Donat el caràcter i la finalitat exclusivament docent i eminentment il·lustrativa

de les explicacions a classe d'aquesta presentació, l’autor s’acull a l’article 32

de la Llei de propietat intel·lectual vigent respecte de l'ús parcial d'obres
alienes com ara imatges, gràfics o altre material contingudes en les diferents
diapositives

Facultat de Biologia
 BIOPRESERVATION.

EMPIRICAL USE OF MICROORGANISMS AND/OR THEIR NATURAL

PRODUCTS FOR THE PRESERVATION OF FOODS.
Biopreservación: Uso empirico de los organismos o sus productos
naturales para la preservación de productos.
algunos de ls que vamos a
hablar ya han aparecido en
la presentación 1.

se piensa que hasta los

ultimos 100-150 años,
beber agua era jodido asi
que l agente apenas bebía
agua. Entonces, la gente
bebía poco y bebia bebidas
alcoholicas para ingerir
agua. Mezclaban estas
bebidas con alcohol para
asi beber agua de forma
segura.

LAB (Lactic Acid Bacteria)
El grupo bacteriano por autonomacia para la cosnervación de
alimentos. Son conocidas como LAB. Aqui tenemos lagunas
características.
Son anaerobias aerotolerantes, pero esto es muy importante porque
son el unico grupo viviente que lo son. Esto es muy imporante
porque hay patogenos que son anaerobios estrictos, por tantoo si
añadisos oxigeno, moriran lo spatogenos pero estas que son buenas
vivirán.

Bacterias Gram-positivas, inmóviles y no esporuladas. Los humanos y animales tienen estas

bacterias en los tractos intestinales.
Son ANAEROBIAS AEROTOLERANTES También las encontramos en vegetales.
Se han adaptado muy bien a vivir con seres
superiores. Han perdido mucha de su
-Hábitats ricos en azúcares. Metabolismo fermentativo. capacidad biosintetica porque se han
adaptado a vivir en ambiente smuy ricos en
todos. Imaginamos nuestro intestino como un
-Capacidad biosintética limitada. supermercado, con abundanci ay variedad d
enutrientes.

-Complejos requerimientos nutritivos : aminoácidos, vitaminas nucleótidos, etc.

Producción de láctico como principal o único producto de su metabolismo fermentativo

 FERMENTACIÓN / RESPIRACIÓN

Según Louis Pasteur: vida sin oxigeno.

Obtención de E a partir de materia

orgánica sin aceptor externo de e-.

Oxido-reducción BALANCEADO

“SISTEMA CERRADO”

Producto final se excreta.

La fermentación se basa en el uso de glucosa para l aobtención de

energía en forma de movimiento de protones y productos
secundarios. Se hace sin la presencia de oxigeno obviamente.
La fermentación te lleva a piruvato (des de la glucosa) pero has
producido un poder reductor que vas a volver a meter. Y de acido
piruvatico a lactico, es lo que hacen las LAB de forma masiva.
A veces también se producen compuestos secundarios como el
diacetilo, acetina, butanediol... que facilitan la presrvacion por su
capacidad antimicrobiana.
A veces incluso se crea hasta peroxido de hidrogeno que se hace
mediante la combinación con oxigeno(no quiere decir que usen
oxigeno para su metabolismo).
Un ácido lo que hace es desastabilizar el gradietne
de protones hasta llegar a bloquear la celula, esto
es una ilustración de ello.
Lo que tienen super bueno estas bacterias lacticas,
ademas de prodcuir estos productos tan buenos
(como etanol y tal), son capaces de producir
moleculas que de forma altament especifica inhiben
el crecimiento microbiano. Diapo siguiente.

