CAMARA

NEUBAUER

PRESENTADO POR:
IXCHEL CANTU DIMAS

REALIZA ANALIS HEMATLOGICOS DE SERIE

ROJA
 INTRODUCCIÓN
A pesar del enorme desarrollo tecnológico que ha tenido lugar en los laboratorios
científicos, el conteo visual con hematocitómetro sigue siendo el método de conteo
más extendido desde el siglo XIX. El presente artículo se escribe con la intención
de ayudar a realizar un conteo celular con un hematocitómetro o cámara de
Neubauer a principiantes, y también a técnicos o investigadores experimentados que
deseen recordar las bases del mismo.
Primero, describiremos cada una de las partes y los principios de funcionamiento del
hematocitómetro.
En una segunda parte, se describe paso a paso cómo realizar un recuento celular con
hematocitómetro para obtener unos resultados fiables.
 Un hemocitómetro es un dispositivo ampliamente utilizado en los laboratorios
para contar visualmente el número de células en una muestra de sangre u otros
fluidos bajo un microscopio. Consiste en un portaobjetos de microscopio de vidrio
grueso, con una sangría cuadriculada que crea una cámara en forma de H, el
contacto de un cubreobjetos plano en la parte superior, produce un volumen
exacto de líquido sobre el área de conteo.

Al contar el número de células o partículas en una sección específica de la zona

cuadriculada, se puede luego calcular la concentración de células en el fluido total.
Un hemocitómetro con una capa metalizada ayuda a obtener mayores niveles de
precisión.

La cámara de conteo del hemocitómetro, con una plataforma central cubierta de

rodio (metalizada), tiene múltiples ventajas. A diferencia de una cámara regular,
donde las líneas están señalizadas directamente en el vidrio, las líneas de una
cámara recubierta de rodio están dispuestas a través de una capa fina de metal
semi-transparente.

El rellenado del hemocitómetro también es más sencillo, estando las células sanguíneas
distribuidas de manera uniforme y claramente definidas contra un fondo oscuro. Los ajustes
del microscopio también serán menos críticos al momento de obtener un resultado preciso,
esto debido al contraste que entrega la cubierta metalizada. Esta área recubierta no necesita
de cuidados especiales, más allá de los que requiere una cámara de conteo regular.

Una cámara de conteo metalizada debe cumplir con los estándares internacionales sobre las
demandas de precisión científica. La profundidad de la celda sobre las áreas regladas es
precisa hasta ± 0.001mm. Así también, las plataformas de soporte del cubreobjetos están
esmeriladas y pulidas ópticamente planas y coplanarias con área reglada para ± 0.001mm.

Finalmente, el espacio entre el cubreobjetos y la plataforma no variará de la profundidad

indicada en más de ± 0.001mm. Estos lineamientos aseguran que se cumplan los más altos
estándares de precisión dimensional para mantener las cámaras de conteo como
estrictamente confiables.
 CARACTERISTICAS
HEMATOCIMETROS

El hematocitómetro está compuesto por un juego completo de los elementos

necesarios para determinar la densidad de eritrocitos y leucocitos en sangre.

La cámara de recuento Neubauer está construida a partir de una única pieza de

vidrio lo que le proporciona una gran resistencia y durabilidad. Presenta
además, dos superficies reticuladas para el recuento celular de una profundidad
de 0,1 mm y está también equipada con dos cubreobjetos especiales de 0,4 mm
de grosor.

El juego incluye también una pipeta de dilución para eritrocitos y otra para
leucocitos, cada una con su correspondiente tubo de goma de
aproximadamente 35 cm de longitud y su boquilla de aspiración con un código
de color para su fácil identificación.

Compuesto por:

- Cámara Neubauer
- Pipetas de dilución (glóbulos blancos y rojos)
- Gomas
- Boquillas
Elementos necesarios para realizar un
conteo celular con Hematocitómetro

Los elementos necesarios para realizar un

recuento celular con hematocitómetro son los
siguientes:
a) muestra celular a medir
b) hematocitómetro, o cámara de
Neubauer
c) microscopio óptico
d) cubre objetos
e) pipeta / micropipeta con puntas
f) buffer para diluciones / PBS, en su
caso
 Concepto de los elementos

a)Muestra celular: Muestra de material como orina, sangre, tejido, células,

ADN, ARN o proteínas de seres humanos, animales o plantas. Las muestras
biológicas se usan para pruebas de laboratorio o se almacenan en un depósito
biológico para usarse en investigación.

