UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PUEBLA

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
MICROBIOLOGIA GENERAL 4 BA

Reporte: Identificacin de hongos filamentosos

Equipo: Elizabeth Jurez Hernndez 101300130 Nstor Alfonso Castillo Prez 101300023 Esmeralda Yazmn Soriano Pea 101300001

Profesora: Mara del Transito Borraz

17 noviembre 2011

Identificacin de hongos filamentosos

Introduccin:

Los mohos u hongos filamentosos se encuentran en todo lugar, tanto al aire libre como en interiores. Existen muchas especies, que son especies microscpicas del reino fungi que crecen en formas de filamentos pluricelulares o unicelulares. Crecen cualquier tipo de condiciones climticas, pero su crecimiento es mejor en condiciones clidas y hmedas; se reproducen y propagan mediante esporas. Las esporas del moho pueden sobrevivir en variadas condiciones ambientales, incluso en extrema sequedad, si bien sta no favorece su crecimiento normal. Tambin pueden presentarse en los alimentos como el pan o frutas, los cuales pueden presentarse en su forma pluricelular o como levaduras. Los hongos tienen una gran importancia econmica, no tan slo por su utilidad, sino tambin por el dao que pueden causar. Los hongos son responsables de la degradacin de gran parte de la materia orgnica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre. Los efectos perjudiciales de los hongos estn contrarrestados por su utilizacin industrial, ya que son la base de muchas fermentaciones como la combinacin de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son tambin la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), cidos orgnicos (ctrico, lctico), antibiticos, quesos especiales (Camembert, Roquefort), entre muchas otras aplicaciones. Uno de los usos mas importantes de los hongos es la penicilina (cuyo nombre deriva del hongo Penicillium), la cual es un antibitico, el cual fue descubierto por Alexander Fleming en 1929.

Objetivo: Aislamiento e identificacin de hongos filamentosos del ambiente mediante micro cultivos. Preparacin de medios de cultivo para hongos (V8 y sabouraud) Recolectar, sembrar y aislar hongos. Visualizacin de las estructuras reproductoras mediante la tcnica de la cinta Tcnica de micro cultivo y conservacin de las muestra Identificacin de hongos por sus estructuras (principalmente reproductoras)

Material: Agar Bacterilogo Agar sabouraud Asa bacteriolgica en punta Portaobjetos Cubreobjetos Matraz erlenmeyer Azul de algodn Palitos de madera Parrilla de calentamiento Azul de lacto genol Pinzas para portaobjetos Mechero bunsen Papel estraza Tripie Tela de asbesto Gasas Algodn Barniz Balanza Hoja para bistur Autoclave Papel encerado Esptula Placas p100 Placas p60 Alcohol Maskin tape Diurex Cubre bocas Agua Perilla Microscopio Probeta Plumn permanente Encendedor Jugo V8 Frasco Bistur Servitoallas Fenol 5% Guantes Papel aluminio Pipeta Pasteur Tijeras

Mtodos: *Medios de cultivo Los medios de cultivo consisten en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de microorganismos. Segn qu se quiera hacer crecer, el medio requerir unas u otras condiciones. Para la preparacin de medios slidos se requiere de la pre disolucin del agar, llevndolo a ebullicin, y con movimiento continuo para garantizar homogeneidad. En caso de V8 son necesarios 17 g. de agar bacteriolgico y 200 ml de jugo comercial V8 por cada litro de agar (el jugo debe descontarse del volumen total, por lo tanto son 800 ml de agua). Y para el sabouraud son 65 g. por litro. Adems para su manejo se requiere de un tapn poroso elaborado de algodn y gasa, el cual cierre perfectamente, de manera que se logre su manipulacin, y de un gorro de papel estraza para cubrir la boca del matraz durante la esterilizacin. Se lleva al autoclave, el cual debe contener agua previamente, ya que se esteriliza mediante calor hmedo a 121C y 1 bar de presin durante aproximadamente 15 minutos, tras enfriarse el autoclave lo suficiente se puede sacar para su posterior uso. (El proceso mara material es parecido, solo debe envolverse en papel estraza)

* Manipulacin de placas (al verter)

El tener un buen manejo de las placas nos sirve para tener una mayor seguridad de que permanezcan estriles o no se contaminen con un microorganismo no deseado, por eso se deben de seguir una serie de pasos los cuales son los siguientes: 1. Es necesaria una rea estril de trabajo ya sea una campana de flujo laminar o en un rea ms reducida como seria si se ocupan mecheros bunsen pero igual de efectiva 2. Tener el agar esterilizado y perfectamente sellado con un tapn de gasas y algodn cerca del rea de esterilidad 3. Tomar una placa nueva y esterilizada con una mano de preferencia la izquierda, sostenerla con los ltimos 3 dedos y con el dedo pulgar e ndice tomar la tapa de la placa para abrirla y con la otra mano tomar el medio ya esterilizado en el matraz retirando con los dos ltimos dedos el tapn para abrir y verterlo lentamente hasta la marca de cada placa. (Todo cerca del mechero si se usa) 4. Tapar la placa y dejar que enfri y se gelifique 5. Sellarla y guardarla para su posterior inoculacin. RECOMENDACIN: Dejar enfriar el medio lo suficiente para que no genere burbujas de agua en la placa pero no demasiado para que se gelifique en el matraz. Si se ocupa mechero bunsen tener cuidado con la flama esto podra quemarnos o quemar el material si no se tiene precaucin.

