LA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Y PASSIM EDUCATIVA

presentan:

I CURSO BASICO DE ANALISIS DE AGUA, SUELOS AGRICOLAS,

FERTIRRIEGO, HIDROPONIA Y CALIDAD DE ALIMENTOS

MÓDULO 3: ANÁLISIS DE CALIDAD DE LOS ALIMENTOS

TEMA 7: MICROBIOLOGIA Y ALIMENTOS
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ALIMENTOS

TEMA 7 : MICROBIOLOGIA Y ALIMENTOS

1. Importancia del Estudio de Microbiología de los

Alimentos

1.1 Los Microorganismos Como Productores de Alimentos

- Desde los tiempos remotos se han utilizado microorganismos para
producir alimentos, ya sea para la generación de nuevas sustancias como
en el alcohol mediante el proceso de fermentación; o para la generación
de características organolépticas (sabor, textura, etc.) más deseables.

- La mayoría de los procesos de fabricación de alimentos en los que

intervienen microorganismos se basan en la producción de procesos
fermentativos, principalmente de fermentación láctica, de los materiales
de partida. Esta fermentación suele ser llevada a cabo por bacterias del
grupo láctico. Como consecuencia de ella, se produce un descenso del
pH, lo que reduce la capacidad de supervivencia de especies bacterianas
indeseables (principalmente bacterias entéricas como Clostridium
botulinum).

- El proceso de fermentación es útil en las siguientes industrias:

lácteos, cárnicos, vegetales fermentados, pan y similares y productos
alcohólicos.

1.2. Los Microorganismos Como Agentes de Deterioro de Alimentos

- Se considera alimento deteriorado aquel dañado por agentes

microbianos, químicos o físicos de forma que es inaceptable para el
consumo humano.

- El deterioro de alimentos es una causa de pérdidas económicas

muy importante: aproximadamente el 20% de las frutas y verduras
recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna
de las 250 enfermedades de mercado.

- Los agentes causantes de deterioro de los alimentos pueden ser

bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo más
importantes.

- Los alimentos más fácilmente deteriorables son las carnes.

- Cada tipo de alimento se deteriora por acción de un tipo de

microorganismo concreto, cada asociación es específica.

1.3. Los Microorganismos Como Agentes Patógenos Transmitidos

por Alimentos

- Las patologías más comunes son las de carácter gastrointestinal.

- Las patologías asociadas a alimentos pueden aparecer como casos

aislados, cuando el mal procesamiento del alimento se ha producido a
nivel particular; pero suelen asociarse a brotes epidémicos más o menos
extendidos en el territorio; por ejemplo, el número de brotes epidémicos
asociados a alimentos durante los últimos años en todo el territorio
nacional ha oscilado entre 900 y 1000 brotes anuales.
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- Las patologías asociadas a transmisión alimentaria pueden ser de

dos tipos: infecciones alimentarias producidas por la ingestión de
microorganismos o intoxicaciones alimentarias producidas como
consecuencia de la ingestión de toxinas bacterianas producidas por
microorganismos presentes en los alimentos.

- Los tipos de microorganismos patógenos con importancia

alimentaria comprenden bacterias, protozoos y virus, en el caso de las
infecciones alimentarias, y bacterias y hongos (mohos) en el caso de las
intoxicaciones.

- Para que una bacteria pueda causar una infección es necesario

que el microorganismo presente un rango de temperaturas de crecimiento
compatible con la temperatura corporal de los organismos superiores
(40ºC).

- Por su parte, un virus será patógeno únicamente en el caso de que

las células animales presenten los receptores necesarios para que el virus
pueda adsorberse a ellas. Esta es la razón por la que hay especificidad de
reino entre virus animales, vegetales y bacterianos sin infecciones cruzadas
entre reinos.

- Por último, debido a la importancia en salud pública de las

toxiinfecciones alimentarias, la labor del microbiólogo de alimentos se
dirige, en muchos casos, al control destinado a evitar el consumo de
productos elaborados en condiciones deficientes y que, por tanto, sean
potencialmente peligrosos.

