ósmico al 1 ó 2%, es poco
• Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética
penetrante pero enérgico, conserva
muy bien estructuras celulares.
▪ Bicromato de potasio al 3-5%.
ENVIO DE LA MUESTRA

SERVICIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA

EXAMINEN Y LO ANALICEN:
SERVICIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA

Anatomía Macroscópica: Anatomía Microscópica:

Estudio de las estructuras Es aquella que requiere de

observables a simple vista auxiliares ópticos.
Anatomía Macroscópica:

Descripción y estudio de las estructuras

observables a simple vista
OBTENCION DE LOS CORTES HISTOLOGICOS DE ACUERDO A SU PATOLOGIA
 3. DESHIDRATACION:

▪ Las piezas al ser retiradas del fijador, o después de haberlas lavado, están
embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina.

▪ Se debe deshidratar los tejidos sumergiéndolos en líquidos anhidros, ávidos de agua.

▪ Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratación brusca, se aconseja

proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etílico de graduación
creciente.
3. DESHIDRATACIÓN:
Como el tejido fijado se halla en solución acuosa y el medio de
inclusión no es soluble en agua, no podría ser infiltrado
directamente con el agente de inclusión.

Por ellos se deshidrata en una serie de alcoholes crecientes.

Llegando a eliminarse totalmente el agua del tejido.

Los agentes más usados: alcohol etílico, isopropílico, dioxano y el

cloroformo.
3. DESHIDRATACIÓN:

▪ Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol

(este último es el que nosotros utilizamos). Al agregar el xilol, no debe aparecer
ninguna turbidez.

▪ Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido bien lograda y

debemos repetir el baño de alcohol absoluto.
4. ACLARAMIENTO

Las muestras deshidratadas están con alcohol etilico

absoluto; pero la parafina tampoco es soluble en
alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por
sustancias que sean capaces de mezclarse con el
alcohol, y disolver la parafina.
Los agentes utilizados: xilol, benceno, cloroformo.
PENETRACION EN PARAFINA:

• Penetración de la parafina.

• Se sumergen las piezas en parafina

(56-58º de punto de fusión),
mantenida líquida en la estufa a no
más de 62ºC.

• Después de 1 a 2 horas se renueva la

parafina.
5. INCLUSIÓN EN PARAFINA :

FORMACIÓN DEL BLOQUE O

“INCLUSIÓN DEFINITIVA”

• En moldes de metal se vierte la parafina

fundida, del mismo punto de fusión de la
que ha servido para la penetración. Se
colocan las piezas orientándolas y luego se
pone el molde en heladera.

• A los 15-30 minutos la parafina se habrá

solidificado completamente.
5. INCLUSIÓN

El objetivo es que la parafina penetre el tejido,

luego se sumerge el bloque en parafina líquida
(50 o 55 grados).

Es la inclusión definitiva del trozo de tejido. Se

utiliza un molde metálico especial denominado
barras de Leuckart, donde se vierte la parafina
líquida (50 a 55 grados). Cuando la parafina se
enfría se solidifica, se retira el molde y nos queda
el taco de parafina con el bloque de tejido dentro
de él.

Así los tejidos se endurecen para formar un bloque

sólido que puede ser cortado.
6. CORTE:

▪ Se realiza con un MICRÓTOMO que es una

cortadora, sirve para obtener cortes de un
grosor que oscila entre los 2 y 15 micrones
de espesor.

▪ Reducción del tejido en cortes lo

suficientemente delgados como para
permitir el paso de la luz para examinarlo al
microscopio.

▪ Los cortes más corrientes son los de 4-6

micras.
 TIPOS DE MICROTOMO

• Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se

desliza por unas guías especiales merced a un soporte al que se sujeta la
cuchilla con unos tornillos.

• Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza
sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se hace girar una
manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

• Tipo Criostato
MICROTOMO DE ROTACIÓN TIPO MINOT

Son los de USO MÁS FRECUENTE en cualquier laboratorio.

Especiales cuando los tejidos están incluidos en parafina .

Se desplaza la navaja, de arriba hacia abajo y viceversa ( movimiento

vertical)

Permiten obtener secciones delgadas, del orden de 4 a 7 um de espesor

.

Producen cortes seriados : se emplean cuando se desea realizar

reconstrucciones tridimensionales del órgano procesado, cuando se
requieren comparar secciones vecinas, del tejido u órgano .
 EXTENSIÓN Y ADHESIÓN DE LOS CORTES AL PORTAOBJETOS

Los cortes obtenidos , aislados o en forma de cintas ,

generalmente se presentan arrugados , por lo que es
necesario extenderlos .

