Bloque nº 2

U.D. 05
RECUENTO CELULAR

5.1. TÉCNICAS MANUALES 5.2.

TÉCNICAS AUTOMÁTICAS 5.3.
CITOMETRÍA DE FLUJO

5.1. TÉCNICAS MANUALES

1. INTRODUCCIÓN

Aunque actualmente en todos los laboratorios se realiza el hemograma de forma automática, conviene conocer los
métodos manuales puesto que se emplean como control de calidad para comprobar algunos valores extremos obtenidos
esporádicamente en medidas automáticas.
En el recuento expresaremos la cantidad de células sanguíneas en un volumen determinado, que en recuento manual
generalmente es un milímetro cúbico (mm3) debido a las dimensiones de la cámara de recuento o hemocitómetro.

2. FASES DEL RECUENTO CELULAR:

Cualquier método de recuento abarca cuatro fases:
1. Dilución de la sangre.
2. Toma de un volumen determinado de sangre diluida.
3. Recuento de las células en ese volumen.
4. Cálculos para expresar el resultado en células/mm3, células/µL o células/L.

3. CÁMARAS DE RECUENTO: la cámara de Neubauer.

Constan de una pieza rectangular de vidrio similar a un portaobjetos pero mucho más gruesa. En el centro de la cámara se
encuentran una o dos superficies rayadas, llamadas cuadrículas o retículos. Según el número de estas zonas rayadas las
cámaras pueden ser sencillas (una cuadrícula) o dobles (dos cuadrículas). Las cámaras a su vez pueden llevar o no pinzas para
sujetar un cubreobjetos.
Sobre la cámara se coloca un cubreobjetos plano estandarizado(cubrecámara), de tal forma que entre la superficie inferior
del cubreobjetos y la zona rayada de la cámara exista una profundidad exacta, normalmente de 0,1 mm; aunque hay otras
cámaras que dan una profundidad de 0,2 mm.

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 Los tipos de cámara de contaje más utilizados son:
- Cámara de Neubauer.
- Cámara de Thoma.
- Cámara de Bürker.
- Cámara de Fuchs-Rosenthal.
- Cámara de Malassez.

La más utilizada en Hematología es la de Neubauer y es la que vamos a estudiar.

CÁMARA DE NEUBAUER

Actualmente se utiliza más la cámara mejorada ("improved") que la antigua.

La diferencia entre ambas radica en el reticulado o cuadrícula, y dentro de éste en el cuadrado grande
central, que contiene:
- en la mejorada 25 cuadrados medianos.

- la antigua sólo tiene 16 cuadrados medianos.

 El retículo de las cámaras de Neubauer tiene una superficie de 9 mm 2 (3 mmde lado) y está dividido en 9
cuadrados grandes (c.g.) de 1 mm2 de superficie.

 Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas se usan para contar GB y plaquetas y están subdivididos en
16 cuadrados medianos (c.m.) de 0.25 mm de lado cada uno.

 El cuadrado grande central se usa para contar GR. Contiene cuadrados medianos, a su vez divididos en
cuadraditos pequeños (c.p.)

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  CÁMARA NEUBAUER MODIFICIADA (improved):

o El cuadrado grande central (1 mm de lado) dividido en 25 (5x5) cuadrados medianos de 0.2 mm de

lado.
o Cada c.m. está dividido en 16 (4x4) cuadrados pequeños de 0.05 mm de lado.
o La línea de separación de estos cuadrados puede ser doble o triple, según el fabricante.

 Por tanto, la cámara de Neubauer modificada tiene 400 cuadraditos pequeños.

 LIMPIEZA DE LAS CÁMARAS DE NEUBAUER:

Las cámaras de recuento deben introducirse en agua con lejía y posteriormente agua destilada.
Secarla con paño suave (nunca papel, pues se rayarían). La zona donde se encuentra el retículo se puede
secar con papel de seda (papel de fumar).
Los cubrecámaras no se tocarán con los dedos.

4. PIPETAS DE THOMA.
Actualmente las diluciones se realizan con pipetas automáticas, pero tradicionalmente se han
utilizado las pipetas de Thoma.

Hay dos tipos de pipeta de Thoma: una para el recuento de hematíes y otra para el recuento de leucocitos.

