TPMM Manual de

TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS
MICROBIOLÓGICOS
Y MOLECULARES
Manual de prácticas
Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos y Moleculares
Práctica No. 1
Preparaciones microscópicas en fresco
Objetivo:
Realizar preparaciones en fresco a partir de cada una de las muestras
proporcionadas y recolectadas con el fin de observar al microscopio los diferentes
tipos de microorganismos presentes en ellas.
Introducción:
Los microorganismos tienen la capacidad de adaptarse en medios ambientes con
condiciones adversas como lo pueden ser la temperatura, el pH, la humedad, fuente
de carbono limitada, etc. Sin embargo, en medios como los alimentos, frutas y
estanques de agua, encuentran las condiciones propicias para su desarrollo y su
crecimiento se verá favorecido en tiempos relativamente cortos, trayendo consigo
el deterioro de estos alimentos. Los microorganismos responsables del deterioro de
los alimentos y aquellos que de manera natural forman parte de ellos (como en la
leche) pueden ser observados fácilmente al microscopio ayudándose para este fin
de diferentes técnicas utilizadas en microbiología.
Fundamento
El microscopio óptico es el instrumento que se emplea con mayor frecuencia en los
laboratorios de microbiología, debido a que proporciona una imagen amplificada o
agrandada del objeto en estudio, permitiendo observar organismos y estructuras
invisibles a simple vista. Son capaces de lograr una amplificación de hasta miles
veces el tamaño del objeto.
Los microscopios ópticos emplean lentes diseñados para desviar y enfocar los rayos
de luz, produciendo imágenes aumentadas de objetos pequeños. Presenta lentes
en el condensador, en los objetivos y en los oculares. El lente del condensador
enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la muestra. Los rayos de luz
que chocan con los objetos (microorganismos) que hay en la muestra y se “curvan”,
son conducidos al lente del objetivo para formar una imagen aumentada del objeto.
La lente del ocular magnifica más esta imagen primaria. El aumento total se calcula
multiplicando los aumentos del objetivo y del ocular.
La resolución de un microscopio óptico se determina por la apertura numérica de su

sistema de lentes y la longitud de onda de la luz empleada; la resolución máxima es
de aproximadamente 0.2 m. El microscopio ordinario se denomina de campo claro
porque forma una imagen oscura frente a un fondo claro.
Procedimiento
Preparaciones frescas entre portaobjetos y cubreobjetos
1. Flamee una de las caras de un portaobjetos (fig. 1) y colóquelo en la mesa
con la cara flameada hacia arriba.
2. Esterilice el asa de platino a la flama del mechero (fig. 2).
1
Figura 1 Figura 2
3. Retire el tapón del tubo que tiene la muestra, utilice para ello, el dedo
meñique (fig. 3), flamee la boca del tubo (fig. 4), tome la muestra con el asa,
flamee nuevamente la boca del tubo y tápelo. Coloque el tubo en la gradilla
y la asada de muestra en la cara flameada del portaobjetos (fig. 5), esterilice
nuevamente el asa de platino y déjela en la mesa.
Figura 3 Figura 4
Figura 5
4. Para cubrir la preparación ponga en contacto el borde del cubreobjetos con

la gota de muestra y déjelo caer por su propio peso, para evitar la formación
de burbujas de aire. Puede sellar con vaselina para evitar la evaporación.
2
5. Proceda en igual forma para las siguientes muestras; pero si se trata de una
muestra en medio sólido, coloque previamente una gota de agua en el
portaobjetos y con ella emulsione la muestra. Observe todas las
preparaciones con objetivos secos (10x y 40x). Dibuje los campos
observados con el objetivo de 40x.
Preparaciones en fresco por el método de la gota pendiente
1. Aplique un poco de vaselina alrededor de la depresión de un portaobjetos

excavado (fig. 6), y con la ayuda del asa coloque en condiciones de
esterilidad, una gota del cultivo en el centro de un cubreobjetos limpio (fig. 7).
Portaobjetos
excavado
Excavación
Vaselina Gotita del

Cubreobjetos cultivo
Figura 6 Figura 7
2. Coloque el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando de que la

excavación quede sobre la gota de cultivo. Haga presión sobre los bordes
para que la vaselina selle el cubreobjetos con el portaobjetos.
3. Invierta cuidadosamente el portaobjetos de manera que el cubreobjetos

quede hacia arriba y la gota de cultivo quede colgada en el centro de la
excavación del portaobjetos cuidando de que la gota no se caiga, lo que es
fácil de lograr si se trabaja con gotas pequeñas (fig. 8).
Fig. 8
4. Para hacer la observación se sugiere enfocar primero el borde de la gota con

objetivos secos y poca iluminación para observar las bacterias y su posible
movilidad. Dibuje los campos observados con el objetivo de 40x.
Disposición de Residuos:
Las muestras se tiran al drenaje después de esterilizarse en autoclave.
3
Práctica No. 2
Preparaciones microscópicas secas, fijas y teñidas.
Tinción simple
Objetivo
Conocer las diferentes técnicas de tinción microbiológicas y las ventajas de cada
una de ellas.
Realizar preparaciones secas de diferentes microorganismos, fijarlas y teñirlas,
aplicando técnicas de tinción simple para observar la morfología y agrupación de
los microorganismos.
Introducción
Con el microscopio de campo claro, las muestras se visualizan gracias a las
diferencias de contraste entre ellas y el medio que las rodea; debido a que las
células absorben o dispersan la luz en diferentes grados.
Muchas células son difíciles de observar debido a la falta de contraste. En los
microorganismos pigmentados su color añade contraste y mejora la visualización
de las células, pero como la mayoría de los microorganismos son incoloros, se
suelen fijar y teñir antes de su observación.
Fundamento
Los colorantes son sales en las que uno de sus iones tiene color y cada tipo de
colorante tiene afinidad por determinados componentes celulares.
En la mayoría de los colorantes el color reside en el ion positivo (colorantes básicos
o catiónicos) y se combinan fuertemente con constituyentes celulares cargados
negativamente, como la pared celular. Como en el caso del azul de metileno, cuya
sal es el cloruro de azul de metileno, que se disocia en ión cloruro cargado
negativamente y azul de metileno, ión cargado positivamente, siendo éste el que
tiene color.
Los colorantes ácidos o aniónicos son aquellos en los que el color reside en el ión
negativo. Los colorantes tienen diferencias en el grado o proporción con que tiñen
los microorganismos y así los menos reactivos requieren de más tiempo de contacto
con la célula para teñirla y los más reactivos de menos tiempo.
Después de depositar adecuadamente la muestra en un portaobjetos limpio y

desengrasado, se deja secar al aire y enseguida se procede a la fijación, proceso
necesario para evitar que las muestras sufran alteraciones en las operaciones
siguientes durante la tinción. A esta preparación se le conoce como Frotis.
Se conocen diferentes tipos de fijadores, entre los cuales están:

- Los físicos como el calor, el frío, y la desecación.
- Los químicos como el alcohol, el éter, el formol, etc.
Una preparación seca y fijada (frotis) está lista para el proceso de tinción. Si la
tinción se realiza empleando un solo colorante se denomina tinción simple, y si se
lleva a cabo aplicando dos o más colorantes se le llama tinción diferencial.
4
Existen dos tipos de tinciones simples:
- La tinción directa, donde se tiñe la pared del microorganismo resaltando la

célula completa y el campo se observa claro.
- La tinción negativa o indirecta, donde se tiñe el campo y los microorganismos

se observan como zonas claras.
Las cápsulas bacterianas no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros
componentes celulares, por ese motivo se utiliza el método de tinción negativa para
su observación. Se emplea tinta china (suspensión de partículas de carbono) o
nigrosina (colorante ácido), que constituyen una suspensión coloidal que no puede
penetrar a través de la cápsula, sino que precipita alrededor de ella; de este modo,
esta estructura se ve como un halo refringente alrededor de los microorganismos
sobre un fondo oscuro o negro.
Procedimiento
Realización de un frotis:
1. Flamee una de las caras de un portaobjetos y colóquelo en la mesa con la
cara flameada hacia arriba.
2. Esterilice el asa de platino, tome una asada de la muestra y extiéndala
suavemente en una superficie aproximada de 0.5 * 2.0 cm (fig. 9).
- Si se trabaja con una muestra sólida, coloque previamente una gota de agua
desmineralizada sobre el portaobjetos, emulsione la asada de la muestra con
la gota y extienda.
3. Deje secar al aire el portaobjetos.
4. Fije cada una de las preparaciones, pasándolas 5 o 6 veces rápidamente por
la parte superior de la flama del mechero (fig. 10).
- Al fijar, el calor no debe de resultar muy intenso, lo que se puede lograr
comprobando el calor del portaobjetos, en el dorso de la mano, que no ha de
dar la sensación de quemadura.
Fig. 9 Fig. 10
Tinción directa:
1. Coloque el frotis sobre dos varillas de vidrio paralelas en un recipiente
adecuado (Fig. 11). Puede unir las varillas por los extremos con pedazos de
manguera cortos.
5
Figura 11
2. Con la ayuda de un gotero, cubra el frotis con solución colorante. Si se

emplea azul de metileno déjelo actuar por un minuto (tiempo de contacto), si
se emplea cristal violeta déjelo actuar por 30 segundos.
3. Lave con agua desmineralizada el frotis teñido usando una pizeta o un frasco
gotero.
4. Seque la preparación con papel filtro sin llegar a frotarla, únicamente
presiónela suavemente.
5. Observe la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión (100x) y
dibuje los campos observados. Utilice aceite de inmersión.
Tinción indirecta:
1. Sobre un extremo de la cara de un portaobjetos coloque con el asa, dos gotas
de cultivo.
2. Añada una gota pequeña de solución de tinta china o nigrosina y mezcle con
las gotas del cultivo.
3. Extienda la mezcla con el borde de otro portaobjetos formando una capa fina
(fig 12).
Muestra con colorante
Figura 12
4. Deje secar al aire.

5. Observe la preparación con el objetivo de 100x. Utilice aceite de inmersión
Los residuos de la tinción se depositan en el contenedor de Colorantes y Lugol.
Los residuos de las muestras son regresados a la Auxiliaría del Laboratorio.
Los frotis se lavan y se desengrasan con alcohol.
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Práctica No. 3
Preparaciones microscópicas secas, fijas y teñidas.
Tinción diferencial
Objetivo
Conocer las diferentes técnicas de tinción microbiológicas y las ventajas de cada
una de ellas.
Realizar frotis de diferentes microorganismos y teñirlos aplicando técnicas de tinción
diferenciales para poner en evidencia diferentes estructuras celulares o diferencias
tintoriales entre las bacterias.
Introducción
La tinción diferencial permite distinguir entre diferentes tipos de bacterias y también
poner de manifiesto ciertas estructuras de la morfología bacteriana.
En estas tinciones se emplean más de un colorante y depende de las diferencias
físicas y químicas de los microorganismos; se conocen varias técnicas con distintos
fines, siendo las más comunes la tinción de Gram, tinción de esporas y tinción de
cápsulas.
Fundamento
Tinción de Gram
Esta técnica tiene una importancia especial, ya que además de dar información
acerca de la morfología y agrupación de las bacterias, permite distinguir entre
aquellas que tienen una morfología similar, de acuerdo a las diferentes reacciones
que éstas presentan frente al procedimiento de tinción; las cuales se atribuyen a la
composición química de las capas superficiales de la bacteria o de su pared celular,
obteniéndose así una clasificación artificial de las bacterias en GramPositivas,
aquellas que resultan capaces de retener el complejo formado por el cristal violeta
(colorante primario) y el lugol (mordiente) tiñéndose de color morado-azul y
GramNegativas, aquellas que se decoloran con el alcohol (agente decolorante) y se
tiñen con safranina (colorante de contraste) observándose de color rojo-rosa.
Se puede decir que en general las bacterias Gram Positivas, reaccionan de manera
diferente que las Gram Negativas, cuando se les expone a una gran variedad de
agentes físicos y químicos.
Para la realización de la técnica, se utilizan dos colorantes, un mordiente y un