euterina inhibe el crecimiento de algunas bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, junto con las
levaduras, los mohos y los protozoos.5​ L. reuteri pueden secretar cantidades suficientes de
reuterina para inhibir el crecimiento de los organismos perjudiciales en el intestino, sin matar las
bacterias beneficiosas. L. reuteri permite quitar los organismos invasores mientras se mantiene
intacta la flora intestinal normal.6​
euterina es soluble en agua, eficaz en un amplio rango de pH, resistente a las enzimas proteolíticas
y lipolíticas, y ha sido estudiado como un conservante de alimentos o unauxiliar como agente
terapéutico
+ reuterin
+ bacteriocins
Aqui vemos los compuestos de los que hablabamos, la reuterina (muy
potente pero con poco uso) y bacteriocinas.
La reuterina es un metabolito secundario (se produce en fase
estacionaria de crecimiento, cuando ya ha crecido l abacteria mucho),
creada por algunas bacterias como L. renteci (otras tb), cuando se
encuentra creciendo en ciertos ratios de glucosa/glicerol (o
gliceraldeido). Se han enumerado numerosos procesos como el que
hay en la siguiente diapo. En ella se añade en un acadena de
alimentos, un baño en reuterina para que sea más resistente,
se ha comprobado que da una resistencia muy imporante.
Donat el caràcter i la finalitat exclusivament docent i eminentment il·lustrativa
de les explicacions a classe d'aquesta presentació, l’autor s’acull a l’article 32
de la Llei de propietat intel·lectual vigent respecte de l'ús parcial d'obres
alienes com ara imatges, gràfics o altre material contingudes en les diferents
diapositives

Facultat de Biologia
Las bacteriocinas pueden ser producidas como una immunidad
innata par ala comida. Pueden tener un valor importante para
dar inmunidad a los alimentos sin causar ningun problema al
ser humano. Vemos aqui una linea temporal sobre las
bacteriocinas, donde se describieron, descubrieron... Todo
cabio cuando se descubrio la nisina tenia una capacidad muy
alta de inhibir el crecimiento bacteriano y fue el primero que se
planteó purificarlo y usarlo en la industria como conservador. Y
en el año 1953 la nisina fue comercializada. El resto de paises
paarte de GRAn bretaña eran reacios. Tardaron hasta el 83
hasta aprobar su uso en Europa. Hoy en dia basicamente toda
empresa usa nisina. Fue la primera bactericida que se ideo un
proceso de purificacion para su uso en alimentación. Tiene un
codigo tipo E- que esta en muchisimos alimentos.
Fue la primera, pero también la unica a dia de hoy, se explicara
porque.
 Las bacteriocinas son peptidos o proteinas antimicrobianas sintetizadas ribosomalmente. Eso es
importante porque puedes dar esta capacidad de sintesis a otros organismos. Al principio se
hablaba de tres tipos de bacteriocinas, pero ahora y ano. Las bacterolisinas ya no se consideran
como tal, porque son proteinas muy grandes de muchos daltos y ya se salen de la definicion de
BACTERIOCINS bacteriocinas (peptidos muy pequeños) de entre 3 y 15 daltons.

Ribosomally synthesized antimicrobial peptides or proteins

L adiferencia entre clase 1 y 2 es que l aclase 1 incluye la lantionina, que es el resultado de una serie de cambios
postraduccionales. (en la siguiente diapo se ve la sintesis de una bacteriocina).
Se dan muchas modificaciones postraducionales
que acaban formando esta estructura conocida
como la lantionina. Las bacteriocidas que tienen
este grupo llamado lantionina son las que
prtenecen al grupo 1. Por ejemplo la nisina es dle
grupo uno por contener este grupo molecular.
Todas ellas trabajan desestabilizando las
envolturas de las bacterias y celulas. Las de
clase 1 lo que hacen es depolarizar la
membrana, las de clase 2 también actuan en
la membrana pero ejerciendo un efecto en la
sintesis de la mureina, acaban provocando
una alteracion de las envueltas celulares que
acabara jodiendo a la celula. Esto es muy
importante para las bacteriocidas, no son
bacteriostaticos sino bacteriocidas, acaban
con las celulas. Y además son proteolíticos,
acaban destrozando la celula que atacan.
Esto es interesante proque lo que quieren las
celulas no e ssolo matar sino ademas abrir la
celula para poder utilizar su contenido.
Cuando muchas bacterias luchan por una
comida, si una mata a las demas, saldra a
mas comida y ademas se podra comer a las
demas (ejemplo del profesor comiendo
alumnos).
Bacteriocins in food preservation:
Las bacteriocinas protegen el alimento hasta que llegan al estomago, ahi se acabo,
esto es PERFECTO, porque no matan nuestra flora. Lo contrario son los
1- Are GRAS substances antibioticos que cuando nos los tomamos dañan nuestra flora. Son en general
altamente resistentes (al ser peptidos y pequeños) a pH's y temperaturas, tipico d
emoleculas pequeñas.