- Es necesaria la regulación legal de las características microbiológicas

de cada alimento, teniendo en cuenta la tolerancia del número de
microorganismos permisibles (los llamados valores de referencia).

2. Principios Básicos de Deterioro de los Alimentos.

2.1 Deterioro de Vegetales

- Desde el punto de vista nutritivo los vegetales pueden permitir el

crecimiento de levaduras, hongos y bacterias y, por tanto, ser alterados por
estos microorganismos.

- El pH y otras características de los vegetales también son compatibles

con los de muchas bacterias y, por tanto, éstas pueden crecer fácilmente.

- Los mayores causantes de deterioro son las bacterias del género Erwinia
y algunas Pseudomonas que producen pectinasas capaces de romper la capa
exterior de los vegetales y colonizar así los tejidos internos.

2.2 Deterioro de Frutas

- Las frutas tienen en torno al 85% de agua y en torno a un 13% de hidratos

de carbono, por lo que la cantidad de agua disponible es claramente inferior
a la de los vegetales, y los porcentajes medios de proteínas y grasas son 0,9
y 0,5% respectivamente.

El contenido de otros nutrientes como vitaminas y coenzimas es similar al de

los vegetales; por tanto en principio, sobre las frutas también pueden crecer
mohos, levaduras y bacterias.
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- Sin embargo el pH de frutas es demasiado bajo, en general, para que

pueda haber crecimiento bacteriano y elimina estos microorganismos del
deterioro incipiente de frutas, que es llevado a cabo por hongos y levaduras.

2.3 Deterioro de Carnes y Pescados Frescos y Procesados

- Las carnes son los alimentos más alterables debido en sus características
de composición: alto contenido de proteínas, grasas y cofactores que
favorecen el crecimiento bacteriano.

- Prácticamente todos los tipos de bacterias son capaces de crecer y

deteriorar productos cárnicos; además, la flora inicial del producto, más si
está procesado, puede ser muy variada.

- En cuanto al pH, el de la carne es compatible con la mayoría de los

microorganismos.

2.4 Deterioro de Carnes de Vaca, Cerdo y Similares.

- Al sacrificarse el animal se producen una serie de cambios fisiológicos

que dan inicio a la producción de la carne comestible. Este proceso tarda
entre 24 h y 36 h. a la temperatura habitual de almacenamiento (2-5º C).

- Durante el proceso de descenso de temperatura se inicia el deterioro

interno debido, sobre todo a Clostridium perfringens y enterobacterias; cuando
la temperatura es baja el deterioro es predominante debido a la flora
superficial.

- También se puede producir deterioro superficial debido a hongos y a

levaduras; sin embargo, en carnes procesadas, picadas, el deterioro es debido
solo a bacterias del grupo de Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella.

- El crecimiento de bacterias (sobre todo Pseudonomas) puede detectarse

primero por la aparición de colonias discretas, luego mal olor y luego una
capa de limo que cubre la pieza y que se produce por la coalescencia de las
colonias.

- Cuando hay un crecimiento abundante de bacterias no se produce

crecimiento de lso mohos porque aquellas consumen el oxígeno necesario
para que crezcan estos.

2.5 Deterioro de Carnes Envasadas y otros Productos

- La situación es distinta cuando la carne se almacena al vacío en refrigerador: en

este caso el deterioro es causado por bacterias lácticas o por algún tipo especial de
bacilo (Bacillus thermosphacta) en la mayoría de los casos. La presencia exclusiva
de bacterias lácticas o de enterobacterias depende del pH del producto (bacterias
lácticas se desarrollan a phs bajos) y de la eficiencia de la barrera al oxigeno del
envase.

- La presencia de nitritos también dirige el tipo de bacteria alterante porque inhibe

más los bacilos que las bacterias Gran-Negativas.

- En el caso de embutidos, cada uno de los componentes puede proporcionar

microorganismos alterantes. En general estos productos se deterioran más por
bacterias y levaduras que por hongos.
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- El deterioro de estos productos puede producirse de tres formas distintas: Producción

de Limo, Agriado y Cambio de Color.