b) Hematocimetro o camara neubauer: portaobjetos especial para contar

células bajo el microscopio. También se le llama cámara de Neubauer.

c)Microscopio optico: es un microscopio basado en lentes ópticas. También

se le conoce como microscopio de luz o microscopio de campo claro

d)Cubre objetos: es una fina hoja hecha de un material transparente

cuadrado o rectangular. Se coloca sobre un objeto que va a ser observado bajo
microscopio, el cual se suele encontrar sobre un portaobjetos, se suele usar en
campos como la química y la biología.

e)Pipeta/micropipeta con puntas: Las pipetas se utilizan para medir con

precisión y transferir líquidos. Con pipetas aforadas sólo se puede transferir
una cantidad de líquido definida. Las pipetas se utilizan para medir con
precisión y transferir líquidos.

f)Buffer para diluciones/ PBS, en su caso: Una disolución reguladora

(también llamada amortiguadora, tampón o "buffer") es una disolución capaz
de mantener el pH casi constante cuando se le añaden cantidades moderadas
de un ácido o de una base.
 camara neubauer
Se trata de una gruesa placa de
cristal con forma de portaobjetos,
de unos 30 x 70 mm y unos 4 mm
de grosor.
En una cámara simple, la porción
central, que es donde se realiza el
conteo, está dividida en 3 partes.
En la parte central se encuentra
grabada una retícula cuadrangular.
En el caso de cámara dobles, que
son las más comunes, existen 2
zonas de conteo, una superior y
otra inferior al eje longitudinal de
la cámara.

La cámara de recuento, Neubauer, es un dispositivo de precisión

hecho de vidrio óptico especial. Se utiliza para contar células u otras
partículas en suspensiones bajo el microscopio. Las cámaras de
recuento se utilizan principalmente para el análisis de sangre
(recuento de leucocitos, eritrocitos, trombocitos). Además, las cámaras
de recuento sirven para contar bacterias, espermatozoides y esporas
de hongo. La cámara de Neubauer o, también llamada,
Hematocimetro es un grueso portaobjetos de cristal, dividido en tres
secciones, la sección media a su vez cuenta con un rayado fino
formando una cuadrícula de 3 mm x 3 mm identificable fácilmente al
microscopio.
 Esquema de la cámara de Neubauer, indicando la zona de cuadrícula

Así mismo, esta sección está a exactamente 0.1 mm más

bajo que las secciones laterales, estableciendo un volumen
fijo una vez colocado el cubreobjetos especial
(cubrehematocimetro).

Esquema que indica la profundidad de la cámara

Al observar al microscopio la sección central, podremos

identificar un cuadrado de tres por tres, que en conjunto
mide 9 mm2.
 Dimensiones de la cuadrícula del hematocimetro

En esta cuadrícula podemos localizar fácilmente los cuatro

cuadrantes que están en los extremos, cada uno de ellos
divididos a su vez en un conjunto de 4 x 4, en el esquema
correspondiente se muestran con la letra A. En la parte central se
puede apreciar un cuadro central de 1 x 1 mm dividido en 25
cuadrantes de 0.2 x 0.2 mm, en la figura se encuentra delimitada
por un recuadro e indicado por una flecha.

 Cuadrantes del hematocimetro, indicando la cuadrícula

central

El cuadro central, al observarlo a mayor aumento, vemos

que cada cuadro de esos cinco limitados por una triple
línea, están constituidos a su vez por un conjunto de 4 x 4.
De estos 5 cuadros se utilizan de manera rutinaria los
cuatro conjuntos de los extremos y el central
Cuadrícula central de la cámara, indicando los conjuntos utilizados y
sus dimensiones

Para identificar en cuál de los cuadrantes centrales nos

encontramos, basta con localizar las líneas prolongadas, en la
siguiente figura podemos ver esa característica y el cuadro
correspondiente:

Líneas prolongadas indicando su correspondencia con el cuadrante a

contar
A diferencia de los cuadrantes 1, 2, 4 y 5, el cuadrante 3
no presenta estas líneas por ser un cuadrante central y
estar rodeado de otros cuadrantes, el cuadro 3 presenta
unas lineas como las mostradas en la figura

Cuadro central rodeado por otros cuadrantes

Los cuadrantes a utilizar dependerá de la cantidad y tipo

de célula a contar, de manera rutinaria se tiene que:

Glóbulos blancos se contabilizan en los cuadrantes A.