*Sembrar hongos y aislamiento de hongos El proceso de sembrar hongo es una tcnica muy sencilla porque solo se necesita de un hongo ya sea que hubiera crecido en materia orgnica o en un agar general de hongos, la condiciones de esterilidad en la siembra deben se ptimas para evitar contaminacin por otro microorganismo, se recomienda el uso de cubre bocas. 1. Con ayuda de una aza bacteriolgica en punta se esteriliza en la llama del mechero y se enfra en el agar de la placa limpia y estril. 2. Se raspa un par de veces la superficie del hongo que se quiere sembrar y diferenciar y se abre la placa donde se coloca la punta del aza en el centro del agar estril y se siembra (inocula), el aza debe dirigirse lo mas derecha posible, y solo introducirse un par de milmetros, evitando que sobrepase el agar. 3. Se cierra y se sella, promoviendo su crecimiento en temperaturas entre 20 y 25 C. Si el nico microorganismo en desarrollarse es la especie del hongo en especfico se considera que se ha aislado * Tcnica de la cinta adhesiva 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de azul de metileno. 2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm. 3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentracin de esporas. 4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos. 5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro. 6. Observar al microscopio

* Microcultivo Esta tcnica nos sirve para conocer la caracterizacin de estructuras somticas y reproductivas para identificar morfolgicamente a los hongos fitopatgenos. Se requiere de material completamente estril El practicante deber usar cubre bocas y guantes. 1. Con un bistur estril se cuadricula el medio de cultivo de la caja Petri con agar sabouraud en cuadros de aproximadamente 1 cm. Este paso se realiza en una mesa de trabajo en condiciones aspticas. 2. En una mesa de trabajo en condiciones aspticas, con la ayuda de un bistur estril, uno de los cuadros de se transfiere al portaobjetos que est en la cmara de microcultivo; este portaobjetos debe de estar sobre el tringulo de palitos. 3. Con un asa bacteriolgica estril se lleva el inoculo a las 4 orillas del cuadro de agar, el inoculo debe ser de una sepa aislada posteriormente en agar sabouraud. 4. Se coloca el cubre objetos sobre el cuadro de agar inoculado, procurando que quede bien centrado. 5. Se agregan 2ml de agua estril con ayuda de una pipeta, en el fondo de la cmara de microcultivo para mantener la humedad, sin mojar el rea de crecimiento del hongo. 6. Los pasos 1-5 se llevan a cabo dentro de una mesa de trabajo en condiciones aspticas (mecheros bunsen) 7. Se sella el dispositivo de microcultivo con cinta masking tape y se rotula. El crecimiento del hongo se checa cada 24 horas. Posteriormente de haber pasado el tiempo necesario para el crecimiento de hongo en el microcultivo se procede a desmontarlo para la preparacin de las muestras para su observacin. Con ayuda de un asa bacteriolgica se desprende el cubre objetos del microcultivo (tambin retirar restos de agar si queda en el porta o cubre objetos) y se coloca sobre otro porta objetos estril que se le agreg una gota del colorante azul de lacto fenol, ya colocada se deja escurrir el colorante para posteriormente quitar el exceso del mismo, a continuacin el porta objetos se queda en el microcultivo se le agrega una gota del mismo colorante y se toma con una mano y se le coloca un cubre objetos estril, se limpia con fenol al 5% para inactivar esporas para que no se convierta en un riesgo biolgico en su siguiente paso que es el de la observacin, las muestras a observar si an tienen burbujas de aire se deben colocar sobre una parrilla durante lapsos de tiempo pequeo menos de 3 segundo si est a un temperatura elevada as saldrn las burbujas y quedaran fijadas mejor, por ltimo se aseguran con barniz transparente para que estn fijas y se puedan almacenar para su observacin.

*Identificacin de hongos filamentosos. Si bien la estructura microscpica es decisiva para la clasificacin, las caractersticas visibles son muy importantes debido a que, a simple vista, el aspecto de las colonias es a veces tan caracterstico que le permite identificar enseguida el tipo de hongo. Sin embargo, es indispensable para la clasificacin final determinar las peculiaridades del hongo al nivel microscpico que presentan estos microorganismos.

- De las colonias de hongos aislados, tomar nota de sus caractersticas: Forma, aspecto del micelio (algodonoso, aterciopelado u otro), pigmentacin, elevacin, consistencia, etc. AL TENER UNA MUESTRA DE MICROCULTIVO - Se observan al microscopio las diferentes caractersticas de las estructuras, hifas, filaides conidios y sobre todo esporas, con lo cual se comparar con la generalizacin de las especies en busca de la que ms se aproxime. Ver anexo 1.

