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PRACTICA N02: BIOTECNOLOGUIA DE ALIMENTOS

USO DE LA CAMARA NEUBAWER

I)

OBJETIVOS
Tener conocimiento del Uso de las cmaras neubawer
Identificar los procedimientos para el montaje de la cmara neubawer
Conocer las frmulas para el recuento

II)

REVICIN BIBLIOGRFICA
Cmara de Neubauer
La cmara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y biologa para
realizar el recuento de clulas en un medio lquido, que puede ser un cultivo celular,
sangre, orina, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc. Adems las cmaras de
recuento sirven para contar bacterias, esperma y esporas de hongo.

Esta cmara de recuento est adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste


de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas en
cuyo fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula de dimensiones
conocidas. Se cubre la cmara con un cubreobjetos que se adhiere por simple tensin
superficial (en especial una vez que se haya aadido la muestra lquida).
Luego se introduce, por capilaridad entre la cmara y el cubre, el lquido con las clulas
a contar, generalmente tras una dilucin previa; puesto que la cmara tiene dos zonas
esto permite hacer dos recuentos simultneamente. Se observa la retcula al microscopio
con el aumento adecuado y se cuentan las clulas.
A partir del nmero de clulas contadas, conociendo el volumen de lquido que admite
el campo de la retcula, se calcula la concentracin de clulas en la muestra lquida
aplicada.
El clculo de la concentracin de clulas se puede expresar as:
Partculas / l = (partculas contadas) / [ (superficie contada (mm)profundidad de la
cmara(mm) ] dilucin
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Reticulo Neubauer
En la retcula central, la cmara de Neubauer tiene un
cuadrado primario que contiene nueve cuadrados
secundarios, cada uno de ellos dividido a su vez en 16
cuadrados terciarios. El cuadrado secundario central
contiene no 16, sino 25 cuadrados, cada uno de ellos
dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los
bordes de este cuadrado central se cuentan los
hemates, utilizando slo los cuadrados de los bordes
del terciario central y uno de los centrales. En los
secundarios de los bordes superiores e inferiores de la cmara se hace el recuento
leucocitario.

EL PRINCIPIO DE CONSTRUCCIN
Todas las cmaras de recuento
muestran el mismo principio de
Construccin.
Dentro de una rectangular placa de
vidrio ptico especial del tamao de un
portaobjetos se encuentran en el tercio medio cuatro ranuras longitudinales, que
son paralelos a los laterales cortos.
Las dos grandes superficies laterales no estn tratadas y sirven para la rotulacin.
El soporte central y los dos soportes exteriores estn planamente esmerilados y
pulidos. La superficie del soporte central es un poquito ms baja que la de los dos
soportes exteriores. Los retculos de recuento estn grabadas en el soporte central
(fondo de la cmara).
Cuando se coloca un cubre- objetos sobre los soportes exteriores,
espacio capilar entre la cara inferior
del cubreobjetos y el soporte central
de la cmara de recuento.

se

crea

un

MODELO E IDENTIFICACIN DE LAS CMARAS DE RECUENTO:

Modelo simple - soporte central sin divisin


(un retculo de recuento)

Modelo doble - soporte central dividido


(dos retculos de recuento)