agente decolorante. El colorante primario es básico, el cristal violeta, el mordiente
es una mezcla de yodo - yoduro y tiene como finalidad incrementar la afinidad entre
el colorante primario y la célula, el agente decolorante como lo es el alcohol ó una
mezcla de alcohol - acetona sirve para retirar de la célula el colorante no fijado, la
facilidad para decolorarse varía de unas células a otras y por último el colorante de
contraste que debe de ser de un color diferente al primario ya que esta destinado a
teñir las células que se decoloran; permitiendo diferenciarlas.
Se conocen varias modificaciones a esta técnica, aquí se utilizará la modificación
de Hucker que se considera de las más seguras.
7
Tinción de Esporas
Esta tinción diferencial ayuda a proporcionar el contraste necesario para la
observación de ciertas estructuras de la célula bacteriana, como lo son las esporas,
con la finalidad de facilitar su identificación.
La observación de esporas bacterianas, permite, además de conocer su presencia,

tener idea de su forma, posición y tamaño dentro de la célula vegetativa. Las
esporas son difíciles de colorear, pero una vez teñidas resisten fuertemente la
decoloración. Para realizar la tinción, se requiere de métodos especiales para lograr
la penetración del colorante primario, se recurre al calor (Método de Dorner) o a la
exposición prolongada al colorante (Método de Bartholomew Mittwer).
Tinción de Cápsulas
Para poner de manifiesto la presencia de cápsulas en las bacterias, se puede
recurrir a diferentes técnicas, todas ellas, están enfocadas a resolver el problema
de la diferente afinidad a los colorantes que presenta la cápsula, en comparación
con los constituyentes de la célula.
El método de Anthony, colorea la célula y el fondo del campo, mas no la cápsula,

de manera que ésta se observa por contraste; en el método de Leifson la cápsula
admite un contra colorante de forma tal que la cápsula se observa teñida y además
se cuenta con el recurso de la coloración negativa, utilizando tinta china.
Sin duda que la mejor técnica para demostrar la cápsula, será la que la tiña, de
manera que se contraste con respecto a la célula y el resto del campo.
Procedimiento
Tinción de Gram
1. Prepare un frotis de cada una de las muestras.
2. Tiña con cristal violeta y déjelo actuar durante un minuto, retire el exceso de
colorante.
3. Lave con agua.
4. Cubra el frotis con solución de lugol y déjelo actuar por un minuto.
5. Lave con agua.
6. Decolore con alcohol etílico al 96% hasta que este no suelte más colorante
(aproximadamente por 30 segundos).
7. Lave con agua.
8. Cubra con safranina por 30 segundos y retire el exceso de colorante.
9. Lave con agua
10. Dejar secar al aire o seque entre papel filtro sin llegar a tallar la preparación.
11. Observar al microscopio con el objetivo de 100x ( inmersión )
Interpretación:
- Las Bacterias Gram positivas se observan de un color morado– azul.
- Las Bacterias Gram negativas se observan de un color rojo – rosa.
Tinción de esporas mediante la técnica de Bartholomew Mittwer

1. Prepare un frotis de la muestra.
8
2. Cubrir el frotis con solución acuosa de verde de malaquita durante 10

minutos.
3. Lavar con agua.
4. Cubrirlos con solución acuosa de safranina al 0.25 % durante 15 segundos.
5. Lavar con agua.
6. 7. Dejar secar al aireo con papel filtro.
7. Observe la preparación con el objetivo de 100x.
Interpretación:
- La espora se tiñe de verde.
- La célula vegetativa se tiñe de rojo.
Tinción de cápsulas mediante la técnica de Anthony

1. Prepare un frotis a partir de la muestra.
2. Cubrir la preparación con solución colorante de cristal violeta por 30
segundos.
3. Lavar con solución de CuSO4 al 20 %.
4. Dejar secar al aire.
5. Observar con el objetivo de 100x.
- Nota: El frotis no debe de ser fijado por calor, únicamente debe dejarse secar
al aire.
Interpretación:
- La cápsula se observa sin teñir.
- La célula se tiñe intensamente de morado.
- El fondo del campo se observa de color morado.
Disposición de residuos
Los residuos de la tinción se depositan en el contenedor de Colorantes y Lugol.
Los residuos de las muestras son regresados a la Auxiliaría del Laboratorio.
Los frotis se lavan y se desengrasan con alcohol.
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Práctica No. 4
Preparación de medios de cultivo
Objetivo
Aprender a preparar medios de cultivo que se emplean en las diferentes prácticas
de esta Unidad de Aprendizaje
Introducción
Los medios de cultivo, tienen como objeto proporcionar a los microorganismos los
requerimientos nutricionales, fuera de su hábitat normal; necesarios para su
aislamiento y cultivo.
Las condiciones que debe cumplir un medio de cultivo para resultar adecuado son:
Tener la calidad y cantidad de las sustancias requeridas.
Ausencia de sustancias inhibidoras para el microorganismo, además debe de ser
esterilizado antes de su inoculación.
Fundamento
Respecto a la composición química de los medios de cultivo, estos pueden ser:
Sintéticos o Químicamente definidos: cuando se conoce la composición química y
la concentración de sus constituyentes; ya que para su fabricación se emplean
productos químicos, relativamente puros, estos se seleccionan de acuerdo con las
necesidades nutricionales de cada microorganismo en particular, así un
microorganismo heterótrofo requiere de una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, y sales inorgánicas; quizá algunos más exigentes requieren de vitaminas,
purinas, aminoácidos, etc.
No sintéticos o Complejos: son aquellos que no se conoce su composición química

exacta, ya que la mayoría de ellos son digeridos ácidos o enzimáticos de diversos
tejidos: vegetales, carnes, caseína, y células de levaduras, que pueden
proporcionar fuentes ricas de polipéptidos, aminoácidos, sales minerales, o
vitaminas; ejemplos de estos serían: peptona, triptona, extracto de levadura,
hidrolizado de caseína, etc.A pesar de que estos digeridos contienen carbohidratos
en cierta proporción, se acostumbra suplementarlos con un azúcar adicional.
De acuerdo con su consistencia se conocen tres tipos de medios de cultivo:

- Medios líquidos
- Medios sólidos
- Medios semisólidos
El agente solidificante que se emplea comúnmente es el agar agar a una

concentración por lo general de 1.2-1.5% en medios sólidos y de 0.3-0.7% en
medios semisólidos.
El agar es una sustancia obtenida apartir de una alga marina, se dispone de él en

forma de polvo seco en estado de pureza, ya que químicamente en un galactano,
(carbohidrato complejo) formado por moléculas de galactosa, y resistente a la
acción de la bacterias, lo cual es unaventaja, ya que no se agrega a los medios
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como alimento, sino solamente como agente solidificante. El gel de sílice es un

recurso cuando se requiere cultivar bacterias autótrofas, en donde se requiere
excluir la materia orgánica.
Recomendaciones Generales para la preparación de los medios de cultivo

- El equipo y material de vidrio empleados en la preparación de los medios de
cultivo deberán estar limpios y exentos de sustancias como los detergentes.
- Pesar o medir con exactitud cada uno de los componentes del medio de
cultivo en un recipiente adecuado (por ejemplo: vidrios de reloj).
- Mantener siempre tapados los frascos que contienen los medios de cultivo
deshidratados para evitar la hidratación.
- El agua empleada para la preparación debe de ser desmineralizada.
- Preparar los medios de cultivo conforme a las indicaciones del fabricante; las
cuales vienen indicadas en el frasco del cultivo o en la ficha técnica del
medio.
- Si se desea preparar un medio sólido, es necesario calentar para disolver el
Agar. Se recomienda hacerlo en baño María, no directo sobre la llama o
plancha de calentamiento. Se pueden emplear agitadores magnéticos.
No se generan residuos
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Práctica No. 5
Esterilización de medios de cultivo y material de laboratorio
Objetivo
Conocer y aplicar los métodos de esterilización por calor seco y calor húmedo
Esterilizar por calor húmedo los medios de cultivo.
Esterilizar por calor seco el material de vidrio.
Introducción
La esterilización es un proceso mediante el cual se logra la destrucción de toda
forma de vida microbiana.
En el laboratorio de Microbiología es una práctica común la esterilización de medios
de cultivo y material que se utilizará para promover el desarrollo de los
microorganismos, asegurando así que los microorganismos presentes en un cultivo
son los que se encontraban en la muestra y no en el material o en el entorno.
Además es un proceso que también se utiliza para destruir los microorganismos de
los cultivos que serán desechados.
La esterilización puede llevarse a cabo mediante diferentes métodos, la elección de
éste dependerá de la naturaleza de lo que se desea esterilizar.
Los métodos más ampliamente utilizados emplean calor para lograr la esterilización,
y éstos se clasifican en aquellos que utilizan calor húmedo y los que emplean calor
seco.
De los métodos donde se aplica calor húmedo, la esterilización con vapor de agua
a presión es el más usado, y el equipo que se emplea es el autoclave.
El procedimiento habitual es usar una temperatura de 121 °C, para lo cual se
necesita una presión de 15 psi (libras/pulgada2). En estas condiciones es suficiente
un tratamiento de 15 min para eliminar las esporas de bacterias, que son las más
resistentes.
Este método es el de elección para esterilizar medios de cultivo y soluciones que no
formen emulsiones con el agua y que no se descompongan a temperaturas
superiores a 100 °C, si esto último ocurre se recomienda esterilizar por tindalización,
método en el cual se emplea calor húmedo pero a presión atmosférica normal, o
bien, por filtración.
La estufa de esterilización u Horno Pasteur se utiliza para esterilizar empleando

calor seco. La temperatura varía entre 120 y 180 °C, requiriéndose distintos tiempos
de exposición. Es posible esterilizar por este método material de vidrio e
instrumental metálico, así como sustancias en polvo y no acuosas, y sustancias
viscosas no volátiles.
Por lo general se emplea una temperatura de ~170 °C por un período de tiempo de
2 h, aunque el tiempo puede reducirse al incrementar la temperatura; sin embargo,
es necesario considerar que el papel y el algodón no se pueden esterilizar a más de
190 °C.
La esterilización por calor seco también se puede efectuar mediante la incineración

o fuego directo. Cuando se lleva al rojo, en el área de reducción de la llama del
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mechero el material de metal, como asas bacteriológicas y pinzas de disección, la

acción directa de la llama elimina los microorganismos. Este material debe enfriarse
en un área aséptica antes de su uso.
Fundamento
La destrucción de los microorganismos por acción del vapor de agua a presión se
logra por la desnaturalización de las proteínas celulares, mientras que con el calor
seco se consigue por la desecación de las células, efectos tóxicos por niveles altos
de electrolitos, así como por procesos de oxidación de lípidos y fusión de
membranas.
Procedimiento
Esterilización de medios de cultivo
1. Coloque los tubos y matraces con medios de cultivo en una canastilla
metálica.
- La tapa de los tubos de rosca debe quedar entreabierta para permitir la
entrada del vapor de agua.
- Los matraces no deben ser llenados a más de 2/3 de su capacidad.
- Cubra los tapones de algodón con papel periódico para evitar que se
humedezcan.
2. Adicione agua desmineralizada en el autoclave hasta el nivel adecuado
(hasta que sobrepase las resistencias del equipo).
3. Introduzca la canastilla metálica al autoclave.
4. Cierre el autoclave y verifique que la válvula de salida de vapor se encuentre
abierta.
5. Encienda el autoclave y espere a que salga todo el aire del interior de la
autoclave, para alcanzar las condiciones de esterilización requeridas.
6. Cierre la válvula cuando el desprendimiento de vapor de agua sea continuo
(generalmente se logra unos minutos después de haber alcanzado una
temperatura de 100 °C).
7. Revise la temperatura en el termómetro del autoclave, y cuando llegue a 121
°C (15 psi en el manómetro) registre el tiempo.
8. Mantenga a 121 °C por 15 min.
9. Apague el autoclave y de tiempo para que ésta se enfríe y la presión baje a
cero.
10. Abra la válvula de salida de vapor para permitir la liberación del vapor
restante.
11. Abra el autoclave y con precaución (aún está caliente) retire el material.
12. Cierre bien los tubos de tapón de rosca mientras se encuentran calientes.
- Si el agar de los tubos lo requiere inclinado, espere a que se enfríen un poco
más, colóquelos sobre una superficie que le permita obtener el grado de
inclinación deseado y déjelos solidificar.
13. Una vez que los medios alcancen la temperatura ambiente consérvelos en
refrigeración hasta su uso.
13
Esterilización de material de vidrio