Glóbulos rojos, plaquetas y espermatozoides se
utilizan los cuadrantes B.

Es muy importante localizar e identificar todos los cuadrantes antes de

proceder al llenado de la cámara.
 RECUENTO DE ERITROCITROS
la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y linfocitos
son diferentes. Los glóbulos rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo,
mientras que los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul. Ten
en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de área y 0.10
mm de profundidad. El factor de dilución es por tanto de 1:200. Convierte el
número de glóbulos rojos contados en 5 cuadrados a nº glóbulos rojos/µl. (1 µl
(microlitro) = 1

como se realiza:
La imagen de abajo simula el campo que esta viendo al microscopio con
un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de la grilla. Intenta verificar
esto al ir moviendo el campo de derecha-izquierda y de arriba-abajo, como
si de una pletina de microscopio se tratase. Cuenta los glóbulos rojos en

los cinco cuadrados mencionados anteriormente y determina el recuento

de eritrocitos como se ha descrito anteriormente.
Muy importante: Cuando un eritrocito se sitúa en mitad de las
líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado.
Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas
inferior y/o de la derecha.

El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:

mujeres:
3.9-5.6 millones/µl
Hombres:
4.5-6.5 millones/µl

Tecnicas de contaje celular

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de
partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será
necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión
como el porcentaje de éstas que son viables.

Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas,

desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen
numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer),
hasta equipos automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter" de la
empresa Beckman-Coulter.
 El principio del contador celular se basa en la medida de los
cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una
partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa
un pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema, una
pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a través
de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión.
Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio
volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un
pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al
volumen de la partícula. controlando la cantidad de la suspensión
que circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño
de las partículas. Es posible contar y medir varios miles de
partículas por segundo, independientemente de su forma, color y
densidad.

es posible determinar la densidad celular empleando métodos más

sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por ej. la
cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje celular
es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a
medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un
volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el
número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar
la densidad de partículas en la suspensión de origen.
 La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve
en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos
lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del
cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada
0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el
cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al

microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se
ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se
ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre
dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y
marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central
del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma
que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie
marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y
el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x
células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular
será :
concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones
marcadas como L y que en el microscopio se ven como una
cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de
lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio
invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular

adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes observar
una cámara de Neubauer doble, como las que usas en el
laboratorio de prácticas.
 Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes
métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul
tripán es un coloide que se introduce en el interior de las
células que presentan roturas en la membrana. Así pues las
células que aparecen en la imagen, claramente de color azul,
son consideradas no viables. Asimilar células blancas, por
exclusión, a células viables es un error pues por este método se
sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión,
determinando como inviables sólo aquellas con la membrana
rota. Existen otros métodos de determinación de la viabilidad
celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio
En la red dispones de descripciones detalladas sobre como
utilizar un hemocitómetro, como la propuesta por P.J. Hansen, o
la detallada descripción que aporta Beckton-Dickinson, y los
problemas de cálculo de parámetros celulares que plantea
empleando datos obtenidos a partir de un hemocitómetro, y
otros protocolos para el contaje de células (en protocol-online)
 Operacion del equipo
de conteo
Manejo de la cámara de recuento celular Neubauer improved
La cuadrícula de recuento está formada por 9 cuadrados grandes, cada uno de ellos con una
superficie de 1 mm2.

El cuadrado grande central (que se puede ver en su totalidad con el objetivo 10X; ver figura),
está dividido en 25 cuadrados medianos (con el objetivo 40X se pueden ver los cuadrados
medianos completamente; ver figura), cada uno de ellos con 16 cuadrados pequeños en su
interior. Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas (no se muestran en la figura), están
formados por 16 cuadrados medianos.

El recuento se puede realizar tanto en el cuadrado grande central como en los de las
esquinas, dependiendo del tamaño de las células en estudio. En este ejemplo realizaremos
el recuento en el cuadrado central.

Cuando colocamos la muestra bajo el cubreobjetos, la suspensión celular alcanza una altura
de 0,1 mm. Teniendo estos datos en cuenta, y si consideramos uno de los cuadrados
grandes, el volumen contenido en éste será de:

1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3 = 10-4 ml

Con el objetivo 10X del microscopio hay que localizar la zona de recuento (uno de los
cuadrados grandes). Para contar las células se cambia al objetivo 40X. Se cuentan las células
contenidas en todos los cuadrados medianos (25 si hemos elegido como zona de recuento el
cuadrado grande central o 16 si hemos elegido una de las esquinas) de acuerdo con el
siguiente criterio:

Hay que contar todas las células que están dentro de cada cuadrado mediano y aquellas que
están tocando los lados superior y derecho de dicho cuadrado (aunque estén parcialmente
fuera). Siguiendo este criterio, en la figura se contarían las células en color verde, y no se
contarían las células en color rojo.