Adems, se diferencia:
El modelo normal: el retculo de recuento est grabado directamente en el vidrio.
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El modelo de lneas claras: primero se recubre el fondo de la cmara con metal y luego
el retculo de recuento est grabado en esta capa de metal.
Identificacin:
En las dos superficies laterales, no tratadas, estn indicadas las siguientes
informaciones:
El sistema del retculo
El nombre y la marca registrada de Marienfeld Superior
La profundidad de la cmara en milmetros
La superficie del cuadrado ms pequeo en mm2
FABRICACIN Y EXPLICACIONES DE CALIDAD:
Las cmaras de recuento son aparatos de precisin e instrumentos in-vitro
diagnosticos. Se utilizan principalmente en laboratorios mdicos. Por eso un cmara
recuento que es aplicada o distribuida en la Union Europea tiene que ser aprobada y
marcada con el simbolo CE.
Todas las cmaras de recuento vendidas por la empresa Marienfeld se fabrican de
acuerdo a los requisitos de la Ordenanza de Verificacin alemana y la norma DIN.
Fabricacin de cmaras de recuento de sangre:
La fabricacn slamente se describe brevemente. Se compone de diferentes pasos
parciales, controles intermediarios y un final control de calidad.
El campo central (el fondo de la cmara) y los dos campos exteriores son esmerilados y
pulidos. Hay que prestar especial atencin que estas superficies quedan
absolutamente planas y la profundidad exacta. Los requerimientos estn fijados en
la norma DIN 12874. El campo central est bajado segn la divisin del respectivo
sistema (por ejemplo Neubauer 0,1 mm). Se fabrican varias profundidades estandar y
especiales (p.ej. 0,2; 0,5; 0,01 y 0,02 mm).
Despus de estos pasos se graba la divisin (del retculo en cuestin) en el campo
central y seguido se realizan los procesos de impresin y secado al horno. Un contrl
final muy rgido que cumple con las exigencias de las normas DIN y la Oficina alemana
de Contraste termina la fabricacin.
Exigencias al control de calidad:
Las diferencias lmites segn la norma DIN 12847:
La profundidad de la cmara en la zona del retculo 2 % del valor nominal las distancias
inferiores a 0,4 mm entre las lneas del retculo 2 m
Las distancias superiores a 0,4 mm entre las lneas del retculo 0,5 % del valor nominal
los ngulos de la divisin del retculo 1 grado
La anchura de las lneas de divisin no debe de ser superior a 5 m
La tolerancia de planeidad, segn DIN 7184, parte 1:
El fondo de la cmara en la zona del retculo de recuento 2 m la superficie de apoyo 2
m las lminas cubreobjetos 3m (segn DIN 58884)

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III)

MATERIALES, MTODOS Y PROCEDIMIENTO


Los elementos necesarios para realizar un recuento celular con hematocitmetro son
los siguientes:
a)
b)
c)
d)
e)
f)

muestra celular a medir


hematocitmetro, o cmara de Neubauer
microscopio ptico
cubre objetos
pipeta / micropipeta con puntas
buffer para diluciones / PBS, en su caso

LA CMARA DE NEUBAUER, O HEMATOCITOMETRO.


Se trata de una gruesa placa de cristal con forma de portaobjetos, de unos 30 x 70 mm
y unos 4 mm de grosor.
En una cmara simple, la porcin central, que es donde se realiza el conteo, est dividida
en 3 partes.
En la parte central se encuentra grabada una retcula cuadrangular.
En el caso de cmaras dobles, que son las ms comunes, existen 2 zonas de conteo,
una superior y otra inferior al eje longitudinal de la cmara.

La retcula completa mide 3 mm x 3 mm de lado. Subdividida a su vez en 9 cuadrados


de1mm de lado cada uno. Fig. 4 1
En caso de recuento de sangre, los cuadrados de las esquinas son los destinados al
recuento de leucocitos. Al existir estos en menor nmero que los hemates, se necesitan
menos lneas de referencia para realizar el conteo.
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El cuadrado central es el destinado al recuento de hemates y plaquetas. Se divide en


25 cuadrados medianos de 0,2 mm de lado (Fig.4-2) , y cada uno de estos cuadros se
subdivide a su vez en 16 cuadrados pequeos. Fig 4-3
El cuadrado central est por tanto formado por 400 cuadrados pequeos.
CUBREOBJETOS
El cubreobjetos es un cuadrado de cristal de aproximadamente 22 mm x 22 mm.
Debe colocarse sobre la cmara de recuento de forma que cubra la parte central
de la cmara, delimitando un espacio entre la cmara y el cubreobjetos de 0,1 mm.
Es comn que el cubreobjetos quede ligeramente levantado cuando aplicamos ms
lquido del necesario a la cmara. Para evitar esto, existen algunas cmaras que
tienen dos pinzas especiales para evitar que el cubreobjetos se levante, y la distancia
sea mayor de 0,1 mm.
PIPETA
Se trata de un instrumento de laboratorio que permite medir alcuota de lquido con
bastante precisin. Tpicamente han sido principalmente de vidrio, pero en la
actualidad se utilizan ampliamente las micropipetas,
que
tienen puntas
esterilizadas desechables. Las ms habituales estn calibradas
para una
capacidad mxima de 20, 200 y 1000 uL.