1. Introduzca el material a esterilizar previamente envuelto en papel y las
pipetas además con su filtro de algodón, en una estufa de esterilización.
2. Encienda la estufa y permita que alcance una temperatura de 170 °C.
3. Registre el tiempo y mantenga dos horas a esta temperatura.
4. Apague la estufa y retire el material con el equipo de protección adecuado, o
bien, espere a que se enfríe para retirarlo.
El método utilizado para envolver el material deberá garantizar el mantenimiento de

las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento.
Si se desea, el material de vidrio también se puede esterilizar por calor húmedo. Al

terminar de esterilizar hay que permitir que el papel se seque completamente ya
que si se manipula estando húmedo se puede llegar a romper y se perdería la
esterilidad del material.
En esta práctica no se generan residuos.
El agua del autoclave puede usarse nuevamente.
14
Práctica No. 6
Aislamiento por estría cruzada
Objetivo
Conocer y aplicar la técnica de aislamiento mediante estría cruzada para la
obtención de cultivos puros de bacterias a partir de una muestra problema.
Introducción
En la naturaleza, los microorganismos viven asociados a otros en conjuntos
llamados poblaciones; estas poblaciones por lo general están formadas por
diferentes tipos de microorganismos. Si queremos estudiar las características
bioquímicas, fisiológicas y genéticas de un microorganismo en particular, es
necesario separarlo de la población mixta en la que se encuentra y obtenerlo en
cultivo puro.
Un cultivo puro o axénico es aquel que contiene sólo un tipo de microorganismo.
Existen varias técnicas para lograr la separación o aislamiento de los

microorganismos presentes en la naturaleza o en un cultivo mixto basándose en la
obtención de colonias aisladas y en sus características.
De manera general los métodos de aislamiento incluyen:

1. Separación física de los microorganismos, lo cual se puede lograr mediante
las técnicas de:
- Dilución y siembra en placa
- Inoculación y transferencia
- Estría cruzada
2. Utilización de medios de cultivo selectivos y diferenciales.
Sin embargo, frecuentemente se emplean combinaciones de las técnicas anteriores

para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados.
La elección de la técnica de aislamiento depende del tipo de microorganismo que

se desea aislar. No todas las técnicas resultan adecuadas para el aislamiento de
los diversos grupos microbianos. La técnica de dilución y siembra en placa es de
utilidad para el aislamiento de cualquier tipo de microorganismo, no así la técnica
de estría cruzada, que resulta una técnica rápida y simple, pero se aplica
principalmente para el aislamiento de bacterias y levaduras.
Fundamento
Las técnicas de aislamiento se basan en la separación de los microorganismos
presentes en una muestra, empleando un medio de cultivo sólido, en el cuál las
células quedarán inmovilizadas y crecerán formando masas aisladas visibles,
llamadas colonias.
En la técnica de estría cruzada la muestra se extiende sobre la superficie de un
medio solidificado en una placa de Petri, empleando para ello el asa bacteriológica.
Al ir estriando sobre la placa, los microorganismos presentes en el asa se irán
dispersando hasta obtener células aisladas, las cuales formarán las colonias.
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Con el fin de conseguir una mejor separación de las células, el estriado se realiza
en diferentes direcciones (por campos), donde antes de cambiar de dirección el
estriado, el asa se esteriliza a la flama y a continuación una porción de la última
estría realizada, se estría sobre el siguiente campo.
A partir de una colonia aislada se resiembra asépticamente para obtener el cultivo

puro.
Procedimiento
1. Fundir el agar nutritivo preparado y esterilizado anteriormente, en un baño de
agua a ebullición.
2. Preparar un frotis de la muestra problema y teñir al Gram.
3. Revisar si el medio se ha fundido y permitir que se tempere.
4. Observar al microscopio el frotis teñido y registrar sus observaciones.
5. Vaciar el agar nutritivo temperado en una caja de Petri estéril (20 ml
aproximadamente) y esperar a que solidifique.
6. Dividir la caja en 3 campos por la parte posterior con un marcador
permanente (fig 13). Puede dividirla en 5 campos.
Campo 1
Figura 13
Campo Campo
2 3
7. Esterilizar el asa bacteriológica al mechero y permitir que se enfríe para tomar

la muestra.
8. Inocular la muestra por estría, deslizando el asa por el primer campo. Se
recomienda mantener el asa aplanada contra el agar.
9. Esterilizar el asa al mechero antes de cambiar la dirección del estriado al
segundo campo y permitir que se enfríe.
10. Deslizar el asa atravesando el primer campo una sola vez, para arrastrar
parte de la muestra y distribuirla en el segundo campo.
11. Repetir los pasos 9 y 10 hasta concluir la siembra de todos los campos en
que dividió la caja (fig 14).
12. Incubar en posición invertida a 37 °C por 24 - 48 h.
13. Después de la incubación, observar las características de las colonias
desarrolladas en cuanto a forma, tamaño, elevación, color, borde, etc., sin
destapar la caja y registre sus observaciones. Si requiere destaparla hágalo
en condiciones de asepsia.
14. Preparar un frotis de cada una de las diferentes tipos de colonias obtenidas
y teñir al Gram.
15. Observar al microscopio y registrar sus observaciones.
16
16. Una vez observada la pureza de las colonias, inocular un tubo con agar
inclinado a partir de cada una de las colonias aisladas de las que preparó
frotis y marcar adecuadamente los mismos.
17. Incubar en las condiciones descritas anteriormente.
18. Describir el crecimiento y confirmar su pureza.
19. Cubrir el tapón con parafilm y conservar en refrigeración para su posterior
identificación.
Figura 14: el asa indica el lugar donde se debe comenzar a realizar cada estriado.
Los residuos generados en la tinción de Gram se desechan en el colector especial
para Colorantes y Lugol que se encuentra en el laboratorio.
Una vez concluido el aislamiento y teniendo los cultivos puros, esterilizar la muestra
problema y la caja con el cultivo en autoclave. El líquido se desecha en el drenaje y
el agar solidificado se deposita en bolsa roja en el contenedor correspondiente.
Si el agua del autoclave está sucia, vaciar y limpiar el autoclave. El agua se tira al
drenaje.
17
Práctica No. 7
Aislamiento por dilución y siembra en placa
Objetivo
Conocer y aplicar la técnica de aislamiento mediante dilución y siembra en placa
para la obtención de cultivos puros de hongos filamentosos a partir de una muestra
problema.
Introducción
Las técnicas de aislamiento se basan en la separación de los microorganismos
presentes en una muestra, empleando un medio de cultivo sólido, de tal manera
que después de la incubación cada microorganismo genere una colonia. Este
procedimiento se utiliza generalmente para muestras donde se sospecha la
presencia de mezclas de microorganismos como hongos, levaduras o bacterias y la
competencia por los nutrientes puede ser una limitante de crecimiento de algunos
de ellos.
Los hongos filamentosos y las levaduras son un grupo de microorganismos

eucarióticos que se caracterizan por la presencia de pared celular, ausencia de
clorofila, no móviles, aunque algunos producen esporas móviles, heterótrofos o
quimioorganotrofos, se reproducen mediante esporas asexuales o sexuales.
Algunos son benéficos para el hombre, ya que se utilizan en fermentaciones para la
producción de vitaminas, ácidos orgánicos y antibióticos, entre otros productos; sin
embargo, existen otros que son perjudiciales, ya que pueden ocasionar pérdidas
económicas debido a que causan enfermedades a plantas y animales, incluso al
hombre.
Las técnicas más empleadas para el aislamiento de este tipo de microorganismos

son la dilución y siembra en placa y la inoculación y transferencia.
Como medio de cultivo se pueden emplear Patata Dextrosa Agar (PDA), Agar
Saboraud Dextrosa (SDA) o Czapek Dox Agar, además se recomienda la adición
de agentes antimicrobianos para evitar el crecimiento de bacterias que puedan
interferir en el crecimiento de éstos. Como se desarrollan lentamente, se
recomienda incubar por un período de tiempo de 5 a 7 días, a su temperatura óptima
de desarrollo, 28 °C.
Fundamento
La técnica de dilución y siembra en placa consiste en efectuar una serie de
diluciones decimales a partir de una muestra, inoculando 1 ml de las diluciones
realizadas en una caja de Petri y añadiendo posteriormente medio de cultivo estéril
de acuerdo al microorganismo que se desea aislar y posteriormente llevar a incubar
en condiciones adecuadas.
18
Procedimiento
1. Se pone a fundir al agar estéril en baño María y posteriormente se mantiene
entre 45 - 50°C en baño de temperatura.
2. Se colocan las cajas de Petri cerca del mechero y se etiquetan con el número
de muestra y numero de dilución correspondiente. Se marcan los tubos con
solución salina para hacer las diluciones con el número de dilución.
3. Se agita la muestra para homogenizar y se toma 1 ml con una pipeta estéril
y se coloca en el primer tubo de solución salina (dilución primaria,1:10). Este
tubo se agita vigorosamente y se toma con una pipeta nueva 1 ml para una
caja de Petri y 1 ml para el segundo tubo de solución salina (dilución 1:100).
Se agita este tubo de nueva cuenta y se toma 1 ml para una caja de Petri y
para el tercer tubo de solución salina (dilución 1:1000). Por último se toma 1
ml de este tubo y se coloca en una caja de Petri. (ver figura 15)
Figura 15. Diagrama de Dilución y Siembra en placa
4. Se acomodan las cajas de Petri listas para vaciar el agar y se vacía de 15-20
ml de agar fundido. Se mueven las cajas sobre la mesa 6 veces a la izquierda
y 6 veces a la derecha y posteriormente hacia arriba y hacia abajo para
homogenizar correctamente la muestras con el agar, teniendo cuidado de no
derramar el agar. Dejar solidificar sobre la mesa y posteriormente llevar a
incubar en posición invertida a 28 °C de 3 a 5 días.
5. Preparar un montaje en azul de lactofenol y observar las características
microscópicas del hongo filamentoso con objetivos secos. Localizar hifas en
las preparaciones y determinar si están septadas o no, además de localizar
estructuras especiales como conidióforos, esporangióforos, esporas y tipo de
éstas. Dibujar los campos característicos observados.
6. Seleccionar una colonia característica y sembrar por rasgadura un tubo con
PDA inclinado para la obtención del cultivo puro del hongo.
19
7. Incubar en las condiciones anteriormente descritas.