Si hemos contabilizado N células en uno de los cuadrados grandes (o sea, en 25 cuadrados

medianos), la concentración de nuestra muestra será:

N x 104 cel/ml

Si para hacer el recuento hemos tenido que concentrar o diluir la muestra inicial, hemos de
tener en cuenta este factor de concentración-dilución (f):

N x 104 x f cel/ml

suspensión celular inicial = suspensión celular diluida x factor de concentración-dilución

 pasos a seguir:
Se aseptiza el dedo con alcohol
y luego se seca al aire o con
algodón. Se coge entre el pulgar
y el índice y se hace una
punción rápida y penetrante a
través de la piel de la punta del
dedo con una lanceta estéril.

2. Se deshecha la primera gota de

sangre y se aspira la siguiente con la
pipeta de dilución perfectamente
limpia y seca hasta la señal 1 o 0.5
(también puede utilizarse la pipeta
de hemoglobina, de 20 microlitros).
Hay que evitar la entrada de
burbujas de aire, pudiendo
ayudarnos de un papel de filtro para
conseguir el enrasado.
 3. A continuación se toma con la
pipeta líquido de Hayem, isotónico
con la sangre, hasta la señal 1; así, la
sangre queda diluida al 1/10, si
tomamos sangre hasta la señal 1, o al
1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así
porque el volumen de la bola de la
pipeta es 100 veces superior al del
capilar de la misma. (Si hemos
utilizado la pipeta de hemoglobina
podemos diluir su contenido en 2 o 4
ml de líquido de Hayem para obtener
diluciones 1/100 o 1/200).

4. Tomamos la pipeta (o el tubo de

ensayo) entre los dedos índice y
pulgar y agitamos. A través de la
goma de conexión con la pipeta,
soplamos para despreciar las
primeras gotas por corresponder al
líquido que estaba en el capilar.
 5. Se adapta un cubreobjetos sobre una
cámara cuentaglóbulos limpia y seca y
se coloca una gota en uno de los lados
del cubre; esta gota penetra por
capilaridad y rellena el retículo de la
misma.

6. Una vez preparada la cámara se

coloca sobre la platina del microscopio
dejándose unos minutos en reposo
para que sedimenten los glóbulos.
Disponemos el condensador bajo y luz
débil; enfocamos primero con el
objetivo débil seco y luego se cambia
al fuerte seco para proceder al
recuento, que se lleva a cabo en los
cuadrados pequeños del retículo
marcado en color rojo. Finalizado el
recuento se procede a la limpieza de la
pipeta con acético 1:3, agua destilada y
alcohol-éter sucesivamente.
7.El volumen de sangre en el cual se han contado las
células resulta de multiplicar la profundidad de la
cámara por el factor de dilución, la superficie de los
cuadrados y el número de cuadrados contados.
Con cámara de NEUBAUER: Superficie de 1 cuadrado
grande (1/20 mm de lado):
Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de
profundidad):

Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados

pequeños, el número de glóbulos por cuadrado será
a/n.
Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/n glóbulos rojos,
en 1 mm3 habrá X. Luego:
siendo X el número de glóbulos rojos existentes por
cada mm3 de sangre diluida.
Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que
multiplicar el valor X por 100 o 200 respectivamente,
con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que
representa el número de glóbulos rojos existentes
por cada mm3 de sangre (sin diluir).
 Se utilizan para calcular, mediante el uso del
microscopio, el número de partículas (leucocitos,
hematíes, bacterias…) por unidad de voluimen de un
líquido.
La cámara está constituida por una placa base de
vidrio especial pareciso a un porta, su parte central se
encuentra separada de los extremos por unas ranuras.
en ella se encuentran las cuadrículas de recuento.
La fórmula de contaje es: partículas/mm3= partículas
contadas.
Clases de cámaras:
- Neubauer improved: Es el más utilizado (9 cuadros
grandes, cada 1 de 1 mm2.)
- Neubauer: La diferencia es el cuadro grande central.
- Thoma: Se utiliza solo para el recuento de
eritrocitos.
- Fuchs-Rosenthal: Se utiliza habitualmente para
recuento de células en líquidos orgánicos (LCR,
Líquido sinovial…)
calculos de recuento celular
Si se contaron todas las células presentes en los 4 cuadros de 1 mm2
marcados como A, B, C y D, la concentración celular se calcula de acuerdo a la
fórmula: C = N •104 • dil En donde: C = cél/mL N = promedio de células
presentes en 1 mm2 (0.1 µL) dil = factor de dilución (cuando se consideró
necesario diluir la muestra. Es importante aclarar que si se usó 1 mL de
muestra y 9 mL de agua sin células, el volumen total es 10 mL y el factor de
dilución es = 10. Esta dilución se define como uno en diez -1:10-. NOTA: Esta
aclaración se debe a nuestra observación que frecuentemente se agregan 10
mL de agua a 1 mL de muestra y se usa 10 como factor de dilución lo que
esto no es correcto). 104 = factor de conversión de 0.1 µL a 1 mL