- La formación de limo tiene lugar en la superficie y se debe predominantemente a

las bacterias lácticas; el agriado ocurre bajo la superficie y es consecuencia de la
actividad de las bacterias lácticas sobre productos que contengan lactosa. La
formación de color verde se debe a la producción de peróxidos o de H2S por algunas
bacterias y tiene lugar en el interior de las piezas.

- El enverdecimiento producido por peróxido es debido a bacterias lácticas, y el

producto verde no es peligroso desde el punto de vista toxicológico. El
enverdecimiento debido a H2S se produce por una reacción con la hemoglobina
causada por Pseudomonas o algunas bacterias lácticas.

- En el caso del tocino y productos curados, el tratamiento lo hace bastante

insensible a las bacterias y el principal proceso de desarrollo es debido a hongos.-
El deterioro de estos productos puede producirse de tres formas distintas:
Producción de Limo, Agriado y Cambio de Color.

2.6 Otros productos

·Huevos.
Su interior es estéril y están bien protegidos: cáscara, membranas interna y
substancias antimicrobianas de la clara. En condiciones normales las bacterias no
entran en contacto con la yema, a no ser que el largo tiempo de almacenamiento y
las condiciones de humedad permitan un desplazamiento de la yema. En este caso,
las bacterias entéricas y Pseudomonales presentes en la cáscara pueden contaminar
la yema.

·Cereales
Su bajo contenido en agua hace que solo ciertos tipos de Bacillus y hongos sean
capaces de producir deterioro.

·Lácteos
El deterioro de leche no pasteurizada se produce rápidamente debido a su alta
carga microbiana. En la pasteurizada el deterioro se debe a estreptococo
termorresistentes.

En el caso de mantequilla el deterioro se puede producir como putrefacción debido

a Pseudomonas putrefaciens o por enranciamiento debido a actividades lipolíticas
de algunas bacterias de tipo Pseudomonas o bacterias lácticas; aunque el deterioro
más frecuente de la mantequilla es el producido por hongos.

3. Métodos generales de análisis microbiológico de los

alimentos
Es necesario considerar la distribución desigual de los microorganismos en los
alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para
obtener resultados representativos.
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El número de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiológica de los alimentos debe limitarse al mínimo
necesario para así poder aumentar el número de análisis.

Los criterios de análisis aplicados han de ser específicos de cada alimento porque son diferentes los microorganismos
patógenos y alterantes de cada tipo de alimento.

3.1 Muestreo

El muestreo consiste en separar una serie de muestras representativas del lote para someterlas al análisis microbiológico.

Cuando hay que hacer un muestreo de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan
las normas de elaboración y conservación del alimento. Esto es especialmente importante en alimentos importados,
sobre todo los enlatados.

Ningún muestreo puede dar una garantía total de calidad microbiológica del alimento; si se analizan 30 muestras y no
aparece ninguna de ellas en malas condiciones microbiológicas, aún hay una probabilidad razonable de que el 10% del
lote sea microbiológicamente defectuoso.

3.2 Toma de Muestras Representativas

Una vez decidido el número de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse éstas de forma estadísticamente
representativa utilizando tablas de número al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras representativas de
todos los constituyentes del alimento, para ello se debe homogenizar la muestra usando batidoras o stomacher.

Utilización de los Microorganismos como Marcadores (índices e indicadores).

Históricamente, desde hace un siglo se estudia la detección de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coli-aerogenes
(enterobacteriaceas) como índice de contaminación final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi.

3.3 Microorganismo Indice:

Aquél cuya presencia alerta de la posible presencia de un microorganismo patógeno relacionado ecológicamente con él.
(ej. E. colí índice de S. typhi.)

3.4 Microorganismo indicador:

Aquel cuyo número indica un tratamiento inadecuado o una contaminación posterior del alimento analizado.

Un microorganismo dado puede actuar como índice e indicador simultaneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar
de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patógeno, se siguen llevando a cabo
análisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economía, rapidez y sensibilidad.

Los principales marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield.

3.4.1 Recuento de microorganismos viables totales (Muestras líquidas u homogeneizadas)

-Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este número no guarda relación
con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe
considerarse un indicador de las características higiénicas generales del alimento.

-Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la
flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los
microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de
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microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos

envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales.

- Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.

- Algunas técnicas biológicas de de recuento de viables:

1. Conteo en Placa Standard (Standard Plate Count): Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen
conocido del alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método de
muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de cultivo.

2. Conteo microscópico directo Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan
las bacterias.

3. Conteo de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba

para seguir la formación de microcolonias al microscopio.

4. Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias
presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco
exacto.

5. Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos
por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto puede ser medido. Usado en medios líquidos (lácteos).

- Además de las técnicas de recuento basadas en la formación de colonias observable (técnicas biológicas)
hay una serie de procedimientos de recuento basado en técnicas químicas e inmunológicas.

a. Métodos químicos de detección de microorganismos: Son aquellos en los cuales se usan sustancias químicas
que reaccionan con los microorganismos, lo cual puede ser medido. Un ejemplo de este método es la determinación
de Salmonella aureus por el metodo de Nucleasa Termoestable

b. Métodos Inmunológicos de detección de microorganismos: Normalmente se usan marcadores que detectan

flagelos (responsables de las formas móviles de Salmonella y otras bacterias). Algunos de estos métodos son:
Anticuerpo fluorescentes y Radioinmunoensayo, los cuales se usan para la detección de Salmonella sp.

3.4.2 Examen de Superficies

Métodos dirigidos a detectar y medir los números de microorganismos presentes en superficies contaminadas.
Algunas veces es necesario añadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido
utilizados para limpiar la superficie.

El método clásico de obtención de muestra es el uso de torundas de algodón o de alginato cálcico. Las muestras
se recogen en seco o en húmedo y se depositan sobre medios de cultivo líquido (generales o de enriquecimiento).

En algunos casos se usan otros métodos como el contacto con placa o la jeringa de agar.

3.4.3 Recuento de Mohos y Levaduras

Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22ºC o bien mediante diluciones sucesivas
y siembra en placa en superficie. Es necesario añadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el
crecimiento de las bacterias, que es más rápido que el de los mohos.

3.4.4 Detección de Enterobacteriáceas

El empleo de las enterobacterias (coliformes y no coliformes) como microorganismos indicadores se basa en que
estas bacterias son destruidas por los tratamientos de pasteurización, térmicos o clorados de las aguas con gran
facilidad. Por esto, la presencia de altos valores de enterobacteriáceas en los alimentos es síntoma de fallos en
el proceso de elaboración o de conservación que pueden acarrear riesgos para el consumidor.
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Su empleo como indicadores es preferible al simple análisis de coliformes (bacterias lactosa positivas) porque
la frecuencia de estos últimos puede ser menor, su determinación incierta (caso de cepas de Escherichia coli
fermentadoras lentas o caso de cepas no fermentadoras en Enterobacter) y a la menor sensibilidad de las
pruebas para coliformes.

- Aspectos prácticos

El desarrollo de métodos específicos para la detección de enterobacteriáceas totales puede ser una buena
estrategia en función de la relación coste/beneficio. Esta detección puede ser la única que se lleve a cabo en
regiones con pocos recursos analíticos.

Siempre que sea posible hay que completar el estudio con el análisis específico de enteropatógenos y hay que
valorar los riesgos de la presencia de “falsos positivos” (altos valores de enterobacteriáceas sin presencia de
enteropatógenos, lo que apoya su utilización como indicadores en vez de como índices) y de “falsos negativos”
(presencia de Salmonella spp. cuando los valores de enterobacteriáceas son bajos).

En la mayoría de los casos estudiados se ha comprobado que el recuento de enterobacteriáceas supone una
garantía suficiente para el consumidor.; en cualquier caso, los resultados son más fiables que cuando se
utilizan como indicadores sólo los recuentos de coliformes porque éstos últimos suelen ser más bajos y, por lo
tanto, más sujetos a error.