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 Son de vidrio y tienen un capilar graduado cuyas divisiones están separadas por un volumen de 0,1 del
volumen total del capilar, que se continúa con un bulbo o ampolla.

Dentro del bulbo tienen una perla de vidrio (roja o blanca) para facilitar la mezcla de sangre y líquido
diluyente.

En la parte superior de la ampolla hay otro tubo capilar que tiene grabada la señal 11 en la de leucocitos, y
101 en la de hematíes. Esto quiere decir que en la pipeta de Thoma para leucocitos el volumen del capilar cabe 10
veces en la ampolla, y en la de hematíes 100 veces.

- En la pipeta de blancos podemos hacer diluciones que pueden ir desde 1/10 hasta 1/100.
- En la de rojos las diluciones pueden ir desde 1/100 hasta 1/1000.

Con sangres sin alteraciones cuantitativas, lo normal es tomar sangre hasta la marca 0.5 en ambas, con lo
que conseguimos una dilución 1/200 en la pipeta de rojos y 1/20 en la pipeta de blancos.

Para que las diluciones sean exactas, hay que hacer enrases perfectos al pipetear.

El pequeño capilar superior se conecta al sistema de aspiración, que puede ser un tubo de goma con una
boquilla que se sujeta a la boca durante la aspiración o a una jeringa.

 LIMPIEZA DE LAS PIPETAS:

Se lavarán aspirando sucesivamente por:
Agua + lejía
Agua destilada
Alcohol-acetona (1:1)
Aire (a través de una jeringa) con objeto de secar. La ampolla estará seca si la bolita se mueve
libremente.

5. LÍQUIDO DE DILUCIÓN.
El DILUYENTE es distinto según la célula a contar:
– Recuento GR  líquido de HAYEM en cuya composición tiene:
• ClNa para que sea isotónico con los GR
• Mercurio destruye los GB

– Recuento de GB  líquido de TÜRCK

• Ac. Acético destruye los GR
• Violeta de genciana tiñe ligeramente los núcleos de los GB.

– Recuento de Plaquetas  Solución de oxalato amónico: impide la agregación plaquetar.

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 6. MÉTODO DE RECUENTO MANUAL.

Pasos:

1. DILUCIÓN de la muestra.
2. LLENADO de la cámara.
3. RECUENTO fiable.
4. CÁLCULOS y expresión de RESULTADOS

1. DILUCIÓN DE LA MUESTRA:
 El diluyente será el adecuado para el tipo de células a contar.
 La sangre se diluirá suficientemente para que las células estén separadas unas de otras y así poder
contarlas con facilidad.
 Para ello, la dilución será mayor cuanto mayor sea la concentración de células en sangre.
 La dilución debe ser exacta y la mezcla de sangre y diluyente debe ser homogénea.

2. LLENADO DE LA CÁMARA:
 Una vez se ha colocado encima el cubrecámara, se llena por capilaridad, acercando la punta de la pipeta
al borde del cubre. La pipeta deberá estar en posición VERTICAL para evitar que se inunde la cámara.

3. RECUENTO FIABLE:
• Comprobar la distribución homogénea de las células por toda la cámara.
- Se comprueba con el objetivo de 4x (se ve todo el retículo)
- Si la distribución no es uniforme hay que volver a empezar.

• Contar las células siempre en el mismo orden para evitar contar dos veces la misma célula. Para ello se
sigue un orden en “zig-zag”.

• Evitar el error de las células que tocan las líneas divisorias.

– Para ello contaremos en un cuadrado las células que, estando dentro, NO TOQUEN
NINGUNA LÍNEA y además aquellas que, estando fuera o dentro de dicho cuadrado,
toquen las líneas IZQUIERDA Y SUPERIOR de dicho cuadrado.

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 4. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS:

7. CAUSAS DE ERROR EN RECUENTOS MANUALES.

• En la siguiente dirección puedes ver cómo se hace el recuento de hematíes:

http://www.ugr.es/~jhuertas/EvaluacionFisiologica/Recuento_rojos/redcell2.htm
También puedes hacer un recuento virtual.