2- Are not active and non toxic to eukaryotic cells

3- become inactivated by digestive proteases

Son muy buenas porque: no solamente estan codificadas en genes sino que muchas
de ellas se encuentran de forma natural codificadas en genes que se encuetnran
4- pH and heat tolerant localizados en elementos trasmisibles y esto ya es el novamas. Esto es genial porque
no sfacilita el trabajo para su obtención.

5- antimicrobial against many food-borne pathogens

6- bactericidal mode of action

7- genetically encoded in transmissible elements

Imaginemos que una bacteria no sitneresa
mucho (casa tarradellas) pero queremos una
propiedad que no tenemos. Lo bueno es que
la capacidad de crear bacteriocina esta a
veces en elementos mobiles por lo qu
epodresos obtener esta caracterítsica y
traspasarla a nuestra bacteria de manera que
tendremos la misma bacteria con la propiedad
que queremos. No hara falta ni hacer trabajo
genico, solamente ponerlas juntas y esperar a
que ocurra, se mira por geles si tiene este
peptido y ale, misma bacteria con nueva
propiedad.
Supplementing food with bacteriocins

En las proximas diapositivas se explica cada uno de los

tres puntos, tener en cuenta

- ex situ produced bacteriocin (nisin, E234)

- bacteriocin enriched media : ALTATM

MICROGARDTM
lactinin3147
se ha planteado ponerlos en envoltorios de forma inmobilizada.
- immobilized
POr ejemplo en procesos que necesitan una bacteria para fermentar, si esta bacteria al mismo tiempo
produce una bacteriocina, esto ya es la repera porque te ahorras tener que producir i añadir nada. esto
es l aproducción in situ.
- in situ production
Es muy costoso por eso no se hace tanto. Europa tardo 30 años en aceptar el uso de la nisina, porque? Porque tienes que idear un proceso que es 100%
seguro para el consumo humano, y una purificacion de una nisina es una purificacion de un peptido y esto es muy dificil, vas a utilizar eluyentes, matrices...
productos toxicos para el consumo.
Entones tienes que idear un proceso de creacion del peptido masivo, de purificacion rapida en grandes cantidades y saber eliminar todos los productos
quimicos que hayas podido utilizar. POr ej. si has usado metanol, hasta que demuestres que en el producto final no hay, no te van a dejar venderlo. Por esta
razon, despues de tantos años solo tenemos la lisina para la utilización insitu.
Aunque muy eficientes, son caras de obtener la bacteriocina, por lo que no se utilizan tanto esceptuando la nisina.

Hemos hablado de que solo la nisina se usa insitu, peroooooooooo, se han comercializado diferentes productos que son estractos celulares. tu creces las
bacterias y crearan bacteriocidas y lo añades tal cual a l acomida. Solo necesitas que sea GRAS, que para hacer el cultivo bacteriano se usen productos Food
grade, nada de quimicos, solo alimentos para el crecimiento de la bacteria. Per una vez crecida, puedes añadir estas bacterias a otros laimentos para
conservarlos y a veces, no solo esto no se esconde, sino que se vende como algo mejor pq le estas añadiendo propiedades.
 Género Listeria (Low G+C Gram-positive bacteria)

Bacilos cortos, aerobios o facultativos.