8. Conservar en refrigeración para su posterior identificación.
Las cajas se envuelven en papel y se esterilizan junto a los tubos y pipetas como
material sucio. Al finalizar el proceso de esterilización los restos de agar se tiran en
bolsa roja y en el contenedor correspondiente y las soluciones se tiran en el drenaje.
20
Práctica No. 8
Métodos para la identificación de bacterias
Objetivo
Conocer la metodología empleada para lograr la identificación de una bacteria.
Realizar algunas pruebas bioquímicas para identificar género y especie de las
bacterias obtenidas en cultivo puro en la práctica 6.
Introducción
Para identificar grupos microbianos se utilizan con frecuencia medios específicos
para los géneros bacterianos que se desea identificar, ya sean medios de
enriquecimiento y medios de propagación (si el género en especial se encuentra en
baja proporción respecto a los demás géneros presentes en la muestra), medios
selectivos y diferenciales y medios de cultivo especiales.
La selección de uno o varios medios de cultivo para la identificación dependerá de
las características fisiológicas y metabólicas del género que se investiga.
Dentro de las pruebas utilizadas para la identificación en trabajos de rutina se

incluye las características macroscópicas o de cultivo, las microscópicas y las
metabólicas o pruebas bioquímicas. En algunos casos, para identificar variedad o
serotipo se determinan también características antigénicas y de manera más
específica, en investigación principalmente, se realizan estudios a nivel de DNA.
Las características de cultivo se determinan utilizando medios de cultivo básicos, de

enriquecimiento (ej. Agar Sangre), selectivos (p. ej. Agar S 110, Agar EMB) o
diferenciales (p. ej. Agar Sangre, EMB). Las características que se observan
incluyen: forma, tamaño, borde, elevación, textura, color, producción de pigmentos,
cambios en el medio de cultivo.
Las características microscópicas incluyen morfología, agrupación y tinción de
Gram, ocasionalmente si se sospecha de un género en particular que se caracteriza
por producción de esporas, cápsulas, gránulos metacromáticos, o por poseer
flagelos, se realizan tinciones diferenciales para investigar la presencia de estas
estructuras.
Las características metabólicas se determinan utilizando medios de cultivo

especiales, que no pueden ser clasificados como medios de enriquecimiento,
selectivos o diferenciales. Estos medios de cultivo nos permiten conocer la actividad
bioquímica de los microorganismos, por ejemplo: caldo base rojo fenol con glucosa,
agar triple azúcar con hierro (TSI), agar con lisina y hierro (LIA), medio de motilidad
para indol y sulfuro (SIM), agar con citrato de Simmons. Existe una gran variedad
de pruebas bioquímicas empleadas para la identificación de géneros microbianos y
para diferenciación de especies.
La naturaleza de la muestra y las características macroscópicas y microscópicas

del cultivo puro, proporcionan información referente al tipo de microorganismo que
podemos encontrar, y consideramos la información anterior para seleccionar las
pruebas bioquímicas a efectuar.
21
Fundamento
Las pruebas bioquímicas proporcionan información de gran valor para la
identificación de las bacterias en base a la capacidad que poseen éstas para
metabolizar o descomponer ciertos sustratos presentes en los medios de cultivo
utilizados para realizar las pruebas.
El microorganismo que se desea identificar es inoculado en una serie de medios de
cultivo y después de incubar en las condiciones adecuadas para su desarrollo, se
investiga la presencia de alguno de los productos que se habrán generado por
acción de las enzimas producidas por el microorganismo, o bien se investiga la
ausencia del sustrato.
La reacción metabólica se puede detectar mediante la observación de cambios en

el medio de cultivo (de color, producción de gas, de precipitado), o bien, en
ocasiones es necesario añadir algún reactivo después de la incubación para revelar
la presencia del producto o la ausencia del sustrato.
Por ejemplo, el medio de sacarosa con rojo de fenol, permite determinar la
capacidad del microorganismo para fermentar la sacarosa ya que el medio cambia
a amarillo si el microorganismo fermenta la sacarosa y produce ácido, además si en
el medio se coloca un tubo Durham invertido es posible determinar si se produce
gas en la fermentación.
El medio SIM es un medio semisólido que se utiliza para diferenciar enterobacterias,

y en el mismo tubo se puede determinar si el microorganismo es móvil, si produce
indol y sulfuro de hidrógeno. La movilidad se aprecia si aparece turbidez más allá
de la línea de siembra (se inocula por picadura). El medio de cultivo contiene
triptofano (constituyente de la peptona), el cual puede ser oxidado por la
triptofanasa, produciendo indol. La presencia de indol se detecta por formación de
un complejo rojo al adicionar al medio de cultivo unas gotas del reactivo de Kovac’s,
el cual contiene p- dimetilaminobenzaldehído.
La producción de sulfuro de hidrógeno se detecta porque en el medio se forma un
precipitado negro de sulfuro de hierro.
Procedimiento
1. En la primera sesión de esta práctica preparar los medios de cultivo y material
a utilizar.
Las pruebas que realizará son las siguientes:
a) Si su cultivo puro es de cocos Gram (+):
- Producción de pigmento en el medio selectivo para estafilococos S110.
- Producción de hemolisinas en Agar Sangre.
- Producción de coagulasa en Caldo BHI.
- Producción de catalasa en Caldo Nutritivo.
- Producción de gelatinasa en Gelatina Nutritiva.
b) Si su cultivo puro es de bacilos Gram (+):
- Producción de amilasas en Agar Almidón.
- Producción de hemolisinas en Agar Sangre.
- Producción de catalasa en Caldo Nutritivo.
- Fermentación u oxidación de lactosa en CLRF.
22
- Motilidad en medio de SIM, y mediante preparación en gota

pendiente.
- Tinción diferencial para esporas.
c) Si su cultivo puro es de bacilos Gram (-):
- Fermentación de lactosa en Agar EMB.
- Producción de indol, sulfuro y motilidad en medio de SIM.
- Prueba de Rojo de Metilo y VogesProskauer en Caldo MR- VP.
- Prueba de utilización de citratos en medio de Simmons.
- Prueba de descarboxilación de lisina y producción de sulfuro en el
medio LIA.
- Prueba de fermentación de carbohidratos, producción de sulfuro y gas en
el medio TSI.
- Producción de gelatinasa en Gelatina Nutritiva.
- Producción de pigmentos en Caldo Nutritivo.
2. Inocular un tubo con caldo nutritivo a partir del cultivo puro bacteriano aislado
en prácticas anteriores e incubar a 37°C por 24-48 h.
3. Investigar en la bibliografía el fundamento, observación e interpretación de
las pruebas bioquímicas que le correspondan de acuerdo al tipo de
microorganismo que tiene en su cultivo puro.
4. La segunda sesión de prácticas inocular los medios de cultivo para efectuar
las pruebas bioquímicas a partir del cultivo en medio líquido preparado la
sesión anterior, y llevar a incubación de 24-48 h a 37 °C.
5. La tercera sesión de prácticas observar e interpretar los resultados de las
pruebas bioquímicas realizadas.
6. Para las pruebas de indol, VogesProskauer, coagulasa y catalasa añada los
reactivos necesarios previo a la observación (información obtenida en la
consulta bibliográfica de la primera sesión de prácticas), también recuerde
que antes de observar la prueba de la gelatinasa debe llevar a refrigeración.
Una vez concluida la práctica y entregado su reporte, esterilizar todo el material
empleado en autoclave. Los cultivos líquidos se desechan en el drenaje y el agar
solidificado se deposita en bolsa roja y en el contenedor correspondiente.
Si el agua del autoclave está sucia, vaciar y limpiar el autoclave. El agua se tira al
drenaje.
23
Práctica No. 9
Identificación de hongos filamentosos
Objetivo
Conocer la metodología empleada para lograr la identificación de un hongo
filamentoso.
Identificar el género al que pertenece el hongo filamentoso aislado en la Práctica
No. 7.
Introducción
Es muy importante la identificación del género y la especie de un hongo filamentoso,
ya que esto nos permite conocer las aplicaciones que se le pueden dar a este
microorganismo. Por ejemplo, en el área biotecnológica, para saber que tipos de
productos o enzimas puede producir, que contaminantes puede degradar, entre
otras utilidades; si es de importancia médica, es necesaria su identificación para
que el médico pueda hacer un diagnóstico más preciso y determinar el tratamiento
a seguir. Además, si es fitopatógeno, la identificación es necesaria para determinar
las acciones a seguir para controlar la infección en el cultivo de las plantas.
Fundamento
Su identificación se basa tanto en observaciones macroscópicas (crecimiento sobre
una caja Petri) como microscópicas (generalmente, microcultivo de Henrici). Las
observaciones se deben realizar diariamente para detectar los cambios de
coloración (observación macroscópica) y cambios morfológicos (observación
microscópica) que suceden durante el crecimiento del hongo y poder determinar las
estructuras de importancia taxonómica. Estas observaciones también sirven para
saber el tiempo que tarda el hongo en crecer, factor muy importante en un proceso
industrial.
Características observadas a nivel microscópico:

- Hifas: septadas o no.
- Micelio: claro u oscuro (ahumado), coloreado o incoloro.
- Que se produzcan esporas sexuales o no, y en caso de que se produzcan,
de que tipo: ascosporas, basidiosporas, oosporas o zigosporas.
- Clase de esporas asexuales: esporangiosporas, conidios o artrosporas
(oidios).
- Caracteres de las cabezuelas de esporas:
- Esporangios: Tamaño, color, forma y localización.
- Conidios: conidios simples o en cadenas, formados por gemación o en
masas; forma y disposición de las esterigmas o fiálides; apelmazamiento de
los conidios.
- Aspecto de los esporangióforos o conidióforos:
- Simples o ramificados, tipo de ramificación.
- Tamaño y forma de la columela apical del conidióforo.
- Conidióforos aislados o en haces.
- Aspecto microscópico de las esporas asexuales, especialmente los conidios:
- Forma, tamaño, color.
24
- Lisos o rugosos.
- Mono, bi o multicelulares.
- Presencia de estructuras o esporas esenciales:
- Estolones, rizoides, células basales, clamidosporas, esclerocios, etc.
Procedimiento
Microcultivo de Henrici
1. Colocar en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado unas gotas
de PDA estéril y fundido previamente preparado.
2. Inocular el hongo que desea identificar en el centro del agar antes que éste
solidifique y colocar encima un cubreobjetos.
3. Sellar tres lados de la preparación ya sea con parafina previamente fundida
empleando un hisopo de madera, o bien, con esmalte para uñas.
4. Colocar la preparación con el extremo no sellado hacia abajo, en un vaso de
precipitado que contenga algodón humedecido con agua (fig. 16).
Figura 16. Microcutivo de Henrici
5. Incubar a 28 °C de 5 a 7 días
6. Realizar diariamente la observación microscópica de esta preparación en 10x
y 40x, para detectar los cambios morfológicos que suceden durante el
crecimiento del hongo, y poder identificar las estructuras de importancia
taxonómica. Registrar y dibujar las observaciones.
- Revise que algodón permanezca húmedo durante todo el tiempo que
mantiene el hongo en incubación.
Observación macroscópica
1. Vaciar 15-20 ml de PDA fundido en una capa Petri estéril y esperar a que
solidifique.
2. Tomar con el asa esporas del hongo que se desea identificar y sembrar en
la caja Petri por rasgadura en forma de X (figura 17).
25
Figura 17
3. Incubar a 28 °C de 5 a 7 días.
4. Realizar diariamente las observaciones de la caja, describiendo el tamaño,
forma y tipo de la colonia, así como las características del micelio, si es
algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio, el color del
micelio, de las esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.
5. En el último día de observación, realizar la técnica de la cinta adhesiva para
la observación microscópica del hongo con el fin de comprobar la pureza.
Técnica de la cinta adhesiva para observación microscópica de hongos

filamentosos
1. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio
y desengrasado.
2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente de 3 a 5 cm y tomarlo por
los extremos con el lado del pegamento hacia afuera.
3. Destapar la caja cerca del mechero y presionar suavemente con la cinta, la
orilla de la colonia.
4. Colocar la cinta sobre la gota de azul de lactofenol, poniendo en contacto con
el colorante las estructuras adheridas en la cinta.
5. Observar al microscopio con objetivos secos.
Con los resultados obtenidos, consulte en bibliografía y reporte el género al que

pertenece el hongo filamentoso que aisló en la práctica No. 7.
Una vez concluida la práctica y entregado su reporte, esterilizar el cultivo puro, el
microcultivo y la caja Petri en autoclave antes de desecharlos.
Los residuos del montaje en azul de lactofenol se desechan en el contenedor de
material de vidrio impregnado con sustancias peligrosas.
26
Práctica No. 10
Curva de crecimiento microbiano
Objetivo
Conocer las etapas que se presentan al colocar un microorganismo en condiciones
adecuadas para su desarrollo.
Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de células y turbidimetría
para obtener la curva de crecimiento.
Calcular el tiempo de generación del microorganismo.
Introducción
Se define crecimiento como un aumento en la cantidad de constituyentes y
estructuras celulares, cuando hay crecimiento en ausencia de división celular hay
aumento en el tamaño y peso de la célula. Mientras que cuando el crecimiento es
seguido de división celular hay unaumento en el número de células.
Es importante distinguir entre el crecimiento de células individuales y el crecimiento
de poblaciones,ya que en los microorganismos debido a su pequeño tamaño no se
hacen estudiosde crecimiento individual sino estudios de crecimiento de
poblaciones.
El crecimiento de una población es el aumento del número de células como

consecuencia deun crecimiento individual y posterior división. Éste ocurre de
unamanera exponencial, a su vez, esto es una consecuencia del hecho de que cada
célula se divide dando dos células hijas, las cuales al dividirse darán cada una
doscélulas hijas, así es que en cada período de división la población se duplica.
La velocidad de crecimiento exponencial se expresa como tiempo de generación (g)
y estese define como el tiempo que tarda una población en duplicarse.
Si consideramos que entre el tiempo inicial (t0) y el tiempo final (tf), han transcurrido
n generaciones, entonces:
g = tf-to/n
Por tanto el número de células final (Nf) será
Nf= número de células iniciales x 2n