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 5.2 TÉCNICAS AUTOMÁTICAS
Los contadores o analizadores hematológicos permiten analizar un volumen grande de muestras en tiempos
reducidos con mayor exactitud, precisión, seguridad y sencillez que los métodos manuales. Además necesitan
menor volumen de muestra (inferior a 200µL)

Actualmente el hemograma se lleva a cabo de forma rutinaria en estos autoanalizadores. De ellos se

encuentran múltiples en el mercado, desde algunos sencillos que proporcionan los parámetros básicos del
hemograma y fórmula leucocitaria de tres poblaciones (PMN, Linfo y Mono) hasta otros mucho más complejos
que aportan mayor información.

1. COMPONENTES DE UN CONTADOR HEMATOLÓGICO.

2. PRINCIPIOS EN LOS QUE SE BASAN LOS CONTADORES HEMATOLÓGICOS

Los contadores automáticos pueden detectar el paso de la célula según dos métodos:

A) Método de la resistencia eléctricaSe basan en la interferencia de las células al paso de la corriente

eléctrica.
B) Métodos ópticosBasados en la interferencia de las células con la luz.

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 A) MÉTODO DE LA RESISTENCIA ELÉCTRICA o impedancia:
• Conocido como método COULTER.

• Se basa en que las células son menos conductoras de la electricidad que el líquido diluyente.

• Método:
– La sangre se diluye con un diluyente conductor isotónico (conduce la electricidad con facilidad y
no rompe las células).
– La sangre diluida pasa a través de la cámara de flujo.
– La cámara presenta un orificio por donde las células pasan alineadas y aisladas.
– A ambos lados del orificio se encuentran dos electrodos de platino (entre los que se establece
una diferencia de potencial constante).

– Si el orificio es atravesado sólo por el líquido diluyente, la resistencia eléctrica medida por los
electrodos es mínima.

– Cuando por el orificio pasa una célula se produce un aumento de la resistencia eléctrica y un
cambio de potencial entre los electrodos, recogido por el transductor.

 Fundamento:

- El nº de señales eléctricas generadas indica el nº de células presentes: 1 señal = 1 célula

- La amplitud del impulso (cambio de resistencia) es proporcional al tamaño y complejidad de la célula.

Célula pequeña (plaquetas) pequeño cambio de resistencia.
Leucocitos  mayor cambio de resistencia.
Hematíes  Impulso intermedio.

- Los impulsos registrados se clasifican por tamaños.

- Los distintos tamaños dan información sobre los distintos tipos de células.

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 B) MÉTODOS ÓPTICOS o de dispersión lumínica.

Basados en la interferencia de las células con la luz.

Las células atraviesan una cámara de lectura sobre la que incide un haz de luz y analizan la dispersión de esa luz.
La dispersión de la luz es recogida por sensores específicos. El grado de dispersión dependerá de:

– Tamaño.
– Forma.
– Índice de refracción celular.

Pueden ser de 2 tipos:

- Método del campo oscuro.
- Método del rayo láser.

 Método del campo oscuro.

– Las células pasan por una cámara de flujo y atraviesan una zona sobre la que incide un haz de luz halógena.
– Cuando no pasan células, el haz de luz no se desvía e incide sobre un disco oscuro (delante del fotodetector) que
absorbe toda la luz (no llega al fotodetector).
– Si el rayo choca con una célula, la luz se dispersa, el disco no la absorbe en su totalidad.

En este caso:

– La luz que llega al fotodetector dependerá de la dispersión provocada por la célula (según tamaño, forma e índice de
refracción).
– El recuento tendrá en cuenta:
– El nº de veces que incide la luz en el fotodetector.
– La intensidad de la dispersión lumínica producida.

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  Método del rayo láser.

– Las células pasan aisladamente por una cámara de flujo de pequeño diámetro.
– Esta cámara, en un punto concreto, es atravesada por un rayo láser que incide sobre un sensor.
– Cuando una célula se interpone en el paso del rayo láser, éste se desvía y no incide sobre el sensor.
– De esta forma se cuentan el nº de células que pasan por la cámara de flujo.
– El procedimiento se completa con otros sensores, llamados de dispersión, que son estimulados por los
rayos desviados.

3. TIPOS DE CONTADORES.
Los estudiaremos más detenidamente cuando veamos la serie blanca. Pero vamos a ver algunas
características generales.

