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PROTEÍNAS

Alexander Posso (1335283078 ), Juan Camilo Llanos (1002862055), Angie Zemanate (1111538433)

alexander.posso00@usc.edu.co, juan.llanos01@usc.edu.co, angie.zemanate00@usc.edu.co

Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Química Farmacéutica, Universidad Santiago de Cali

Fecha de última sección: 28 de Septiembre de 2022


Fecha de entrega: 12 de Octubre de 2022

RESUMEN
En la práctica de laboratorio, se determinó la presencia de proteínas en un huevo, con el cual se realizaron
diferentes pruebas con solución albúmina para el reconocimiento de distintas propiedades que presentan las
proteínas, tales como la coagulación en la que se observó la desnaturalización de proteínas, debido a diversas
causas, como lo son el cambio de temperatura, pH, medios como las sales o disolventes orgánicos, los cuales
alteran su estructura y provocan cambios; asimismo en la prueba de precipitación de la proteína por iones
metálicos pesados la proteínas se desnaturalizan por su pH.
Palabras claves: Desnaturalización, solución albúmina, proteínas.
ABSTRACT
In the laboratory practice, the presence of proteins in an egg was determined, with which different tests were
performed with albumin solution for the recognition of different properties that proteins present, such as
coagulation in which the denaturation of proteins was observed, due to different causes, such as the change of
temperature, pH, media such as salts or organic solvents, which alter their structure and cause changes; also in
the protein precipitation test by heavy metal ions the proteins are denatured by their pH.
Key words: Denaturation, albumin solution, proteins.

1. PROCEDIMIENTO Al tubo número 1, con los 5ml de solución


albúmina se calentó en baño maría sobre la plancha
1. Coagulación de proteínas de calentamiento, controlando su temperatura con
un termómetro y observando cambios a medida que
Se realizó la solución albúmina, la cual consistió en pasaba el tiempo, para identificar a qué temperatura
separar la clara de la yema de un huevo, de esta y tiempo se insolubilizaba la proteína.
clara separada se le adiciono 5 ml a un tubo de
ensayo, el resto de la clara se pasó a un balón Al tubo número 2, se le agregó 2 ml de acetona, se
aforado de 100ml y se aforó con agua destilada. dejó en reposo y se observó y se anotaron los
cambios obtenidos después de unos minutos.
Los 7 tubos de ensayo, se enumeraron de 1 a 7, los
cuales se les adiciono 3 ml de la solución albúmina, Al tubo número 3, se le añadió 1 ml de HCl 9 N, y
excepto al tubo de ensayo número 1 que tenía 5 ml se observó y se anotaron los cambios.
de clara de huevo.
1
Al tubo número 4, se le agregó 2 ml de NaCl al A cada uno de estos tubos, se le agregó 4 ml de
20%, se observó y se anotó los resultados obtenidos. agua destilada, agitándolo muy bien para observar
los resultados y anotar cuál de los 2 tuvo una
Al tubo número 5, se le añadió 2 ml de HNO3 al insolubilización reversible y cual fue irreversible.
20%, y se observaron los cambios para anotarlos.