Filogenéticamente relacionado con Lactobacillus.
Produce ácido láctico pero no gas (homofermentativa)

Listeria monocytogenes causa listeriosis, infección

transmitida por los alimentos (queso blandos)

Elevado porcentage de mortalidad (> 20 %):

- Fetos (causa de abortos)
- recien nacidos

Esta muy parecida a las bacterias lacticas,

esto es una putada para los humanos
porque puede vivir como una bacteria
lactica. causa listeriosis. Tiene mucha
capacidad de superar barreras, intestinales,
hematoencefalicas, de placenta... esto lo
hace muy peligrosa.
esta bacteria como llega entra en celulas
para amagarase de las macrofagos. Esta
celula tb es verdad que se puede
transformar en un fagosoma y posterior
lisosoma que mataria a la celula, pero esta
es tan cabrona que puede salir del lisosoma
también.
El vector tradicional de listeriosis eran los quesos,
ahora ya no. Ahora donde mas se dan es en
productos listos para comer, como carnes o
pescados (incluso la tipica ensalada cesar).
 Aqui se comprueba la imobilización de bactericidas sobre el plastico
para ver su efecto en la comida que cubre. Se plantea si envolverlo
puede proteger frente al crecimiento de listeria.

Aqui no se vende envuelto

en plastico, pero algunos
paises del norte las verduras
y frutas se envuelten en
plastico y se creia que se
podi autilizar esta tecnica.
Vemos que a 4 grados hay
una disminucion completa.
La temperatura no afecta la
capacidad de la bacteriocina,
pero cuando hicieron el
al cabo de dos horas
experimetno en PBS, vieron
hay 0 listeria.
que la bacteriocina tenia
ningun efecto. No explicaron
porque.
Sube muchisimo, hay que tener en cuenta
que es logaritmico, significa que
muerenmuchas.
 Esto como ya dijimos es lo ideal, al mismo tiempo que utilizas tu bacteria para fermentar, esta
te produce bactericidas.
PEEEEROOOO, esto es muy dificil porque las marcas son muy reaceas a cambiar su cepa
porque produce unas propiedades organolepticas unicas que podrian cambiar si añadimos la
IN SITU capacidad par afomar bactericidas.
Estas bacterias se llaman bacteriocigenicas.
Trabajo que demuestra como la acdemia
muchas veces se distancia de la industria. A
veces, los biotecnologos que trabajan en
laboratorio hacen mucho trabajo que no sirve
para la industria, y esto se esta solucionando
porque sino la industria es muy reacea a hacer
conexiones con la acdemia. Este es un ejemplo
de este error.

Habia un grupo de personas que buscaban una

cepa de lactobacilus sakei (muy utilizadas en
fermentaciones en embutidos) que formara
bacteriocinas. Esta cepa produce un descenso
del pH muy rapido por lo que es muy buena en
la industria carnica.
Encontraron una cepa que se llamaba CTC494
que era muy buena en cuanto a la producción
de bacteriocinas. Además se vio que funcionaba
muy bien como vemos en las graficas (se
prueban condiciones y se ve lo bien que
funciona incluso en diferentes pH y medios).
Intentaron vender esto a las industrias carnicas
PEEEROOO las pruebas se habian echo a 35
grados y con medio de cultivo y en la indsutra es
a 20 i algo y en un tanque. Cuando probaron la
bacteria en un medio de cultivo de industria
(simulando carne i tal) y vieron que las cosas
cambiaban, crecimiento no tan bueno, tapoco
tanta cantidad de lactico y la bacteriocina baja.
Admeas en la industria carnica se pone mucha
sal, y cuando se añade, todos los parametros
disminuyen. También se añaden nitratos (par
aproducir el proceso de curado) y la cantidad de
bacteriocina es aun menor y finalmente otros
productos que ya acaban con el buen
rendimiento de esta bacteria.
Este es un gran ejemplo del problema de querer
aplicar lo dle lab a la industria.
Aunque muchas veces falla, si que hay
ejemplos de fabricación in situ de bacteriocinas.
Factores que influencian la eficacia
Aqui es un ejemplo de como encontrar bacterias formadoras de bactericinas. Para encontrarlas lo más facil es ir al material fecal y superficie de plantas porqu ees donde mas
bacterias lacticas hay. se hicieron recogidas y se aislaron las bacterias lacticas porque es bastante facil por sus características. Aislaron 150 cepas de lacticas. Como ver que
son productoras de bacteriocinas? como vemos en la imagen, haces crecer tu bacteria en una placa de petri, siembras tus bacterias lacticas, que si tienen bactericinas van a
secretarlas y veras parches. Para detectar los parches añades un overlay. Asi que el paso 1 seria crecer bacterias, 2 añadir overlay que tiene agar con una bacteria target
(lysteria) y veremos los alos si se producen bactericinas.
Pruebas a diferentes temperaturas de manera que pudieron dar esta bacteria para una empresa para formar bactericidas
insitu. Al final hicieron pruebas alli y no las usaron, porque ambas cepas (CL19 y V4.1) ejercia un efecto protector pero daba
un color y consistencia al pescado que no gustaba (era una empresa de pescado). Asi que no se utilizó.
Pero si que utilizaron estractos de estas bacterias para limpiar las instalaciones.
Se propuso a la empresa que pagara para identificar que
gen era el de la bacteria. No dio l apasta pero lo hicieron
igualmente.
Para ello se podrian hacer knock outs, es la genetica
clasica, la aproximación tipica que se hace. Se muta y se
ve que pasa hasta que veamos una que no forma
bactericina. PEROOO es muy facil de hacer en
organismos modelo, pero en cepas o bacterias menos
conocidas es mas dificil porque no dispones de vectores
de clonaje, transposones.... pero si no la conoces, es
mas dificil.