A partir de esta fórmula obtendremos n y podremos sustituirla en g = tf-to/n
n= log Nf–N0/ log 2
Para estimar el tiempo de generación es necesario determinar la cantidad de

microorganismos al inicio y al final del período de incubación, y si se requiere
obtener una curva de crecimiento es necesario estimar la cantidad de
microorganismos en intervalos de tiempo definidos.
Fundamento
Los métodos directos de cuantificación de microorganismos permiten establecer la
población total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rápidos
aunque no es posible diferenciar a las células vivas de las muertas. Entre estos
métodos tenemos la turbidimetría y el conteo de células.
27
Turbidimetría
La turbidimetría se basa en el hecho que la cantidad de microorganismos en una
suspensión microbiana está directamente relacionada con la turbidez o densidad
óptica.
La metodología es útil con suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos
en donde los microorganismos son unicelulares y con un tamaño de unos cuantos
micrómetros, características que les permiten mantenerse suspendidos y
homogéneamente distribuídos; en tanto que con microorganismos de mayor tamaño
y con aquellos productores de polisacáridos esta metodología no es adecuada.
Conteo microscópico
Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para
cuenta (hemacitómetros, cámara de Neubauer). Estas cámaras consisten de
portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de
superficie y de volumen.
Fig. 18. Cámara de Neubauer y área de conteo
Con la cuantificación de microorganismos a través del tiempo es posible el

representar gráficamente el crecimiento microbiano.
La curva presenta distintas fases:
- Fase de latencia ó lag: período de adaptación de un microorganismo a un

nuevo medio de cultivo.
- Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la población que se
duplica a intervalos regulares de tiempo (td).
- Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por
acumulación de productos tóxicos, etc.
- Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es mayor
que el número de células que se dividen.
Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en que

se encuentren (por ejemplo la producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase
estacionaria).
28
Procedimiento
Primera sesión de la práctica
1. Por equipo, preparar 150 ml de caldo Dextrosa Sabouraud en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml y 80 ml en un matraz de 125 ml.
2. Preparar 13 tubos con rosca de 16*100 para esterilizarlos. Etiquetarlos del 0
al 12.
3. Del matraz con los 80 ml de caldo, transferir 4.5 ml de caldo a cada uno de
los tubos marcados con los números del 6 al 12. Los otros seis tubos se
esterilizarán vacíos (tubos marcados del 0 al 5).
4. Envolver 15 pipetas para esterilizar, 1 de 10 ml, 7 de 5 ml y 7 de 1 ml.
5. Esterilizar los matraces y los tubos con medio por calor húmedo y del demás
material de vidrio por calor seco.
Segunda sesión
1. Inocular (8:00 a.m.) con un cultivo de Saccharomyces cerevisiae ajustado a
una D.O. de 0.6 el matraz con los 150 ml de caldo. El inóculo se adicionará
al 2.5-10% con respecto al volumen del medio.
2. Inmediatamente después de inoculado el matraz agitar y muestrear la
primera muestra (tiempo 0). Tomar 3 ml de muestra, depositarlos en el tubo
0 y congelarlo.
3. Continuar muestreando cada hora 3 ml y depositándolos en el tubo
correspondiente hasta la hora 5 (tubo 5), a partir de la hora 6 muestrear 0.5
ml cada hora y transferirlos al tubo correspondiente hasta la hora 12.
Tercera sesión
1. Descongelar las muestras y homogenizar fuertemente.
2. De cada tubo, tomar 2 ml y leer en el espectrofotómetro a una Absorbancia
de 600 nm. Para el blanco, tomar 2 ml de caldo del matraz de 125 ml. Si se
requiere, diluir las muestras con caldo nutritivo para que la absorbancia sea
menos a 1.0 y sea más fiable el resultado.
3. Utilizar la cámara de Neubauer para la cuenta directa al microscopio de cada
una de las muestras. Diluir la muestra con caldo en caso de ser necesario.
4. Realizar gráficas donde relacione los valores de A600nm, UFC/ml y no. de
células contra el tiempo de incubación. Considerar las diluciones realizadas
a la hora de graficar los resultados.
5. Identifique las etapas de la curva de crecimiento en las gráficas obtenidas.
6. Determine el tiempo de generación.
Las muestras se tiran al drenaje después de esterilizarse en autoclave.
Las pipetas empleadas para los muestreos se esterilizan por calor húmedo antes
de lavarse.
Los cultivos se esterilizan en autoclave y se desechan en bolsa roja.
29
Práctica No. 11
Esterilización por filtración. Conteo microbiano en membrana
Objetivo
El alumno utilizará otro método de esterilización para medios de cultivo con
ingredientes termolábiles, y además utilizará este método para obtener el número
de microorganismos presentes en una muestra.
Introducción
Aunque el calor es la forma más efectiva y común para la esterilización de medios
de cultivo líquidos, en algunos casos no resulta aceptable su utilización en medios
que contienen sustancias sensibles al calor, por lo cual se recurre a otros métodos
como la filtración.
Ésta se utiliza para esterilizar soluciones oleosas o líquidos termolábiles como

aceites, soluciones oftálmicas e intravenosas que contienen antibióticos como
principios activos, componentes de medios de cultivo celulares como los líquidos
biológicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y
antibióticos).
Se usan filtros de membrana, los cuales son discos de ésteres de celulosa con poros
tan pequeños que impiden el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos
de filtro dependiendo del tamaño de poro. Estos filtros son desechables.
También se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran los
microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua.
Fundamento
Los filtros eliminan las bacterias por retención debido al tamaño del poro del filtro,
lo cual nos permite poner en evidencia el número de estas cultivándolas en un medio
de cultivo adecuado donde se desarrollarán y nos indicarán el número de las
mismas. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriz
del filtro debido a efectos electrostáticos.
Cabe señalar que este método es aplicable en la cuantificación de microorganismos
sólo en muestras que se sospecha una baja carga microbiana.
Procedimiento
1. El equipo se envuelve en papel y se esteriliza por calor húmedo.
2. Montar el equipo de filtración (base del filtro, matraz y embudo) a un lado del
mechero para seguir manteniendo la esterilidad, ver figura 19.
3. Desmontar el embudo y colocar la membrana filtrante con ayuda de unas
pinzas de disección estériles (flameadas) y colocar el embudo.
4. Si se realizará un conteo microbiano se vacía un volumen medido de la
muestra (normalmente 100 ml), o si se esterilizará un medio de cultivo
solamente se vacía.
30
Figura 19. Montaje del equipo de filtración
5. Encender la bomba de vacío y cuidar que la presión no rompa el filtro. Al

terminar de pasar el líquido, apagar la bomba de vacío.
6. Si se realizará el conteo, desmontar con mucho cuidado el embudo y con
unas pinzas flameadas (estériles) tomar la membrana y depositarla en una
caja de Petri con medio de cultivo estéril solidificado. Llevar a incubar por 24
horas a 35°C y finalmente contar el número de colonias presentes.
- Reportar como _____ UFC por el volumen de muestra filtrado.
7. Si se esterilizó un medio de cultivo, retirar el equipo de filtración del matraz
Kitazato y transferir el medio estéril a un matraz Erlen Meyer previamente
esterilizado.
8. Verificar que el filtrado se encuentra estéril, inoculando 1 ml del filtrado en
condiciones de asepsia y pipeta estéril en un tubo con 4 ml de caldo nutritivo
y llevar a incubar a 37°C por 24 – 48 h y observar. Debe permanecer
transparente.
La caja se envuelve en papel y se esteriliza como material sucio. Al finalizar el
proceso de esterilización los restos de agar se desechan en bolsa roja al contenedor
correspondiente.
El etanol donde se colocaron las pinzas antes de flamear se deposita en el
contenedor C, de solventes no halogenados.
31
Práctica No. 12
Esterilización por agentes químicos
Objetivo
El alumno evaluará algunos agentes químicos utilizados para desinfectar y
esterilizar materiales o superficies del laboratorio.
Introducción
La presencia de un agente químico que destruye o inhibe el desarrollo de
microorganismos es útil debido a que en el laboratorio de microbiología se requiere
eliminar todos los microorganismos presentes en una superficie o para poner en
evidencia la presencia de otros microorganismos que nos permiten determinar el
grado o nivel de limpieza en áreas o equipos que serán utilizados para procesar
alimentos o productos que se puedan ver afectados por la presencia de
microorganismos.
Estos agentes antimicrobianos afectan al crecimiento de varias formas y se

consideran: bacteriostáticos, cuando inhiben el crecimiento de los microorganismos
pero no los destruyen y bactericidas, cuando evitan la proliferación e inducen la
muerte.
Esta clasificación puede ser arbitraria ya que un agente puede ser bacteriostático
a una concentración y si éstase aumenta se convierte en bactericida y viceversa.
Fundamento
Para la evaluación de la actividad antimicrobiana de los desinfectantes se pueden
emplear diferentes técnicas: de dilución en tubo, de la placa de agar y del
coeficiente fenólico.
Esta práctica consiste en una modificación de la técnica de dilución en tubo. Se
estandariza la cantidad de medio de cultivo y de inóculo, y se adicionan diferentes
volúmenes del agente químico para determinar el menor volumen de agente
antimicrobiano al cual se inhibe el crecimiento.
El crecimiento se determina por la turbidez que se genera en el tubo después de 24

h de incubación de los tubos en las condiciones óptimas para el microorganismo de
prueba. Debido a que algunos agentes antimicrobianos pueden provocar cierto
grado de turbidez, se debe tener un control del medio de cultivo y el agente químico.
Adicionalmente, se debe tener un control de cultivo, que nos permita identificar que
la inhibición del crecimiento se debe al agente antimicrobiano y no a otro factor
externo, por esto se debe tener un tubo en el que sólo se coloca el microorganismo
de prueba en el medio de cultivo y se incuba en las mismas condiciones que los que
tienen el agente antimicrobiano.
Aquellos tubos que no presenten crecimiento (ausencia de turbidez) indican la