En esquema se dividen en:

 Contadores de una población: cuentan GR, GB y Plaquetas
 Contadores de tres poblaciones: distinguen e poblaciones de GB:
 - medianas (monocitos, eosinófilos, basófilos)
 - pequeñas (linfocitos)
 - grandes (neutrófilos)
 Contadores de cinco poblaciones: distinguen los 5 tipos de GB.

TEN EN CUENTA:
En los contadores, el tamaño de las señales no coincide con el tamaño de las células, sino que está en
relación con la complejidad de la célula.
Así, el tamaño de la señal de los neutrófilos es mayor que el de la señal de los monocitos, a pesar de que
estos tienen mayor tamaño

4. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS.
 LISTADOS: Suelen incluir:
• Tipo de célula
• Valor medio y unidades
• Valor medio o intervalo de referencia
• Unidades en que se expresa
• Normalmente usan abreviaturas (generalmente en inglés)
• Pueden presentar alguna marca para resaltar valores fuera de los límites de normalidad.

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  POLÍGONOS DE FRECUENCIAS:

• Son representaciones gráficas sobre el eje de coordenadas, en el que sobre el eje de abscisas se
colocan los valores de la variable en estudio y sobre el eje de ordenadas su frecuencia.
• Dos líneas verticales señalan el intervalo de normalidad, facilitando la interpretación de resultados.
• Suelen representar el volumen de GR y concentración de Hb.

 DIAGRAMAS DE DISPERSIÓN:

• Representan 2 características en estudio de la célula.

• Generalmente en ordenadas se representa el tamaño y en abscisas cualquier otra variable
(actividad peroxidasa, intensidad de tinción con azul de Alcián o fluorescencia).
• Cada célula queda representada como un punto colocado según el valor de las dos características
estudiadas.

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 5. CAUSAS DE ERROR

ERRORES DE COINCIDENCIA:

Se denomina así al fenómeno producido cuando dos o más células pasan por la zona detectora en el mismo
momento, o cuando se producen dos pulsos tan juntos que no pueden discriminarse.

 Si 2 células iguales se mueven muy juntas a través de la apertura, se produce un pulso de tamaño doble
que se cuenta como una sola célula de volumen doble. (C).

 Si las 2 células se mueven en tándem (una sale a la vez que la otra entra), se produce un pulso de doble
joroba y se registra un valor erróneo. (B)

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 6. CALIBRACIÓN Y MANTENIMIENTO.

Son necesarios para garantizar la exactitud de los resultados obtenidos.

 Conviene detectar cualquier desviación de resultados mediante el control de calidad establecido por el laboratorio.
 La calibración tiene como finalidad establecer la correspondencia entre los valores indicados por el aparato y los
representados por un material de referencia. Se puede hacer con muestras de referencia o calibradores comerciales.
 La conservación y mantenimiento de los autoanalizadores lo único que requiere es seguir las instrucciones que
proporcione la casa comercial.

5.3. CITOMETRÍA DE FLUJO

Es un análisis multiparamétrico, rápido y sensible, de células en suspensión en un líquido. Se hace que actuen
diferentes Acs monoclonales (AcMc), cada uno de los cuales está acoplado a un fluorocromo concreto (sustancia
fluorescente que emite a una longitud de onda característica). Se hace pasar las células de una a una por delante de un
haz de un láser. Entonces reemite una luz a diferentes ángulos y diferentes longitudes de onda:

 La luz difractada a pequeño ángulo informa del volumen celular.

 La luz difractada a gran ángulo informa sobre su contenido (núcleo, granulación).
 La intensidad de la reemisión luminosa a la longitud de onda correspondiente a un fluorocromo

dado permite apreciar la fijación de un AcMc, acoplado a este fluorocromo, al Ag que reconoce, y determinar la
presencia de este Ag en la célula.

Estas señales luminosas son estudiadas simultáneamente por diodos y por fotomultiplicadores al final del circuito
óptico complejo que pasa por espejos dicroicos (cada espejo refleja una sola longitud de onda) y por filtros interferenciales
(que captan, cada uno, la fluorescencia verde, anaranjada o roja). Las señales se digitalizan y se analizan por medio de
sistemas informáticos. La síntesis de los datos proporciona una medida de la proporción de las poblaciones celulares de
la suspensión, por ejemplo el cociente entre linfocitos CD4 y CD8, que se utiliza para seguir la evolución del SIDA.

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