Al tubo número 6, se le agregó 4 ml de NaOH 5M,


observando sus cambios se anotaron. 4. Reacción xantoproteica

El tubo número 7 fue de control. En un tubo de ensayo se le añadió 3 ml de la


solución albúmina, que posteriormente se le agregó
2. Precipitación de la proteína por iones 3 ml de ácido nítrico al 20%, se observaron cambios
metálicos pesados. y se anotaron aquellos resultados. Se pasó a baño
maría en la plancha de calentamiento por algunos
Se depositó en un tubo de ensayo 3ml de la solución minutos, también se observó y se anotaron los
albúmina, y se añadió 1 ml de acetato de plomo resultados. Se dejó enfriar el tubo de ensayo, para
0,005 M, para luego esperar algunos minutos y se añadir 3 ml de hidróxido de amonio, para
observaron y anotaron los cambios obtenidos. Para finalmente anotar los resultados obtenidos.
que posteriormente se le añadieron 1 ml de EDTA
0.05 M, se agitó por un par de minutos y se 5. Reacción de Biuret
observaron para después anotar los resultados
obtenidos. En un tubo de ensayo con 3 ml de solución
albúmina, se añadió el mismo volumen de hidróxido
3. Insolubilización reversible e irreversible. de sodio 5 M, es decir, 3ml también, que
posteriormente también se le adicionó 5 gotas de
En un tubo de ensayo se le añadió 5 ml de solución sulfato cúprico, 0,1 M, se observaron los resultados
albúmina, que posteriormente poco a poco se le obtenidos para anotarlos.
agregó 2,36 g de sulfato de amonio y agitando
mientras se le agregaba en pequeñas cantidades para
una solubilidad exitosa, para observar y anotar los 2. DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS
resultados obtenidos. (15%)
En otro tubo de ensayo se agregó 5ml de la solución 1. Coagulación de una proteína.
albúmina y se le añadió 1 ml de ácido Una vez ubicados los 7 tubos de ensayo (y ya
tricloroacético al 50%, que se observaron los enumerados) los cambios y/o resultados fueron
cambios para así anotar aquellos resultados (anexo 1):
obtenidos.
Tubo #1:
El contenido de los 2 anteriores tubos de ensayo, se
Tubo con 5 mL. de clara de huevo en su interior;
trasvasó a tubos de centrifuga para ser llevados a la
Cambia a sustancia sólida de color blanco al
centrífuga durante 10 minutos a 3000 r.p.m., para
insolubilizarse a 82°C. (Empezó su coagulación a
que cuando aquellos tubos de ensayo salieron de la
los 60°C)
centrífuga, se separó el sobrenadante de ambos
tubos por decantación para así desechar este
Tubo #2:
sobrenadante y conservar la sedimentación obtenida
Tubo con 3 mL. de solución albúmina y 2 mL. de
en ambos tubos.
acetona en su interior; se observa una solución color

2
blanca translúcida con precipitados blancos de clara
de huevo.
2. Precipitación de la proteína por iones pesados
Tubo #3: metálicos.
Tubo con 3 mL. de solución albúmina y 1 mL. de 2.1. Tubo de ensayo con 3 mL. de solución
ácido clorhídrico 9M (HCl) en su interior; se albúmina en su interior y 1 mL. de acetato de plomo
observa una solución color blanca translúcida 0.005M (Pb(C2H3O2)2).
similar a la del Tubo #2.
Al agregar el acetato de plomo, se observa una
Tubo #4: solución heterogénea dividida en 2 fases. La fase
Tubo con 3 mL. de solución albúmina y 2 mL. de superior se torna de color blanco y la fase inferior se
cloruro de sodio al 20% (NaCl) en su interior; se queda incolora y/o translúcida (anexo 2).
observa una solución blanca translúcida gelatinosa.
2.2. Una vez agregado 1 mL. de EDTA 0.05M y
Tubo #5: haber agitado, la solución se torna a un color blanco
Tubo con 3 mL. de solución albúmina y 2 mL. de tenue con un agregado de manchas blancas en su
ácido nítrico al 20% (HNO3) en su interior; se interior.
observa una solución blanca translúcida con
precipitados de color blanco.

Tubo #6:
Tubo con 3 mL. de solución albúmina y 4 mL. de
hidróxido de sodio 5 M (NaOH) en su interior; se
observa una solución color amarillo pálido
totalmente solubilizada.

Tubo #7:
Tubo con 3 mL. de solución albúmina en su
interior; tubo de ensayo de control, con color
translúcido.

Anexo 2; Tubo de ensayo (2.1) con visible solución


heterogénea dividida en 2 capas.

3. Insolubilización reversible e irreversible.


3.1. Tubo #1: tubo de ensayo con 5 mL. de solución
albúmina y 2.36 gramos de sulfato de amonio
Anexo 1; Tubos de ensayo (del #1 al #7) con su ((NH₄)₂SO₄); Tubo #2: tubo de ensayo con 5 mL. de
respectivo color en la reacción.
3
solución albúmina y ácido tricloroacético
(C2HCl3O2).