dilución a la cual ese agente químico mata al microorganismo. utilizado como
prueba cuando este microorganismo es expuesto al agente químico durante ese
período de tiempo.
32
Procedimiento
1. Para cada agente químico a probar, se preparan 5 tubos con 5 ml de medio
de cultivo estéril. Se prepara un tubo adicional que se utilizará como control
de crecimiento.
2. En un matraz se colocan 100 ml del agente químico a probar a la
concentración deseada o recomentada por el fabricante y se le añade 1 ml
del cultivo del microorganismo de prueba.
3. Se deja actuar por un minuto y al cumplirse este se toma una asada de
muestra del matraz y se coloca en uno de los tubos con medio estéril.
4. Se repite este procedimiento para los 2, 5 y 10 minutos colocando una asada
en un tubo con medio estéril.
- Incluir un tubo con una asada del producto de prueba sin microorganismo
para evaluar posible presencia de turbidez.
- Los tiempos de muestreo se pueden muestrear de acuerdo al tiempo de
acción recomendado por el fabricante del producto.
5. Incubar todos los tubos a 35° C por 24-48 horas.
6. Observar y registrar los resultados.
7. Comparar los resultados obtenidos para los diferentes agentes químicos.
Los tubos y pipetas se esterilizan como material sucio. Al finalizar el proceso de
esterilización los restos de las soluciones se tiran en el drenaje.
33
Práctica No. 13
Esterilización por Luz Ultravioleta
Objetivo
El alumno conocerá y aprenderá el procedimiento para esterilizar superficies de
mesas, áreas cerradas o instrumental de trabajo sensible a los agentes químicos
utilizando luz U.V.
Introducción
Existen algunos materiales que no pueden esterilizarse por calor o filtración, por lo
que se recurre a las radiaciones como método de esterilización. Sin embargo, no
todas las radiaciones son efectivas para lograr este objetivo, como es el caso de las
radiaciones UV.
Éstas no son un método satisfactorio para la esterilización por su bajo poder de
penetración, pero son muy efectivas para mantener mesas de trabajo o áreas
cerradas como cuartos asépticos en condiciones idóneas para trabajar.
Fundamento
La radiación UV daña el material genético o DNA (ácido desoxirribonucleico) de las
células. La luz UV penetra la pared y la membrana de la célula, provocando una
reestructuración molecular a nivel del DNA, evitando así su reproducción. Si una
célula no puede reproducirse, se considera muerta.
En esta práctica se expondrán al efecto de la irradiación UV los microorganismos

presentes en dos placas de Petri, una destapada y la otra cubierta, por un tiempo
determinado. Posteriormente se incubarán en las condiciones adecuadas para
determinar si hubo crecimiento. La placa que estará cubierta tiene como finalidad la
demostración de la poca penetración de la luz UV.
Procedimiento
1. Inocular 2 cajas de Petri, por estría en toda la superficie del agar utilizando
un hisopo, con un cultivo de Escherichia coli de 24- 48 horas.
2. Colocar las cajas de Petri inoculadas, una destapada y la otra tapada por un
espacio de 10 a 60 min, en la campana de flujo laminar con la luz UV
encendida. Al terminar el tiempo de exposición tapar la caja y llevar a incubar
las 2 cajas a 35° C por 24 horas.
3. Observar el crecimiento en las cajas y registrar sus resultados.
4. Comparar los resultados obtenidos en los diferentes tiempos de exposición
El hisopo se manejará como material sucio. Las cajas se envuelven en papel y se
esterilizan junto al hisopo en autoclave.
Al finalizar el proceso de esterilización los restos de agar se depositan en bolsa roja
en el contenedor correspondiente y el hisopo en bolsa roja en el contenedor de
material no anatómico.
La muestra problema una vez esterilizada se tira en el drenaje.
34
Práctica No. 14
Preparación de DNA genómico
Objetivo
Introducir al estudiante en el manejo de las técnicas de preparación y extracción de
DNA genómico a partir de bacterias.
Aislar el DNA genómico de una cepa de E. coli.
Introducción
En la medicina legal, en algunas pruebas diagnósticas y diversos procedimientos
de clonación, por mencionar algunas técnicas de uso actual, se requiere el análisis
molecular, por tanto, es necesario disponer de DNA genómico de buena calidad.
En la práctica, es posible obtener DNA casi de cualquier muestra, sólo se requiere
la presencia de células en buen estado. Si se tiene posibilidad de obtener diferentes
muestras del mismo organismo, deberá seleccionarse aquella que sea menos
invasiva para la persona, o bien, aquella con la que sea más sencilla la manipulación
y extracción.
Las técnicas de preparación de DNA son métodos indispensables en la
manipulación del material genético, y estas varían ligeramente dependiendo de la
fuente y las características del DNA. En ocasiones, según el tipo de muestra a
disposición, es necesario efectuar un pre-tratamiento para facilitar o mejorar el
rendimiento.
La muestra más comúnmente utilizada es la mucosa bucal, debido a su facilidad de
obtención ya que solo requiere el uso de un hisopo y solución salina estéril. Sin
embargo, puede utilizarse sangre con anticoagulante, células en cultivo, tejido
fresco, fijado en formol o incluido en parafina.
En la actualidad es raro que se realice aislamiento del núcleo previo a la extracción,
porque en la mayoría de los casos el DNA mitocondrial no causa problemas. Es
fundamental crear un medio libre de nucleasas, debiendo controlarse las posibles
fuentes de contaminación, como las disoluciones, el material, las propias células
bajo estudio, además de las enzimas que porte el experimentador.
Fundamento
Las técnicas de purificación de DNA se basan en la lisis de las membranas
celulares, la separación de las proteínas asociadas al DNA y finalmente en la
precipitación del DNA del medio acuoso.
Procedimiento
1. Inocular 5 ml de medio LB contenidos en un tubo de ensayo de 16 x 150 con
10 μl de E. coli e incubar a 37 ºC toda la noche con agitación vigorosa (150
a 200 rpm).
- NOTA: Este paso puede ser omitido, es posible que los auxiliares del
laboratorio preparen previamente el cultivo y esté listo el día de la práctica.
Es importante evitar la degradación de los ácidos nucleicos, procesando lo
más pronto posible las muestras. Si por algún motivo no es factible, las
muestras deben refrigerarse entre 4 y 8 ºC por unos días aunque la cantidad
de DNA extraído disminuirá.
35
2. Agregar 1.5 ml del cultivo a un tubo Eppendorf de 1.5 ml, centrifugar 1 minuto
a 8000 rpm. Decantar el sobrenadante cuidando de no agitar el paquete
celular.
3. Añadir 150 μl de la solución amortiguadora de lisis TSNT, mezclar
porinversión hasta resuspender la pastilla.
4. Agregar 150 μl de solución de fenol y mezclar por inversión.
5. Agregar 100 μl de Sevag y agitar en el Vortex por 10 segundos.
6. Agregar 100 μl de buffer TE 1X y agitar nuevamente por 10 s en el Vortex.
7. Centrifugar 5 min a 14 000 rpm. Transferir la fase acuosa a un tubo
Eppendorfde 1.5 ml nuevo.
8. Agregar 1 ml de Etanol absoluto, mezclar suavemente por inversión hasta
homogenizar la solución.
- NOTA: Es posible que al mezclar se observen algunas fibras blancas.
Centrifugar 3 min a 14 000 rpm, decantar el sobrenadante cuidando de no
desprender la pastilla DNA formada al fondo del tubo.
- NOTA: Es recomendable retirar el sobrenadante con una micropipeta o
mediante vacío ya que se dejan menos residuos y tarda menos en secarse
la pastilla.
9. Secar colocando el tubo abierto cerca de un mechero encendido.
10. Resuspender la pastilla de DNA en 400 μl de TE 1X.
11. Añadir 5 μl de la solución de RNAsa e incubar a 37 ºC por 5 min.
12. Añadir 50 μl de la solución de acetato de amonio 10 M.
13. Agregar 1 ml de Etanol absoluto y mezclar suavemente por inversión.
14. Centrifugar 3 min a 14 000 rpm y decantar el sobrenadante.
15. Agregar 500 μl de Etanol al 70 % y mezclar por inversión.
16. Repetir los pasos 9 y 10.
17. Resuspender en 20 a 50 μl de agua ultrapura estéril.
18. Almacenar en refrigeración entre 4 y 8 ºC.
- NOTA: Normalmente el profesor se encarga de reunir todas las muestras y
llevarlasa refrigeración.
Los decantados del cultivo de E. coli se esterilizan en autoclave junto con el
remanente del cultivo, posteriormente se desechan en el drenaje y el material se
lava.
El material contaminado que haya entrado en contacto con materia biológica se
dispone en el contenedor de residuos biológicos, posteriormente se esterilizará y
desechará.
El material que haya entrado en contacto con fenol se desecha en el contenedor
para residuos tóxicos y cancerígenos (Colector E).
El sobrenadante que se genera en los pasos 9, 15 y 17 se coloca en el contenedor
para residuos tóxicos e inflamables no halogenados (Colector C).
36
Práctica No. 15
Análisis de DNA
Objetivo
Determinar la calidad y concentración del DNA obtenido la práctica anterior, por
electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría UV.
Introducción
Los métodos de análisis de DNA por espectrofotometría y por electroforesis en gel
se emplean frecuentemente para determinar la calidad y concentración de DNA en
una preparación.
Ambas técnicas son rápidas y sencillas, solo que la espectrofotometría UV no es
muy confiable si la muestra contiene como contaminantes otros ácidos nucleicos,
además del de interés. Adicionalmente, la electroforesis permite separar, identificar
y purificar fragmentos de DNA que no pueden ser separados por otros
procedimientos.
Fundamento
Análisis de DNA por espectrofotometría
Este método se basa en la propiedad del DNA de absorber energía radiante a
260nm. La concentración de ácidos nucleicos en la muestra se calcula de acuerdo
a las siguientes consideraciones: DO = 1 corresponde aproximadamente a 50 μg/ml
DNA de doble cadena, 40 μg/ml DNA de cadena sencilla y 30 μg/ml DNA de
oligonucleótidos.
Para determinar la concentración del DNA, efectuar el siguiente cálculo:
[DNA] en ng/μl = (Factor de dilución)(50)(DO260)
Factor de dilución = Volumen total/Volumen de muestra
La calidad del DNA de la preparación se estima mediante la relación de las

absorbancias a 260 nm y a 280 nm (DO260/DO280). Una preparación con un alto
grado de pureza se caracteriza por presentar valores de la relación DO260/DO280
entre 1.8 y 2, valores menores a 1.8 indican la presencia de contaminantes tales
como proteínas, valores mayores indican contaminación con fenol u otros
contaminantes, y la cuantificación de ácidos nucleicos por este método es
inadecuada. En dado caso, se recomienda realizar una purificación adicional de la
muestra y repetir el análisis por espectroscopia, de esta manera, el valor es más
exacto y confiable.
Análisis de DNA por electroforesis en gel

El método se basa en el desplazamiento diferencial de las moléculas del DNA en
una matriz sometida a un campo eléctrico. Si la muestra contiene impurezas o la
cantidad de DNA es muy pequeña, la cuantificación puede realizarse colocando en
un gel de agarosa diferentes cantidades de un estándar de DNA, además de la
37
muestra a analizar, y posteriormente se compara la intensidad de fluorescencia

emitida por éstos en el gel de agarosa al teñirlo con bromuro de etidio.
Análisis de DNA por inducción de fluorescencia

Después de la separación, la localización del DNA en la matriz o gel puede
determinarse directamente mediante una tinción con un colorante intercalante a
baja concentración, como el bromuro de etidio o SYBR Green para inducir
fluorescencia en las moléculas separadas. Al observar el gel así teñido en el UV se
pueden detectar bandas que contienen cantidades tan bajas como 10 ng de DNA
de doble cadena.
Procedimiento
Análisis de DNA por Espectrofotometría
1. Preparar una dilución 1:1000 de la preparación del DNA en agua ultrapura.
2. Calibrar el espectrofotómetro a cero con agua ultrapura.
3. Realizar lecturas a 260 y 280 nm de la dilución preparada.
4. Calcular la concentración de la preparación mediante el factor de conversión.
5. Determinar la pureza de la muestra, mediante la relación de absorbancias a
260 y 280 nm (DO260/DO280).
Análisis de DNA por electroforesis en gel y fluorescencia

