PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE VITAMINA D EN AFA-640

LECHE FORTIFICADA Y LECHE EN POLVO POR

MÉTODO AOAC 981.17 Versión 01

Laboratorios LEFMELK S. A Pag 1 de

OBJETIVO:
Elaborar un protocolo de validación para la determinación de vitamina D en leche
fortificada y leche en polvo por el método AOAC 981.17.

1. TITULO.
VALIDACIÓN DEL MÉTODO AOAC 981.17
PARA DETERMINACIÓN DE VITAMINA D EN LECHE
FORTIFICADA Y LECHE EN POLVO.

2. AUTOR/FECHA/ Laboratorios LEFMELK S. A

INSTITUCIÓN.
3. INTRODUCCIÓN. El método (AOAC 981.17) para la determinación de vitamina D en
leche fortificada y leche en polvo por cromatografía liquida, se
fundamenta en la saponificación y extracción de las muestras
utilizando una solución alcohólica de Hidróxido de potasio seguida
de una extracción del solvente.
La determinación de vitamina D en una solución del extracto de la
muestra se realiza mediante HPLC de fase normal semipreparativa
seguida por HPLC de fase reversa analítica. La cromatografía se
monitorea por UV y se logra la identificación de los picos de acuerdo
con los tiempos de retención y la cuantificación se realiza por el
método de estándar interno utilizando las áreas o las alturas de los
picos.
La muestra se saponifica y extracta y la vitamina D se separa de las
impurezas mediante una limpieza semi-preparativa usando HPLC
en fase normal. Se recolecta la fracción de vitamina D proveniente
de la columna de limpieza y se determina el contenido de vitamina
D por HPLC en fase inversa con detección UV. La vitamina D 2 se
emplea como patrón interno en la determinación de la vitamina D 3 y
viceversa.

4. OBJETIVO Objetivo general:

GENERAL Y Validar el método AOAC 981.17 para la determinación de vitamina
ESPECÍFICOS. D en leche fortificada y leche en polvo.
Objetivos específicos:

 Desarrollar un protocolo de validación, teniendo como base

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los parámetros establecidos para el método AOAC 981.17.

 Conocer el fundamento físico y químico del método AOAC
981.17
 Desarrollar la fase experimental teniendo en cuenta el
acondicionamiento del laboratorio, funcionamiento de
equipos y disposición de reactivos
 Analizar cada uno de los resultados obtenidos en la fase
experimental
 Documentar los resultados obtenidos en la fase experimental.
 Registrar los resultados obtenidos en la fase de
experimentación en un informe de validación.
 Concluir acerca de la validación del método AOAC 981.17
5. PROBLEMA. El laboratorio LEFMELK no cuenta con un método validado para la
(PROPÓSITO) determinación de vitamina D en leche fortificada y leche en polvo
Motivo por el cual se opta por realizar la validación de tal método
( AOAC 981.17) con la finalidad de conocer la magnitud de tal
desviación y verificar con exactitud si en los resultados obtenidos se
han tenido en cuenta los errores que pudieron presentarse a lo largo
del análisis.
6. JUSTIFICACIÓN. La vitamina D tiene un papel esencial en favorecer la adsorción del
Calcio, es por ello que algunos productos lácteos son fortificados
con esta vitamina, pero esta debe cumplir un límite mínimo
establecido normativamente (NTC 1036).
Debido a lo anterior, es de vital importancia para el laboratorio
LEFMELK validar el método AOAC 981.17 pues es un análisis que
presenta una gran demanda en la industria alimentaria puesto que
esta permite efectuar el control respecto a la cantidad de vitamina D
adicionada, ya que la adición de esto debe ser de acuerdo con las
concentraciones mínimas permitidas, según lo establecido en la
normativa.
7. MARCO TEÓRICO. PRINCIPIO:

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA
la cromatografía líquida es una técnica que permite separar
físicamente y cuantificar los distintos componentes de una solución.
En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija
que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil denominada fase
móvil que fluye permanente durante el análisis, y que en este caso
es un líquido. Las sustancias que permanecen más tiempo libre en
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la fase móvil avanzan más rápidamente con el fluir de la misma y

las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas
avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir
8. GLOSARIO.

9. HIPÓTESIS.

10. MATERIALES Y EQUIPOS:

MÉTODOS.  Cromatógrafo de líquidos con detector UV.
 Columna de limpieza.
 Columna analítica.
REACTIVOS:
 n-Hexano
 Solución antioxidante:0,1% Hidroxitolueno butilado (BHT) en
n-hexano.
 Solución estándar de vitamina D.
 Solución estándar de idoneidad del sistema.

MUESTRA: leche fortificada y leche en polvo.

MÉTODO:
AOAC Official Method 981.17
Vitamin D in Fortified Milk and Milkpowder
Liquid Chromatographic Method.

MODELO DE CALCULO:

11. RESULTADOS
ESPERADOS.

12. CRONOGRAMA/
RECURSOS.

13. BIBLIOGRAFÍA.  Bravo C, Daniel F. Cuantificación de Vitamina D3

(colecalciferol) y D2 (ergocalciferol) por Cromatografía
Líquida de Alta Resolución (HPLC). Zamorano: Escuela
Agricola Panamericana, 2016; 2006.
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 Roseland JM, Phillips KM, Patterson KY, Pehrsson PR,

Taylor CL. Vitamin D in Foods. En: Vitamin D. Elsevier; 2018.
p. 41–77.
 Rodríguez Huertas Jesús, Rodríguez Lara Avilene, González
Acevedo Olivia, Mesa María Dolores. Milk and dairy products
as vehicle for calcium and vitamin D: role of calcium enriched
milks. Nutr. Hosp.  [Internet]. 2019  Ago ; 36( 4 ): 962-973.
Disponible en: http://scielo.isciii.es/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0212-16112019000400030&lng=es.
Epub 17-Feb-2020.  https://dx.doi.org/10.20960/nh.02570
 Navarro Valverde C, , Quesada Gómez J. M. Vitamina D,
determinante de la salud ósea y extra ósea; importancia de
su suplementación en la leche y derivados. Nutrición
Hospitalaria [Internet]. 2015;31(2):18-25. Recuperado de:
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=309238518003
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