Entonces lo que se hace es la genetieca reversa, buscar

el producto con laintencion de encontrar el gen.
 Ejemplo de como la hizo esta gente.
Querian identificar el gen, pero claro, no
tenian ni herramientas ni conocimiento del
organismo.
En esto caso hicieron genetica reversa, lo
primero que hicieron fue identificar el gen.
Purificaron la proteina con cromatografias
(algo muy dificil para todos, pero hay
especialistas que les resulta sencillo), la
identificaron. Entonces tienes un
bioensayo perfecto par aver donde se
encuentra la molecula de interes (usas las
purificaciones y las pones frente a lysteria,
la que mate es la bactericina).
En la tabla vemos que pasos hicieron
(supernatante, precipitacion...).
siempre eran capaces de detectar en cada
grupo de eluciones donde se encontraba
la molecula con capacidad inhibitoria.
Pudieron coger un peptido, y conseguir la
secuencia aminoacidica. Asi pudieron
hacer la traduccion reversa a acidos
nucleicos (teniendo en cuenta la
degeneracion del codigo) y por metodos
informaticos encontrar donde esta esto en
el genoma de la bacteria.

Entonces una vez conocido, se pudo aislar este gen y

analizarlo par asu clonaje.
Generaron cambios en el peptido de la nisina. Entonces, produjeron las proteinas yver su efecto. Lo
primero que hicieron fue demostrar que todos los mutantes se podian producir en la bacteria con una
cantidad y rendimiento parecido. Porque por muy buena que sea el peptido si no se puede hacer bien
no sirve de nada.
Vieron como había un par de nisinas modificadas q eran efectiva frente a gram-.
Vemos como las mutaciones N20K y M21K, dan resistencia a cepas
que el wild type no .
El fallo de este articulo es usar algunas cepas que son del aboratorio, y
no por ejemplo Ecolis naturales. Eso es una cagad aporque los
resultados sirven de poco en aplicacion.
La bactericinas son muy populares y muy interesantes pero la
seguridad en alimentacion no es la unica aplicacion. Por ejemplo, la
calidad de comida tb puede ser mejorada con bactericinas.
RESISTENCIAS
Por ejemplo se han ideado un guante con bactericina que se pone
en la hubre de la vaca para que no aparezca stafilococos aureus en
la ubre. Esto es un gran mecanismo praa evitar infecciones. Vemos
esto en la figura c.

Hay que recordar que una cosa

buena de las bactericinas es que
son degradadas por proteasas,
por ello cuando las ingerimos no
hay problema porque se desacen.
esto por otra parte disminuye su
uso en medicina humana porque
no se pued etomar. La aplicacion
que se le quiere dar es contra la
carees, dar un tipo xupaxup con
bactericinas que matarian
bacterias de la boca.
With High Hydrostatic Pressure
With Pulse Electric Fields