PASO 1. Preparacin de la muestra.


Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habr de prepararar una muestra
con una concentracin apta para su recuento.
Tpicamente, el rango de concentraciones que permite contar el hematocitmetro est
entre 250.000 clulas y 2,5 millones de clulas por ml.
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Intentaremos que la muestra tenga una concentracin en torno a 106 (1 milln)


aplicando las diluciones correspondientes.
Por debajo de 250.000 clulas / ml (2,5 * 105) la cantidad de clulas contadas
no
es suficiente para poder dar una estimacin lo suficientemente fiable de la
concentracin celular.
La concentracin ptima para conteo en hematocitmetro es de 1 milln de clulas por
ml = 106 clulas /ml.
Por encima de 2,5 millones (2,5 * 106) la probabilidad de cometer errores de conteo
crece demasiado, y tambin el tiempo y esfuerzo necesario para realizar un recuento
con fiabilidad. Porencima de esta concentracin es conveniente diluir la muestra para
acercar la concentracin al rango ptimo.
Llenado de la cmara de recuento:
Posicionamiento del cubre-objeto:
Los
soportes
exteriores
se
humedecen
con agua
destilada.
Luego se coloca el cubre- objeto a
suave presin desde delante sobre la
cmara de recuento.
Atencin: Peligro de rotura del cubre-objeto!
La creacin de lneas de interferencia (anillos de Newton) entre los soportes
exteriores y el cubre-objeto indica que el cubre-objeto est colocado correctamente.
Cargar:
La pipeta bien mezclada se quita del agitador y
se tiran las primeras gotas.
Limpiar y secar la pipeta por fuera y mantenerla
inclinada hasta que se haya formado una
pequea gota en la punta.
Esta gota se sita en el punto entre el cubreobjeto y la cmara de conteo.
Por efecto de capilaridad el espacio entre el
cubre-objeto y el fondo de la cmara se llena.
Antes de que la solucin de sangre pueda
desbordar esta parte de la cmara, se debe
retirarla. Si hay burbujas de aire o si se ha
despordado lquido a las ranuras, la cmara
tiene que ser limpiada y nuevamente cargada.

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PASO 2. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer


Se toman 10 uL de la mezcla preparada en el paso 1 con la micropipeta.
1) Se coloca un cubreobjetos sobre la cmara de Neubauer, y se coloca en
posicin horizontal sobre la mesa, en un lugar donde nos sea cmodo pipetear.
2) Se introduce una punta desechable en el extremo de la micropipeta,
3) Se ajusta la micropipeta para succionar 10 uL de lquido. Generalmente este
ajuste se realiza girando el botn del embolo para seleccionar el volumen
deseado.
4) Se introduce la punta de la micropipeta en la muestra
5) Se pulsa el pistn o embolo superior de la pipeta suavemente hasta que se
siente como el pistn llega al final de su recorrido.
6) Se saca la punta de la pipeta de la muestra, y siempre mantenindola en
posicin vertical se lleva hasta la cmara de Neubauer.
7) Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de
la cmara de Neubauer. Se trata de dejar que el lquido penetre entre la
cmara y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad.
8) Se suelta el pistn suavemente mientras se supervisa que el lquido
est entrando correctamente y de forma uniforme en la cmara. (ver Fig.5)
9) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o
algo no haya salido bien, repetir la operacin
Ya tenemos la cmara de Neubauer cargada, lista para el recuento celular.

PASO 3. Preparacin y enfoque del microscopio.


1. Colocar la cmara de Neubauer en la bandeja del microscopio. Si el microscopio
dispone de pinza de sujecin, fijar la cmara con ella.
2. Encender la luz del microscopio.
3. Enfocar el microscopio hasta que pueden verse ntidas las clulas mirando por
el binocular.
4. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En este ejemplo
vamos a contar 5 cuadros grandes de una cmara de Neubauer Improved de
0,1mm de profundidad. Ver Fig. 8
5. Realizar el recuento de clulas en el primer cuadro.