3.2. Una vez sacados los tubos de la centrifugadora,


y ser extraído el sobrenadante dejando solamente el
sedimento con 4 mL. de agua destilada añadidos
previamente, se observa un color blanco amarillento
en el tubo #1 y un color blanco perla en el tubo #2,
después de haber sido agitados (anexo 3).

Anexo 4; Tubo de ensayo con visible división en 3


fases descrito en el paso 4.1.

Anexo 3; Tubos de centrífuga #1 y #2 después de


haber completado el paso 3.2.

4. Reacción xantoproteica.
4.1. Tubo de ensayo con 3 mL. de solución
albúmina y 3 mL. de ácido nítrico al 20% (HNO₃),
llevado a calentamiento, se observa una solución
heterogénea con una división de 3 fases, siendo la
fase superior más grande de color blanco, la fase
media de color amarilla y la fase inferior siendo
translúcida con visible precipitado de color amarillo
(anexo 4).
Anexo 5; Tubo de ensayo con el hidróxido de
4.2. Una vez obtenido el tubo del paso anterior, y amonio añadido descrito en el paso 4.2.
ser agregados los 3 mL. de hidróxido de amonio
(NH₄OH) después de su previo enfriamiento, se
observa una solución de color amarilla mostaza con 5. Reacción de Biuret.
aparentes manchas blancas al ser agitado (anexo 5). Tubo de ensayo con 3 mL. de solución albúmina,
sin cambio aparente en su composición física y
color al agregar hidróxido de sodio 5M (NaOH),
pero al agregar 5 gotas de sulfato cúprico (CuSO4)
se observa un cambio a color morado (anexo 6).
4
orgánicos interactúan con el interior hidrofóbico de
las proteínas, alterando la estructura terciaria y
provocando la desnaturalización y precipitación de
las proteínas [2]; Se añade HCl al tercer tubo. El
color blanquecino inicial cambia a blanco
translúcido debido a la sedimentación. Esto se debe
a que el HCl desnaturaliza las proteínas,
desestabilizando su estructura terciaria y
haciéndolas precipitar más fácilmente para un
ataque enzimático adecuado [3]; Se añadió una
solución de NaCl al 20 % al cuarto tubo. El NaCl
disuelve las proteínas. Por eso la solución se vuelve
incolora. A medida que aumenta la concentración
de sal de la solución de proteína, los contraiones
adicionales recubren con mayor eficacia las
múltiples cargas iónicas de la molécula de proteína,
lo que aumenta la solubilidad de la proteína (mayor
solubilidad con sal) [4]; Cuando se añadió HNO3 al
quinto tubo de ensayo, la solución se vuelve blanca
translúcida con un precipitado. Estos solutos (1)
Anexo 6; Tubo de ensayo al agregar sulfato cúprico. compiten por el agua y (2) interrumpen los enlaces
de hidrógeno o las interacciones electrostáticas, lo
que hace que las moléculas de proteína se agreguen
3. ANÁLISIS DE RESULTADOS (50%) y precipitan [2]; En el sexto tubo se observó que
En primera instancia, se marcaron 7 tubos, en un cuando se añadía NaOH a la albúmina, la solución
primer momento se determinó la temperatura a la se volvía de color amarillo pálido. Los iones OH
cual se determina la coagulación de la proteína, se afectan la cubierta acuosa de la proteína y también
inició la coagulación a 60°C y finalizó a unos afectan la carga de los grupos de la cadena lateral
82°C, el calor provoca la estructura tridimensional de la proteína. Este cambio en la carga superficial
de la proteína y provoca la desnaturalización en de la proteína estabiliza la estructura terciaria y
ellas [1]. Las altas temperaturas aumentan la energía elimina las interacciones electrostáticas que a
cinética de las moléculas, rompiendo y menudo provocan su precipitación [2]; El tubo 7
desnaturalizando la capa acuosa de la proteína. De contenía únicamente la solución de albúmina
manera similar, el aumento de la temperatura utilizada como control.
interrumpe las interacciones débiles, interrumpe la
estructura de la proteína y hace que los interiores
hidrófobos interactúen con los medios acuosos, lo En el punto isoeléctrico, la carga de la proteína es