Se coloca el corte en un baño de agua caliente, para que se

ESTIRE (éste mantiene la temperatura entre 40o a 45o C) .

En caso que ciertas arrugas persistan, se emplean unas

pinzas finas o un pincel de pelo de camello, para ejercer una
ligera tracción entre los extremos de los cortes y así
desarrugarlos totalmente.
CLASIFICACIÓN
SEGÚN SU ORIGEN

(VEGETAL)

(ANIMAL)

(VEGETAL)

(VEGETAL)
SEGÚN LA NATURALEZA QUÍMICA

- BÁSICOS : Hematoxilina - Azul de metileno – el azul de toluidina y verde de metilo.

- ÁCIDOS : Eosina, azul de anilina, fucsina ácida y naranja G.

- NEUTROS : El eosinato de azul de metileno.

- INDIFERENTES : Sudán lll, rojo escarlata.

FUNDAMENTOS QUÍMICOS DE LA COLORACIÓN

• Clasificación colorantes según afinidad:

• Colorantes nucleares o básicos: su componente colorante activo es una base

coloreada que se combina con los ácidos nucleicos.

• Colorantes citoplasmáticos o ácidos: su componente activo es un ácido

coloreado que se combina con el citoplasma.

• Colorantes neutros, tanto el ácido como la base son coloreadas.

La reacción de los grupos aniónicos con un
colorante básico se denomina BASOFILIA
(que tiene afinidad por lo básico)

La reacción de los grupos catiónicos con un

colorante ácido se denomina EOSINOFILIA
(que tiene afinidad por lo ácido)
LAS COLORACIONES PUEDEN SER:

- Ortocromáticas: los tejidos adquieren

un color igual al de la solución colorante
empleada.

Azul de Toluidina tiñe gránulos mastocito púrpura

- Metacromáticas: una sustancia o un
componente celular se tiñe con un color
diferente al del colorante empleado.
Hay muchos tipos de tinciones para diferenciar en
los tejidos las diferentes estructuras o sustancias.

La tinción más usada o también llamada

"de rutina" hematoxilina y eosina (H&E).
Coloración con Coloración con Coloración
Hematoxilina Eosina Hematoxilina-Eosina
Basófilo
(azul)

Acidófilo
(rosado)
COLORANTES EMPLEADOS CON MAYOR FRECUENCIA EN HISTOLOGÍA
HEMATOXILINA
Actúa como un colorante
BÁSICO que se asocia y tiñe
componentes ÁCIDOS de la
célula como estructuras
aniónicas
(que posean fosfatos, sulfatos
y/o carboxilos ionizados)
- Heterocromatina y nucléolos
- ARN ribosomal,
- Matriz extracelular (por los
sulfatos de los GAGs).
Color: azul o violeta
EOSINA
Colorante ÁCIDO
(predomina densidad de
carga negativa), que se
asocia y colorea estructuras
catiónicas (componentes
BASICOS) del citoplasma y
matriz extracelular
- Filamentos citoplasmáticos.
- Componentes membranosos
intracelulares.
- Fibras extracelulares (por sus
aminoácidos básicos ionizados).
Color: rosado
8. MONTAJE

•Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la aclaración y

montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en
condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su
deterioro.

•La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.

•La aclaración se realiza con xilol

COLORACIÓN
MONTAJE
impregnar el corte con un disolvente del Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo
le confiere un índice de refracción semejante al del vidrio.

Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el

mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se cubre con un
cubreobjeto.
MONTAJE
El mejor medio de montaje debe tener :

Índice de refracción parecido al del vidrio (1.518)

Ser completamente miscible en xileno – tolueno.

Inerte químicamente.

No cambiar de Ph ni de color .

No debe deformar o encoger los tejidos .

No producir : gránulos , grietas , daño de los colorantes , modificar

el color en el tiempo .
 LA HISTOQUÍMICA
▪ Son tinciones que pretenden visualizar específicamente una sustancia determinada
presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in situ“

▪ Se fundamenta en hacer reaccionar reactivos con los componentes celulares o tisulares

que queremos demostrar

▪ Estas moléculas son difícilmente discernibles con técnicas generales

▪ La técnica histoquímica más empleada es la reacción de PAS (Periodic Acid Schiff).