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Existe una convencin por la cual si las clulas tocan el lmite superior o el lmite
izquierdo del cuadro, deben contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el lmite
inferior o el lmite derecho.

En caso de que la concentracin celular sea muy alta, y sea fcil perderse en el recuento,
se suele utilizar un orden de conteo en forma de zig-zag, como el descrito en la Fig.7
6. Anotar en una hoja de resultados la cantidad de clulas contadas en el primer
cuadro.
7. Repetir el proceso para el resto de los cuadros que deseamos contar, anotando
el resultado de cada uno de ellos. Cuantos ms cuadros contemos, ms
precisin obtendremos en nuestra medida.

PASO 4. Clculo de la concentracin.


Aplicamos la frmula del clculo de concentracin celular.

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El nmero de clulas es la suma de todas las clulas contadas en todos los cuadros.
El volumen es el volumen total de todos los cuadros donde hemos hecho el recuento.
Como el volumen de 1 cuadro grande es:
0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie
0,01 cm2 * 0,1 mm (profundidad) =
0,01 cm2 * 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml
La frmula para recuento con cuadros grandes en cmara de Neubauer

En el caso de que hayamos aplicado una dilucin, deberemos trasformar la


concentracin obtenida durante el recuento celular en la concentracin de la muestra
original.
En este caso tendremos que dividir el resultado por la dilucin aplicada.
La frmula quedar:

Ejemplo:
Para una dilucin de 1: 10. Dilucin = 0,1
Para una dilucin de 1: 100, Dilucin = 0,01
Error
Errores de hasta 20% y 30% son comunes con este mtodo de recuento debido al
pipeteo, a los errores estadsticos por ser la muestra poco representativa, errores del
volumen de muestra realmente introducido en la cmara, etc.
Sin embargo, el hematocitmetro sigue uno de los mtodos ms ampliamente utilizados
en los laboratorios de todo el mundo.
Para acceder a un anlisis detallado del error que se est cometiendo en un recuento
determinado acceda a:

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IV)

CONCLUSIONES
El conteo en cmara es efectivo, siempre y cuando se realice con una muestra, para no
realizar este conteo con muchas muestras de concentracin desconocida podemos
valernos de una curva patrn, leyendo muestras ya contabilizadas en un
espectrofotmetro, as al leer Abs. De una mezcla podemos determinar la concentracin
por interpolacin en la curva patrn. Al obtener diferentes muestras en relacin al tiempo
con las que construimos la curva patrn tambin calcular la velocidad de reproduccin y
as utilizar los M.O. en procesos estandarizados. La velocidad de produccin de M.O.
depender siempre del sustrato, pero siempre llegar a una velocidad mxima como
explica el modelo de Michaelis-Menten

V)

BIBLIOGRAFIAS
1. Uso de las cmaras de recuento (Neubauer improved o ...
insilico.ehu.es/camara_recuento/

2. Cmara de Neubauer - Wikipedia, la enciclopedia libre


es.wikipedia.org/wiki/Cmara_de_Neubauer

3.

[PDF]cmara de Neubauer - Celeromics


www.celeromics.com/es/resources/docs/.../Conteo-Camara-Neubauer.pdf

4. Camara de recuento neubauer - SlideShare


es.slideshare.net/eliciruela/camara-de-recuento-neubauer

5.

[PDF]Camara thoma neubauer_Esp.cdr - GAB Sistemtica ...


shop.gabsystem.com/data/.../Camara%20thoma%20neubauer_Esp.pdf

6. Cmara de Neubauer - Carpeta Virtual: Materiales y equipo ...


andyoeml.blogspot.com/p/camara-de-neubauer.html

7.

[PDF]Cmaras de recuento - Brand


www.brand.de/fileadmin/user/images/products/...Lab/.../counting-s.pdf

8. Camara de neubauer - Scribd


es.scribd.com/doc/55063448/Camara-de-neubauer

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