que da como resultado la agregación y precipitación cero. Sin embargo, las proteínas suelen tener carga
de las proteínas desnaturalizadas [2]; Se añadió negativa o positiva, según el pH de la solución en la
acetona a un segundo tubo que contenía 3 ml de que están contenidas y la combinación de
solución de albúmina. La adición de sustancias aminoácidos cargados que contienen. En las
menos polares como etanol o acetona reduce la soluciones de proteínas, cuando el pH supera el
polaridad del disolvente. Esto reduce el grado de punto isoeléctrico, los grupos cargados
hidratación de los grupos iónicos superficiales de positivamente se desprotonan, por lo que la proteína
las moléculas de proteína, lo que da como resultado se carga negativamente. Cuando el pH desciende
la agregación y la precipitación. Los solventes por debajo del punto isoeléctrico, los grupos
5
ionizables se protonan y la proteína adquiere carga soluto. Es una de las técnicas de purificación de
positiva. Las sales se forman y precipitan cuando proteínas más utilizadas [4]; Entonces el sulfato de
las proteínas cargadas negativamente reaccionan amonio solo ayuda a que la proteína precipite sin
con los cationes (cationes). Las sales insolubles alterarla, y al agregarle agua se puede volver a
también se forman cuando las proteínas cargadas naturalizar. Esta es una reacción reversible.
positivamente reaccionan con los aniones (iones Quedaba una solución blanca que contenía un
negativos) [5]. En reacciones como HCl, HNO3 y precipitado. El TCA, por su efecto ácido, interactúa
NaOH, ésto también suele ocurrir. con la proteína, cadenas para formar una sal
insoluble, que precipita y hace que la reacción sea
irreversible [5].
Para la realización de la segunda parte se utilizó
acetato de plomo, que corresponde a la
precipitación de proteínas con iones de metales La cuarta parte del ejercicio fue la reacción de las
pesados. La adición de acetato de plomo xantoproteínas, y se observó que la solución se
desnaturaliza la proteína ya que afecta la volvía blanca cuando se añadía HNO3, se volvía
solubilidad. Como esta propiedad está relacionada amarilla cuando se calentaba y se volvía más
con la hidratación de sus moléculas, los factores que amarilla cuando se añadía NH3. Esta reacción se
modifican esta propiedad conducen a una basa en la formación de compuestos nitrados
disminución de la solubilidad en agua y la aromáticos amarillos cuando las proteínas se tratan
consiguiente precipitación [6]. Cuando se le agrega con ácido nítrico concentrado. Inicialmente se
EDTA, forma un complejo con el plomo y se forma un precipitado blanco que se vuelve amarillo
observa una solución lechosa con partículas en al calentarlo. Para las proteínas que contienen
suspensión. Aquí se sitúan las albúminas complejas aminoácidos con un grupo benceno, tirosina,
formadas y desnaturalizadas con los iones acetato. fenilalanina y triptófano, la prueba da un resultado
positivo, produciendo un compuesto nitro amarillo
que se vuelve naranja en ambientes fuertemente
La tercera parte fue la insolubilización reversible e alcalinos (formación de ácido pirámico o
irreversible, tomando dos tubos que contenían trinitrofenol). [6] Lo sucedido se muestra en el
albúmina y añadiendo al primer tubo 2,36 g de siguiente esquema de reacción (Figura 1):
NH3SO en pequeñas porciones. Durante esta
operación, se observó que la solución se volvía
blanca y espumosa. Cuando se añadió TCA al otro
tubo, se observó una desnaturalización inmediata de
la proteína en forma de grumos blancos. Después de
centrifugar los tubos durante 10 minutos, retirar el
sobrenadante y añadir agua a cada tubo, se observó
que la proteína volvía a su estado original en el
primer tubo. ). Esto es principalmente el resultado
de la competencia molecular de solvatación entre Figura 1; Reacción xantoproteica.