Preparación de geles de agarosa
1. Agregar en un matraz Erlenmeyer la cantidad necesaria de agarosa y TBE
0.5X para formar un gel al 0.8 %.
- NOTA: La solución no debe ocupar más del 30 al 50 % del volumen del
matraz.
2. Calentar la mezcla en un horno de microondas o un baño de agua caliente,
agitar constantemente hasta que la agarosa se disuelva por completo.
3. Vaciar la solución en el molde una vez que se haya enfriado por debajo de
los 60 ºC. Inmediatamente después colocar el peine evitando que haya
burbujas entre cada diente.
- NOTA: El grosor típico del gel para este tipo de análisis es de 5 a 10 mm. Se
deberá tomar en cuenta que la capacidad del pocillo en donde se depositará
la muestra está determinada por el grosor del gel y la anchura del peine.
4. Después de 20 a 40 minutos a temperatura ambiente, retire el peine y los
extremos del molde.
- NOTA: El tiempo necesario puede variar según la temperatura ambiente, por
tanto es más confiable observar que el gel este ligeramente opaco o
blanquecino.
5. Coloque el gel con cuidado en la cámara de electroforesis y agregue
suficiente solución TBE 0.5X para cubrir el gel con una profundidad no mayor
a 1 cm. Evite la presencia de burbujas de aire atrapadas entre el gel y la
cámara, así como en los pocillos formados por el peine.
- NOTA: Este punto puede variar según el modelo de la cámara de
electroforesis empleada, en algunas cámaras es posible formar el gel sin
necesidad de moldes; sin embargo, es de suma importancia que la superficie
38
sea completamente horizontal, ya que los resultados pueden ser afectados

por la inclinación.
Generalmente los auxiliares del laboratorio se encargan de la preparación del
gel.
Aplicación de la muestra y estándares en el gel de agarosa y electroforesis

1. Mezclar en la superficie de una tira de papel parafilm, 9 μl de la muestra de
DNA con 1 μl de jugo azul 6 X.
2. Para determinar la concentración del DNA por esta técnica, colocar diferentes
estándares de concentración conocida (p. ej. 100, 200, 300, 400 ng de DNA).
3. Depositar lentamente las muestras en los pocillos del gel usando una
micropipeta,
4. Aplicar una corriente eléctrica entre 8 y 10 V/cm.
- NOTA: Se observará la formación de burbujas en los electrodos; al poco
tiempo será observable la migración y separación de los colorantes que
componen el jugo azul. El punto para dar por finalizada la electroforesis, es
cuando el primer colorante ha recorrido tres cuartas partes de la longitud del
gel, por lo tanto, el tiempo quetarde también es dependiente de la longitud
del mismo.
Tinción
1. Sumergir el gel de 10 a 15 min en la solución de bromuro de etidio.
2. Lavar el gel con agua destilada para eliminar el exceso de bromuro de etidio.
- NOTA: Este paso puede ser omitido, según la consideración del profesor.
3. Colocar el gel en el transiluminador a 260 nm, las bandas del DNA se
observan en color entre naranja o rosa.
- NOTA: Evite la exposición directa a los ojos y la piel; utilice la protección
adecuada ya que la luz UV además de ser cancerigena, puede producir
quemaduras en lostejidos expuestos.
4. Comparar la intensidad de la fluorescencia entre la banda de la muestra
problema y los estándares a fin de determinar la concentración de DNA.
- NOTA: Es posible que se observe un barrido de intensidad variable a lo largo
de los carriles, este barrido puede deberse a la degradación del DNA durante
el aislamiento o bien, por la presencia de ácido ribonucleico residual.
El material contaminado con DNA se dispone en el contenedor de residuos
biológicos, posteriormente se esterilizará y desechará.
El agua de lavado del gel teñido con bromuro de etidio, así como el gel, los guantes
usados para la tinción y el papel secante con el que limpia la superficie del
transiluminador, son colocados en el contenedor para residuos tóxicos y
cancerígenos (Colector E).
39
Práctica No. 16
Reacciones con enzimas de restricción
Objetivos
Digerir DNA plasmídico con enzimas de restricción.
Preparar un marcador de peso molecular empleando el fago lambda.
Analizar el patrón de restricción por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Introducción
Las enzimas de restricción (ER) reconocen secuencias específicas de DNA y cortan
ambas hebras en lugares específicos. La presencia de éstas es característica y
probablemente exclusiva de bacterias y otros microorganismos, ya que constituye
uno de sus mecanismos de defensa frente a la invasión de determinados
bacteriófagos. El DNA propio del microorganismo está metilado, de manera que está
protegido contra la acción de sus propias enzimas de restricción.
A fin de simplificar su nomenclatura, se ha desarrollado un sistema que consiste en
la abreviación del nombre del organismo del que se aisló originalmente, seguido de
un número romano que indica el sistema de restricción y modificación al que se
refiere, en el caso de que el organismo posea varios. Por ejemplo: Escherichia coli
RY 13, se denomina EcoRI.
Estas enzimas reconocen secuencias de 4 a 8 nucleótidos, que suelen ser
palindrómicas, es decir, tienen el mismo sentido cuando se leen en la misma
dirección en cada cadena, por ejemplo:
G AATTC
CTTAAG
Cuando las concentraciones osmóticas no son las óptimas, la actividad de la enzima

puede verse alterada, por ejemplo, EcoRI reconoce normalmente G/AATTC, pero
bajando la concentración de sal y sustituyendo el ion magnesio por manganeso,
reconoce solamente AATT y se denomina actividad estrella (RI*).
Cuando dos enzimas de restricción reconocen total o parcialmente la misma
secuencia, se denominan isoesquizómeros y, aunque el sitio de reconocimiento sea
el mismo, el sitio de escisión puede variar.
SalI XhoI
Las unidades de actividad enzimática son medidas usualmente con DNA lambda
como sustrato, usando el buffer recomendado por el fabricante. La mayoría de las
digestiones se realizan a 37 ºC.
Una reacción típica con enzimas de restricción contiene, además del DNA a cortar
y la enzima, soluciones amortiguadoras y en ocasiones albúmina sérica bovina
(BSA). Todas requieren Mg2+ como cofactor, y la mayoría es activa en un rango de
40
pH entre 7.0 y 8.5. La diferencia principal es su dependencia de la concentración

iónica y preferencia catiónica, que determina la solución amortiguadora a usar. La
mayoría de las compañías que se dedican a vender este tipo de enzimas, incluyen
en sus catálogos tablas que informan la actividad de la endonucleasa en
amortiguadores estandarizados con concentración iónica variable. Esta es una
información muy valiosa para el biólogo molecular que usa gran cantidad de
endonucleasas y que realiza digestiones múltiples de manera simultánea.
Fundamento
Las enzimas de restricción hidrolizan el enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos de
una secuencia específica de una cadena del DNA y los equivalentes de la otra
cadena.
Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima requerida para digerir
1 μg de DNA en 1 h en el buffer de reacción y temperatura recomendados en 20 μl
de reacción.
Sitios de restricción en la secuencia de DNA de Fago  y los plásmidos pGLO y

pBR322.
Numero
Secuencia de
Enzima de Posición
reconocimiento
cortes
EcoRI 1 2063 g/aattc
PstI 2 2106; 3181 ctgca/g
pGLO
421; 438; 1622; 1771; 2077;

RsaI 7 gt/ac
2942; 4944
PstI 1 3611 ctgca/g
pBR322
RsaI 3 165; 2281; 3846 gt/ac

185; 707; 894; 1041; 1236;
FauI 10 cccgc
1501; 1767; 1953; 2189; 2199
21226; 26104; 31747; 39168;
EcoRI 5 g/aattc
44972
2560; 2824; 3629; 3644; 3860;
4374; 4713; 4913; 5124; 5218;
Fago Lambda
5686; 8524; 9617; 9781;

PstI 28 11767; 11839; 14298; 14385; ctgca/g
16085; 16235; 17394; 19837;
20285; 22425; 26932; 32009;
32256
Procedimiento
1. Definir la cantidad de DNA a cortar.
2. Calcular la cantidad de enzima necesaria.
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- NOTA: El volumen final para las reacciones de digestión habitualmente es de

20 μl; el volumen de buffer de reacción suele ser el 10 % del volumen final,
sin embargo, esto puede variar según el proveedor de la enzima. Entre otras
consideraciones, la cantidad de enzima no debe ser superior al 10 % del
volumen final, ya que el glicerol que contiene el buffer de conservación puede
llegar a inhibirla, debe ser conservada a -20 ºC y durante su manipulación
debe mantenerse fría. El volumende agua puede variar para ajustarse a los
20 μl.
Si se desea hacer una digestión con más de una enzima a la vez, es posible
hacerlo si las enzimas trabajan en el mismo amortiguador; de no ser así, la
enzima que funciona en el amortiguador de menor concentración iónica debe
ser usado primero. Posteriormente, debe agregarse la cantidad apropiada de
sales para la segunda enzima y la incubación debe continuar. Una alternativa
a este método es la precipitación del DNA digerido, y proceder con la
siguiente enzima.
3. Agregar en un tubo de reacción lo siguiente (preferentemente en el orden
que se indica): agua, amortiguador, BSA (si es requerida), DNA y enzima.
- NOTA: A modo de ejemplo, se anexa la siguiente tabla. Las oncentraciones
delamortiguador y de la enzima pueden variar según el proveedor.
Reactivo Concentración Volumen (l) Conc. Final

Agua ultrapura estéril 15.8
Amortiguador 10X 2.0 1X
DNA 0.5 g/l 2.0 50 ng/l
Enzima 10 U/l 0.2 U/g DNA
4. Incubar a la temperatura apropiada y por el período de tiempo requerido

(usualmente 37 ºC por 30 a 60 min).
- NOTA: En general, las digestiones por períodos de tiempo largos o con
exceso de enzima no causan problemas, a menos que hubiese
contaminación con DNA’sas oexonucleasas. En ocasiones, la cantidad de
enzima puede ser disminuida incrementando el tiempo de incubación.
5. Inactivar la enzima.
- NOTA: La mayoría de las enzimas son inactivadas al someterlas por 15 min
a unatemperatura superior a los 65 ºC, esto puede variar según la enzima de
la que setrate.
6. El DNA digerido puede ser analizado directamente en gel, o bien puede
serpurificado primero y después analizado.
Los tubos Eppendorf con el producto de la digestión se guardan en refrigeración a
4ºC para la siguiente práctica.
El material contaminado con DNA se dispone en el contenedor de residuos
biológicos, posteriormente se esterilizará y desechará.
El gel, los guantes usados para la tinción y el papel secante con el que limpia la
superficie del transiluminador, son colocados en el contenedor para residuos tóxicos
y cancerígenos (Colector E).
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Práctica No. 17
Transformación de E. coli con el gen de la proteína verde fluorescente
Objetivo
Transformar una cepa de E. coli con el gen codificante para la proteína verde
fluorescente (GFP).
Calcular la eficiencia de transformación.
Estudiar la regulación de la expresión génica por inducción enzimática.
Introducción
En la transformación genética, se modifica el genoma de un organismo al
incorporarle un gen homo o heteroespecífico. Este gen conferirá al organismo una
nueva característica fenotípica.
La transformación genética se usa en muchas áreas de la Biotecnología:
En Agricultura se pueden transformar plantas con genes que codifican para
características tales como frutos más turgentes, plantas resistentes a patógenos y
al ataque de insectos.
En Biorremediación, las bacterias pueden transformarse con genes que les den la
capacidad de digerir o metabolizar hidrocarburos o aceites.
En medicina, las enfermedades ocasionadas por genes defectuosos están
empezando a ser tratadas por Terapia Génica; esto es, por transformación genética
de las células de la persona enferma con copias saludables (normales) del gen
defectuoso que causa la enfermedad.
Siguiendo el procedimiento de transformación, la bacteria expresará el gen
adquirido de la medusa Aequorea victoria, codificado en el plásmido pGLO,
confiriéndole la capacidad de fluorescer al ser expuesta a la luz UV debido a la
producción de la proteína verde fluorescente.
Fundamento
El método de transformación empleado se basa en la inducción de competencia
mediante sales de calcio, lo cual modifica temporalmente la permeabilidad de la
membrana celular y permite introducir el gen a la bacteria.
El plásmido pGLO además del gen codificante para la GFP, incluye un gen de
resistencia a ampicilina y una secuencia reguladora de la expresión génica, que
puede usarse para controlar la expresión por inducción. De esta manera, al
adicionar arabinosa al medio de cultivo se iniciará el proceso de transcripción y
traducción del gen.
Para determinar la eficiencia de transformación se requiere determinar el número
total de colonias verde fluorescente en la placa de LB/amp/ara al exponerla a la luz
UV y la cantidad de DNA pGLO en las células bacterianas inoculadas en la placa.
Eficiencia de transformación = # total de colonias .