Si las células se contaron en el cuadro central (25 cuadros) considerando solo

los 5 cuadros menores del cuadro central marcado con X, la concentración
celular se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula: C = [ (N / 4) / 10-6 ] • dil. En
donde: C = cél/mL N = promedio de células presentes en los 5 cuadros
pequeños del cuadro central 4 x 10-6 = corresponde al volumen de la muestra
expresado en cm3 (mL) sobre el área de los cuadros pequeños la cual equivale
a 0.004 mm3 (0.004 µL) (0.2 x 0.2 x 0.1) dil = factor de dilución Para el caso del
hematocitómetro de 0.2 mm de profundidad, los cálculos son los mismos pero,
considerando que la profundidad es doble, es decir, 1 mm2 corresponde a un
volumen contado de 0.2 µL y el factor de conversión de µL a mL es 5 • 103 . La
cámara Sedgwick-Rafter consta de un portaobjetos con un marco rectangular
de 50 x 20 mm y 1 mm de profundidad. Con el fin de facilitar el recuento, los
modelos actuales tienen una reglilla con 20 columnas y 50 líneas. Para un
cultivo muy concentrado de una especie unicelular se sugiere diluir, como por
ejemplo 1:1000 y contar toda la cámara. En este caso, los cálculos para
determinar la concentración celular (cél/mL) es:
 C = N • dil
En donde: C = cél/mL N = células contadas en toda la cámara dil =
factor de dilución Es necesario recordar que independientemente
del tipo de cámara, la precisión de los recuentos depende de la
distribución al azar de las partículas (células) sedimentadas. Por
este motivo, en el caso de especies que forman cadenas se deben
contar las cadenas (que son las que se distribuyen al azar) y
posteriormente determinar el promedio del número de células por
cadena, con el cual se puede calcular el número total de células de
esa especie presente en la muestra.

Protocolo para el recuento celular con cámara de 0.1

mm (Neubauer)

a) Agitar el cultivo para permitir que las células tengan una distribución
homogénea.
b) Tomar una muestra de 1 mL y colocarla en un tubo previamente lavado
y seco. Agregar una gota de lugol para fijar las células. (Solución A: pesar
10 g de KI y disolver en 100 mL de agua destilada. Solución B: pesar 5 g de
I2 cristalino y disolver en 10 mL de CH3 COOH. Mezclar ambas soluciones
(A+B), agitar bien y mantener en frasco ámbar).
c) Cuando el cultivo está muy concentrado (>106 cél/mL) se diluye la
muestra con agua de mar o destilada (según sea el caso). NOTA:
Generalmente una dilución 1:10 es suficiente, pero es necesario verificar
que la concentración resultante sea suficiente para obtener una precisión
adecuada, la cual depende del número de células presentes en promedio
en 1 mm2 , de acuerdo con la fórmula µ = x ± 2 x en la cual µ es la media
poblacional, calculada a partir del estimador x el cual es el promedio de
células contadas en 1 mm2 (Lund et al., 1958). Por lo anterior, si se
cuentan en promedio 25 células en 1 mm2 , la precisión de ese recuento
es 25 ± 2 25 = 25 ± 10.
 d) El tubo se agita y se succiona una muestra con una pipeta Pasteur.
e) Se llena la cámara con el cubreobjeto ya puesto, colocando la
punta de la pipeta Pasteur en la muesca en forma de V que tiene la
cámara, cuidando que el volumen depositado sea suficiente para que
una parte llegue hasta los canales laterales, pero sin inundarlos
completamente. Si esto sucede, se seca y limpia la parte inferior de la
cámara y se observa al microscopio para verificar que las células
tengan una distribución adecuada (no agrupada). Para los modelos
que no tienen muesca, colocar la gota cerca del margen del
cubreobjetos, procurando que no se expanda a la parte superior del
mismo. Una alternativa aceptable es colocar la gota en uno de los
canales laterales, verificando que el exceso llegue hasta el otro canal
lateral.
f) Generalmente se enfoca la cámara con el objetivo 10X aunque en
ocasiones cuando se trata de células pequeñas se utiliza el de 40X.
Esto facilita la identificación de las células, discriminando los residuos y
demás objetos con tamaño similar a la especie que se está cultivando.