los iones de sal añadidos y otros solutos. A altas
concentraciones de sal, se solvatan tantos
agregados que la mayor parte del solvente La quinta y última parte del ejercicio es la reacción
disponible es insuficiente para disolver los otros de Biuret. Se observó que la adición de NaOH y
solutos. Por lo tanto, la interacción entre solutos se CuSO4 formaba una solución púrpura translúcida.
vuelve más fuerte que la interacción entre soluto y Al reaccionar con una solución alcalina de sulfato
solvente, lo que resulta en la precipitación del de cobre, el biuret produce un complejo púrpura.
6
Los péptidos y las proteínas reaccionan con los
reactivos de Biuret. Iones de cobre forman
6. BIBLIOGRAFÍA (5%)
complejos de coordinación con N pares de
electrones solitarios presentes en los aminoácidos - Gerald Karp, Biología celular y molecular,
de las proteínas. Lo descrito anteriormente se séptima edición, Editorial McGraw-Hill.2014, PÁG
muestra en la siguiente reacción (Figura 2): 50.
- Jean F. MacFaddin, Pruebas bioquímicas para la
identificación de bacterias de importancia clínica,
Editorial Médica Panamericana, S. A, Madrid
España. 2003, PÁG 185.
- Badui Dergal, Química de los alimentos (2006).
«Capítulo 3.6». En Enrique Quintanar Duarte, ed.
Figura 2; Reacción de Biuret. Química de los alimentos. Biblioteca de la escuela
Técnica Josefa Capdevila Balcarce 96 San Martín
Mendoza: PEARSON Educación. p. Página 164.
5. CONCLUSIONES (15%)
- Lehninger, Albert L.,; Cox, Michael M. (2005).
La desnaturalización de proteínas tiene muchas Lehninger principles of biochemistry (Fourth
causas las cuales pueden, una exposición algún edition edición). W.H. Freeman.
agente desnaturalizante, el cual modifica la
- Williamson, Mike (Michael Paul) (2012). How
estructura de la proteína, la cual se ve afectada por
proteins work. Garland Science.
la generación de excesos de iones hidronios e
hidroxilos por su interacción dipolo - dipolo en un - Watson, James D., 1928-. Molecular biology of the
medio ácido - base. Otra causa de la insolubilidad gene (Seventh edition edición).
de la proteína es debido al pH, ya que ocurre un
acople entre cargas de los metales las cuales son [1] A sarria. Bioquímica nutricional de las
positivas y de la proteína que son negativas en un proteínas. [En línea]
pH neutro, estas cargas al neutralizarse hacen que la http://www.uco.es/master_nutricion/nb/Bueno%20p
proteína se invisibiliza o se desnaturalice. Una ediatr/proteinas.pdf
última causante de la desnaturalización de la [2] Anónimo. Desnaturalización de las proteínas.
proteína, es la temperatura, algo que se realiza muy [En línea]
a menudo en los hogares ya que si observamos la http://www.ehu.es/biomoleculas/proteinas/desnatura
clara del huevo al momento de freírlo, al alcanzar
lizacion.htm
una temperatura aproximadamente de 60° C, su
apariencia, estructura y color cambia de [3] Jose maría Teijón Rivera. Fundamentos de
transparente a blanco, por el calor que se le bioquímica metabólica. Editorial Tebar. Pagina 161.
suministro, volviéndose completamente insoluble
[4] Donald Voet, Judith G. Voet. Bioquímica. Ed.
en agua.
Médica Panamericana, 2006. Páginas 139 y 140
Se identificó mediante la prueba de biuret la
presencia de proteínas en soluciones, la cual genera [5] Silvia Quesada Mora. Manual de experimentos
una coloración morada si en la solución en cuestión de laboratorio para bioquímica. EUNED. Página 27
contiene proteínas al momento de realizar la prueba, [6] Luz Dary Caicedo Bejarano. GUÍA DE
esto se debe al sulfato cúprico, que forma un LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Universidad
complejo, por la unión del cobre con 2 péptidos, Santiago de Cali. Facultad de Ciencias Básicas.
generando así una la dicha coloración morada.
7
Programa de Química Farmacéutica, 2014. Pg.
46-52.

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