Cantidad de DNA por placa
43
Esta cantidad de DNA pGLO se determina multiplicando la cantidad de DNA total

(g) por la fracción de DNA depositada en la placa:
DNA pGLO (g)= Cantidad total DNA usado (g) X Fracción de DNA
La cantidad total de DNA usado se obtiene multiplicando el volumen empleado de

plásmido por su concentración. En una asada, que es lo que se adiciona de DNA
pGLO hay 10 l y la concentración del plásmido es 0.08 g/l. La cantidad total de
DNA pGLO usado es de 0.8 g.
La fracción de DNA depositada en la placa o usada se calcula con la siguiente
fórmula:
Fracción de DNA usado = Volumen inoculado en la placa .

Volumen total del tubo de transformación
Procedimiento
1. Marcar un tubo Eppendorf cerrado como +pGLO y otro como –pGLO.
2. Agregar 250 l de solución de CaCl2 en cada tubo.
3. Colocar los tubos en baño de hielo.
4. Transferir una colonia de la placa con E. coli a cada tubo usando un asa
estéril. Girar el asa hasta lograr la dispersión completa de la colonia.
5. Colocar en baño de hielo nuevamente.
6. Examinar la solución del plásmido bajo luz UV. Registre sus observaciones.
7. Añadir la solución del pGLO (0.08g/l) empleando un asa estéril.
- NOTA: Revisar que en el anillo del asa haya quedado una película de la
solución.
8. Mezclar el contenido del asa en la suspensión celular del tubo marcado como
+pGLO. Cerrar el tubo y volver a colocarlo en el baño de hielo.
- NOTA: No añadir solución del pGLO al tubo marcado con –pGLO.
9. Incubar los tubos por 10 min a 4 ºC.
- NOTA: Es muy importante revisar que el contenido de cada tubo se
encuentre por debajo del nivel del hielo.
10. Mientras los tubos se están incubando, marcar cuatro cajas Petri de la
siguiente forma:
- Caja con LB/amp: +pGLO
- Caja con LB/amp/ara: +pGLO
- Caja con LB/amp: –pGLO
- Caja con LB: –pGLO
11. Colocar ambos tubos en un baño de agua a 42 ºC, por exactamente 50
segundos.
- NOTA: Es muy importante cerciorarse que el contenido de cada tubo esta
por debajo del nivel de agua, este paso es de suma importancia, ya que el
choque térmico favorece la entrada del plásmido a la célula.
12. Incubar los tubos en baño de hielo por 2 minutos.
- NOTA: Para obtener los mejores resultados de transformación la
transferencia del hielo a 42 ºC y el regreso al hielo debe ser lo más rápido
posible.
44
13. Agregar 250 l de caldo LB a cada tubo.

- NOTA: Es recomendable cambiar de punta a la micropipeta para evitar la
contaminación cruzada entre ambos tubos.
14. Incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.
15. Mezclar suavemente el contenido de los tubos.
16. Transferir 100 l de cada tubo a las cajas con agar en el medio apropiado
(+pGLO en LB/amp y LB/amp/ara y –pGLO en LB y LB/amp).
17. Extender la suspensión usando un asa estéril para cada placa.
- NOTA: No ejercer demasiada presión sobre el agar para evitar que se
rasgue.
18. Apilar las cajas, marcar con sus datos e incubar en posición invertida por 24
h a 37 °C.
19. Observar el crecimiento, las características de las colonias y su fluorescencia
al exponer a la luz UV.
- NOTA: Contar el número de colonias para poder determinar la eficiencia de
transformación.
desechará.
45
Práctica No. 18
Aislamiento de DNA Plasmídico por Lisis Alcalina
Objetivo
Introducir al estudiante en el manejo de las técnicas de preparación y extracción de
DNA plasmídico a partir de bacterias.
Aislar un plásmido a partir de las bacterias transformadas la práctica anterior,
mediante la técnica de lisis alcalina.
Introducción
Los plásmidos son moléculas de DNA bicatenario superenrollado, generalmente
circulares aunque también existen lineales, sin forma extracelular. Su tamaño varia
de 1 a varios kilo pares de bases, típicamente son menores a la veinteava parte del
tamaño de un cromosoma.
En circunstancias normales un plásmido determinado no es indispensable para la
célula hospedera, por ejemplo, en ocasiones durante la división celular se forma
una célula hija sin plásmido y esta célula casi siempre es viable. Sin embargo,
muchos plásmidos contienen genes que pueden ser ventajosos para el organismo
hospedero bajo ciertas condiciones.
Entre los fenotipos conferidos por los diferentes plásmidos se encuentran los
siguientes:
- Resistencia a antibióticos
- Producción de antibióticos
- Degradación de compuestos orgánicos complejos
- Producción de enterotoxinas
- Producción de enzimas de modificación y restricción
Varios métodos han sido desarrollados para aislar y purificar DNA plasmídico a
partir de bacterias. Estos métodos involucran las siguientes etapas:
Propagación: El plásmido se replica en el organismo hospedero. En esta etapa se

cultiva la bacteria en un medio líquido que contiene el antibiótico apropiado, el cual
ha sido inoculado con una colonia obtenida a partir de un cultivo en caja de Petri
con agar con antibiótico.
Lisis: Las bacterias se concentran por centrifugación y son lisadas por uno de los
métodos existentes, entre los cuales se incluye el tratamiento con detergentes
iónicos y no iónicos, solventes orgánicos, álcalis o calor. La elección entre estos
métodos es determinada principalmente por el organismo a tratar y el tamaño del
plásmido entre otros factores.
Plásmidos grandes, susceptibles a sufrir daños, deben de liberarse a partir de las

células con un tratamiento suave. La bacteria se suspende en una solución
isosmótica de sacarosa y luego es tratada con lisozima y EDTA para romper la
membrana externa. Los esferoplastos resultantes son lisados agregando un
detergente como el SDS. Este método minimiza las fuerzas físicas requeridas para
liberar el plásmido a partir del interior presurizado de la bacteria.
46
Métodos más severos pueden ser usados para aislar plásmidos pequeños.
Después de la adición de EDTA, y en algunos casos lisozima, las células se
exponen a detergentes y son lisadas por calentamiento o tratamiento con álcali.
Purificación de DNA plasmídico: Es necesario eliminar los componentes celulares
mediante ultracentrifugación, precipitación o extracción con solventes. Otros ácidos
nucleicos, más específicamente RNA es eliminado utilizando RNAsas.
Fundamento
El método de lisis alcalina se basa en la capacidad del DNA plasmídico de resistir
la desnaturalización alcalina con NaOH - SDS (solución de lisis II). Al agregar una
solución con una alta concentración de sales, una gran cantidad de proteínas y otros
componentes celulares se desnaturalizan precipitándose. Los plásmidos
permanecen en solución y son fácilmente recuperados del sobrenadante por
centrifugación. El resto de los componentes orgánicos se extraen con fenol y el RNA
es eliminado con un tratamiento de RNA’sa libre de DNA’sa. Finalmente el DNA es
recuperado por precipitación con etanol.
La modificación de la extracción alcalina descrita en esta práctica es simple y rápida,

permite el análisis de muchas muestras pequeñas y suficientemente puras para
posterior tratamiento con enzimas de restricción, transformación, subclonación y
secuenciación.
En esta modificación, el acetato de sodio o potasio ha sido sustituido por acetato de

amonio para facilitar la separación de proteínas, membranas y RNA junto con
ribonucleoproteínas del DNA del plásmido, además se elimina la extracción con
fenol, evitando el riesgo y generación de desechos tóxicos.
Procedimiento
1. A 4 ml de medio LB contenidos en tubos de ensayo de 16 X 100, agregar 16
l de ampicilina 25 mg/ml (antibiótico requerido a 100 g/ml).
2. Inocular con una colonia de las placas donde efectuó la selección la práctica
anterior o con 10 l de E. coli con pBR322 o pGLO conservada en glicerol e
incubar toda la noche a 37 ºC con agitación vigorosa.
- NOTA: Los primeros dos pasos pueden ser omitidos, es posible que los
auxiliares del laboratorio preparen previamente el cultivo y esté listo el día de
la práctica.
3. Concentrar 3 ml del cultivo por medio de dos centrifugaciones sucesivas en
tubos Eppendorf de 1.5 ml (5 000 rpm por 1 min).
4. Resuspender en 100 l de Solución de Lisis I.
5. Agregar 250 l de la Solución de Lisis II y mezclar suavemente por inversión
10 veces.
6. Agregar 250 l de Acetato de Amonio 10 M frío (4 ºC) y mezclar suavemente
por inversión 10 veces.
7. Centrifugar a 14 000 rpm por 5 min.
8. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
47
9. Agregar 800 l de isopropanol y mezclar por inversión hasta que se

homogenice la solución.
11. Decantar el sobrenadante, lavar la pastilla por inversión con 500 l de etanol
al 70% (v/v).
- NOTA: Es recomendable retirar el sobrenadante con una micropipeta o
mediante vacío ya que deja menos residuos y tarda menos en secarse la
pastilla.
13. Colocar los tubos abiertos cerca del mechero para secarlos.
14. Disolver la pastilla en 100 l de TE 1X.
15. Añadir 5 μl de la solución de RNAsa e incubar a 37 ºC por 5 min.
16. Añadir 50 μl de la solución de NH4OAc 10 M.
17. Agregar 500 μl de Etanol absoluto y mezclar suavemente por inversión.
18. Centrifugar 3 min a 14 000 rpm y decantar el sobrenadante.
19. Agregar 500 μl de Etanol al 70 % y mezclar por inversión.
20. Repetir los pasos 12 y 13.
21. Resuspender en 20 a 50 μl de agua ultrapura estéril.
22. Almacenar en refrigeración entre 4 y 8 ºC.
- NOTA: La solución de DNA algunas veces es turbia. En ese caso, deberá
realizarse una centrifugación corta (1 min a 14 000 rpm), no es necesario
desechar la pastilla formada, ya que no interfiere con el tratamiento posterior
que se haga.
Normalmente el profesor se encarga de reunir todas las muestras y llevarlas
a refrigeración.
Disposición de Residuos
desechará.
Los sobrenadantes que contienen alcoholes se desechan en el contenedor para
residuos tóxicos e inflamables no halogenados (Colector C).
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50

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Vaselina Gotita del

2. Coloque el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando de que la

3. Invierta cuidadosamente el portaobjetos de manera que el cubreobjetos

4. Para hacer la observación se sugiere enfocar primero el borde de la gota con

Después de depositar adecuadamente la muestra en un portaobjetos limpio y

Se conocen diferentes tipos de fijadores, entre los cuales están:

Existen dos tipos de tinciones simples:

- La tinción directa, donde se tiñe la pared del microorganismo resaltando la

- La tinción negativa o indirecta, donde se tiñe el campo y los microorganismos

2. Con la ayuda de un gotero, cubra el frotis con solución colorante. Si se

Muestra con colorante

4. Deje secar al aire.

Para la realización de la técnica, se utilizan dos colorantes, un mordiente y un

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Tinción de cápsulas mediante la técnica de Anthony

No sintéticos o Complejos: son aquellos que no se conoce su composición química

De acuerdo con su consistencia se conocen tres tipos de medios de cultivo:

El agente solidificante que se emplea comúnmente es el agar agar a una

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