g) El registro se hace contando las células que quedan dentro de cada una
de las cuadrículas marcadas como A, B, C y D indicadas en la Figura 1. En el
caso de las células que tocan las líneas de demarcación entre cuadros, se
cuentan solamente las que tocan dos de los cuatro lados, seleccionados al
azar.
h) Para tener un recuento más preciso, se usan tres o más submuestras de
cada muestra y con éstas se calcula la concentración media. Para calcular la
concentración celular (cél/mL) se utiliza la fórmula indicada anteriormente.
i) Con los datos de concentración celular (cél/ mL) de cada recuento en
tiempos sucesivos (generalmente a intervalos de 24 h) se obtiene la curva
de crecimiento graficando en el eje de las “Y” los valores de concentración y
en el eje de las “X” el tiempo (en días). También es importante determinar la
tasa de crecimiento (µ), el tiempo de generación (tg ) y el número de
duplicaciones (n) (Schoen, 1998).
 Densidad optica
La concentración celular puede ser estimada indirectamente
usando la densidad óptica del cultivo, que es una técnica menos
precisa del recuento directo, pero permite una evaluación rápida
de la concentración microalgal, en especial si se cuenta con una
curva de calibración entre la concentración celular de una especie
determinada, evaluada directamente, y las lecturas de densidad
óptica de uno o más cultivos de esa especie. Uno de sus
inconvenientes es que la contaminación bacteriana y/o de otro
tipo (basura, residuos), dará lecturas erróneas, por lo que hay una
tendencia a evitarla. La mencionamos en este capítulo, ya que
todavía se usa en algunos laboratorios para reconocer
rápidamente las fases de crecimiento de los cultivos, por lo cual
permite tomar decisiones inmediatas sobre los tiempos de
cosecha o de dilución. Algunos autores proponen el uso de una
longitud cercana al pico de absorción de la clorofila (675 nm), lo
cual permite obtener una lectura aún cuando la concentración
celular es baja, mientras que para otros ésta se debe acercar al
mínimo de absorción. Esto se debe al hecho de que el contenido
celular de clorofila puede variar de acuerdo a la cantidad de luz
disponible, la cual cambia de acuerdo a las condiciones
experimentales y a la edad del cultivo por lo cual, como nosotros,
sugieren leer a 550 nm
 Protocolo para determinar la
densidad óptica
1) Agitar el cultivo ya sea recién inoculado y/o en la fase de crecimiento
que se haya seleccionado, para permitir que las células se distribuyan
homogéneamente.
2) Colocar el volumen necesario de muestra (en el caso que el cultivo
esté muy concentrado, hacer una dilución) en una celda de volumen y
camino óptico apropiados, dependiendo del tipo de instrumento del
cual se disponga en el laboratorio, agitar nuevamente y medir
rápidamente la transmitancia o la absorbancia (densidad óptica) en el
colorímetro o espectrofotómetro, usando la longitud de onda
seleccionada. Previamente, el equipo se calibra con agua destilada o de
mar (aunque en general hay diferencias mínimas entre los dos tipos de
agua), dependiendo si la microalga es de agua dulce y/o marina.
3) Con los datos de densidad óptica se obtiene la curva de crecimiento
graficando los valores de densidad óptica (DO) en el eje de las “Y” con el
tiempo en el eje de las “X”, recordando que cuando se usa la
transmitancia (T = % de la luz incidente recibida por el fotodetector), es
necesario utilizar la transformación: DO = 100 - T
 fuentes de investigacion
ALFONSO, E. y Leal, S. (1998). Creación y
Mantenimiento de un Cepario de Microalgas.
Centro de Investigaciones Marinas,
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