▪ Se clasifican en tres tipos en función de lo que tiñen : sustancias , microorganismo

(Micobacterias, hongos, etc) y especiales elementos más genéricos (lípidos, carbohidratos,
proteínas, etc)
 COLORANTES Y REACCIONES HISTOLOGICAS COMUNES
REACTIVO
Hematoxilina
Eosina
Tricómica de Masson
Acido peryóico de Schiff
Colorante de Wright y Giemsa
(células sanguíneas)
RESULTADO
Azul: núcleo; regiones acidas del
citoplasma; matriz del cartílago.
Rosa: regiones básicas del citoplasma;
fibras de colágena.
Azul oscuro: núcleo
Rojo: musculo, queratina, citoplasma
Azul claro: mucinógeno, colágena.
Magenta: moléculas ricas en glucógeno y
carbohidratos.
Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinófilos
Azul: citoplasma de monocitos y linfocitos.
Tinciones histológicas:

REACTIVO NUCLEOS CITOPLASMA FIBRAS COLAGENAS FIBRA ELASTICAS

Hematoxilina y Azul violeta Rojo o Azul violeta Rojo Sin tinciön o rosa
Eosina (H-E) (ribosomas y RER)

Azan Rojo brillante Rosa palido o azul Azul Sin tinciön o rojo a
tenue azul rojizo (abundan,
ligamentos.
Para elastina Negro violeta (r-f) o
(resorcina-fucsina u rojo pardo (o)
orcreina)
Van gieson Azul negro Amarillo o parduzco Rojo Sin tinciön especial
claro

Tricomica de Pardo negro Rojo ladrillo Verde Sin tinciön.

Goldner
EH (hematoxilina Heterocromatina y Centriolos, Sin tinción especial o Gris tenue
ferrica) de nucleolo azul negro cinocilios, gris amarillento
Heindenhain.
Tinciones histoquímicas:

Reacción de PAS Tinción rojo violeta. El acido peryodico grupos

aldehídos en el glucógeno y el los
componentes sacáridos de las glicoproteínas.
El reactivo de Schiff los tiñe de rojo violeta
Azul alciano Tinción azul. Polianiones: moco sulfatado,
glucosaaminoglucanos, hialuranos.
Lípidos (Sudan III, Negro, aceite Naranja-rojo o pardo… Lípidos
rojo 0)
Tinción d Feulgen para ADN Tinción purpura
Azul de toluidina Tinción azul. Tiñe la cromatina (ADN), el
nucléolo y los ribosomas.
ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF (TINCION PAS )

Tiñe : “Depósitos de glucógeno, mucina, membranas basales, algunos hongos”

Intestino. La tinción de fucsia corresponde al reactivo de Schiff, el cual marca

mucopolisacáridos de las células caliciformes.
ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF (TINCION PAS )

Tiñe : “Depósitos de glucógeno, mucina, membranas basales, algunos hongos”

ÁCIDO PERYÓDICO DE SCHIFF (TINCION PAS )

Tiñe : “Depósitos de glucógeno, mucina, membranas basales, algunos hongos”

 Azul alcián

• Principal Uso:
Mucopolisacáridos ácidos

• Tiñe
• Mucopolisacáridos ácidos
(mucina)→ Azul.
 TRICRÓMICO DE MASSON
visualización de los músculos, las fibras de colágeno, los
tejidos conectivos

▪ Núcleos - azul-púrpura
▪ Fibras musculares, queratina, citoplasma - rojo
brillante
▪ Colágeno, moco – azul
▪ Eritrocitos - rojo-naranja
 TRICRÓMICO DE MASSON

Tricrómico de Masson con aumento 4X. Fuertemente positivo para fibras de colágeno.
Orceína ácida de Pinkus/Giemsa

• Principal Uso: Fibras elásticas.

• Tiñe:
• Fibras elásticas → rojo-púrpura-
marrón

Fibras de elástica del conjuntivo de la dermis papilar

y de la dermis reticular.
 INMUNOHISTOQUÍMICA

▪ Es una técnica de coloración que permite detectar in situ componentes celulares

o extracelulares (antígenos), por medio de anticuerpos especificos, empleando

para ellos sistemas de detección enzimáticos.

▪ La técnica se basa en el complejo antígeno-anticuerpo, estos últimos por lo general

se encuentran unidos a una enzima o un cromógeno (casi siempre fluorescente),

que se activan cuando ocurre la unión

A través de los preparados histológicos se puede:

➢ Describir,
➢ Identificar,
➢ Comparar
➢ Clasificar,
➢ Definir,
➢ Explicar e interpretar
MICROSCOPIO ÓPTICO