- Metodología

Los métodos generales son el uso del Agar con Cristal Violeta, Rojo Neutro, Bilis y Glucosa como medio
selectivo y, como medio de enriquecimiento, Caldo tamponado con Cristal Violeta, Bilis y Glucosa. En estos
medios, la Bilis supone el agente selectivo principal ayudado por el colorante Cristal Violeta; el rojo neutro es
indicador de pH para detectar la fermentación.

Hay que tener en cuenta la posible presencia de organismos dañados por la situación biológica del alimento
(bajo pH), por las condiciones desfavorables de almacenamiento (frío, congelación) o por el tratamiento por
calor.

3.4.5 Detección de Escherichia Coli y de Coliformes

-Principios Generales

Del origen fecal de esta bacteria se concluye que su presencia en un alimento indica que éste ha tenido
contacto con, y por tanto está contaminado por, materia de origen fecal. La supervivencia de estas bacterias en
medios no entéricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminación reciente. Por estas razones,
E. coli es el microorganismo índice ideal para la detección de contaminaciones recientes.

La identificación del grupo coli-aerogenes se hace mediante la detección de microorganismos capaces de

fermentar lactosa a 42º en presencia de un 2% de bilis y de cristal violeta.

En alimentos tratados también conviene comprobar la presencia de coli-aerogenes mediante la producción de

gas en verde brillante con 2% de lactosa, aunque esto no indica claramente contaminación fecal debido a los
múltiples orígenes de las bacterias de este grupo.

No es recomendable el uso del concepto de «coliformes fecales» definido por las que crecen en presencia de
sales biliares a 40-42º porque el grupo no está definido taxonómicamente y las diferencias experimentales en
los procesos de detección son muy críticas.

-Metodología

El método es sencillo, incubación en medio de MacConkey a 44ºC en anaerobiosis. Análisis de las colonias
positivas para detección de la producción de gas en medio con lactosa y de indol en medio con triptófano,
ambas determinaciones a 44ºC.
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Cuando los números de bacterias del grupo son del orden de 1 cfu/ml ó 1 cfu/10 gr de material el método
empleado es el descrito. Si el número es inferior se realiza un análisis del número más probable y un enriquecimiento
con caldo lactosado con verde brillante analizándose posteriormente los tubos positivos en medio de MacConkey.

Las bacterias de este grupo pueden entrar en un proceso de autoesterilización debida a la producción de ácidos
en sus procesos de fermentación, ácidos que terminan por matarlas. Por ello es necesario utilizar medios
tamponados. En muchos casos es necesario hacer un tratamiento de recuperación de los microorganismos
dañados en los procesos de preparación del alimento.

E. coli es un buen índice mientras que las coliformes en general sólo son buenos índices si los números son
inaceptablemente altos. Esto es debido a que el origen de E. coli es únicamente intestinal, mientras que las
coliformes pueden tener muchos otros orígenes.

La detección de E. coli es muy importante en el análisis de aquellos alimentos compuestos en los que el tratamiento
de cada una de las partes haya sido diferente.

3.4.6 Detección de Bacillaceae

Prueba para evaluar la contaminación post-tratamiento: En un alimento tratado térmicamente de forma adecuada
las únicas bacterias que pueden, en la práctica, estar presentes son las que hayan sobrevivido el tratamiento en
forma de esporas. Por esto, el recuento de viables ha de ser el mismo cuando se hace de forma estándar que
cuando se hace sometiendo previamente la muestra a un tratamiento equivalente al de esterilización (80ºc, 1
min).

Cuando se realiza la medida de esta manera y se observan diferencias éstas son debidas a contaminación post-
tratamiento ya que el tratamiento a 80ºC durante 1 minuto elimina todas las formas vegetativas sin dañar las
esporas más termosensibles, y activa, simultáneamente, la germinación de las esporas presentes en el alimento.

Esporas de termorresistencia elevada: hay esporas que son muy termorresistentes y que pueden sobrevivir
en conservas apertizadas. Para detectarlas se realiza una dilución de la muestra en un Caldo de Infusión de
Cerebro y Corazón y se la somete a un tratamiento de 120ºC durante cuatro minutos. Las colonias supervivientes
se recuentan tras una incubación a 50ºC.