Esquema de trabajo:

Resultados y Discusin: Tras todo el proceso citado anteriormente se obtuvieron los siguientes resultados: Microcultivo 1 Elizabeth Nstor Esmeralda No creciEpidermofito Tricofito Microcultivo 2 Penicillium Fusarium Cladosporium Microcultivo 3 Cladosporium Tricofito Epidermofito

a)

b) c) a) Colonias de hongos filamentosos aislados en agar V8 (lnea superior) y sabouraud (lnea inferior). a) Colonias de Elizabeth b) Colonias de Nstor c) Colonias de Esmeralda

*Penicillium

Es un hongo filamentoso que presenta conidiforos tabicados de pared lisa (200-300 m), ramificado al final, con mtulas (8-12 m) y filides en forma de botella (7-12 m), donde nacen conidios lisos, elipsoidales (2,5-4 m) azules verde-azulados en cadenas, sin ramificar, con un penacho o pincel caracterstico. Sus colonias son de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37 C) .Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia. El reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin abundante. Olor especiadoafrutado (manzana o pia). El Penicillium es un gnero grande y encontrado casi por todas partes, y siendo comnmente el gnero de hongos ms abundante en suelos. La fcil proliferacin de los Penicillium en los alimentos es un problema. Algunas especies producen toxinas y pueden hacer el alimento no comestible o an peligroso. Por otra parte otras especies de Penicillium son beneficiosas para los seres humanos. Los quesos tales como el roquefort, brie, camembert, stilton, etc. se crean a partir de su interaccin con algunos Penicillium y son absolutamente seguros de comer. La penicilina es producida por el hongo Penicillium chrysogenum, un moho ambiental.

*Cladosporium Gnero perteneciente a la familia-forma Demaciceas (Orden forma Moniliales, Subdivisin Deuteromicotinas) que engloba a unas 40 especies, algunas de ellas fitopatgenas y la mayora saprofitas sobre vegetacin o sobre el suelo. Es un gnero que se distribuye en todo el mundo. Es ampliamente citado como productor de asma y esporosis, e incluso algunas de sus especies actan como oportunistas y son capaces de intervenir en ciertos procesos micticos pulmonares, atacar la piel, producir cromo blastomicosis y lesiones neurotrpicas.

Cladosporium forma en cultivo colonias de color olivceo y a veces grises o marrones; aterciopeladas, flocosas o pelosas; a veces presenta estromas. Sus conidiforos son macronematosos o semimacronematosos simples o poco ramificados, con una coloracin marrn o verdosa, y de superficie lisa o ligeramente granulosa en algunas especies. Muchas de sus especies poseen ramoconidios con o sin septos. La clula conidigena es poliblstica, generalmente integrada y simpodial; da lugar a conidios que generalmente quedan en cadenas acrpetas, o a veces se presentan solitarios; poseen pared lisa, verrugosa o equinada, hialina a pigmentada, de color olivceo a marrn obscuro. Poseen un tamao aproximado de 3-7 x 2-4 micras. Este gnero fue identificado tanto por las caractersticas de su colonia, y por sus estructuras, que a pesar de parecerse a varias, la determinacin final fue tomada dado que la muestra se visualiza pigmentada en tonos verdes *Epidermofito Epidermophyton es un gnero de hongos causantes de micosis superficiales y cutneas, incluyendo a E. floccosum, causal de la Tinea corporis (tia), Tinea cruris, Tinea pedis (pie de atleta), y onicomicosis o Tinea unguium, una infeccin fngica del lecho de la ua. Las colonias son de color amarillo marrn a verde oliva o caqui gris de la parte delantera. Al reverso son de color naranja a marrn con un borde amarillo ocasionales, con textura plana y granulosa inicialmente y se radialmente estriado y aterciopelado por el envejecimiento. Las colonias se convierten rpidamente en suaves y estriles. Microscpicamente son septadas, hialino hifas, macroconidias, y, en ocasiones, las clulas chlamydoconidium-como se visualizan. Su identificacin fue complicada, dado que la principal caracterstica son las esporas o conidios, y en los dermatofitos se presentas hasta despus de aproximadamente 2 semanas, estas no estaban presentes, sin embargo la forma de la colonia y las hifas nos dieron este resultado.

*Fusarium
Es un extenso gnero de hongos filamentosos ampliamente distribuido en el suelo y en asociacin con plantas. La mayora de las especies son saprofitas y son unos miembros relativamente abundantes de la microbiota del suelo. Las esporas del hongo son fcilmente reconocibles al microscopio por su forma de media luna o de canoa. Sus colonia son de color blanco con tonos violeta, que a medida que envejece se tornan ms fuertes. Reverso de la colonia de color rosado plido. Algunas especies producen micotoxinas en los cereales y que pueden afectar a la salud de personas y animales si estas entran en la cadena alimentaria. Son patgenos facultativos, capaces de sobrevivir en el agua y suelo alimentndose de materiales en descomposicin. Son importantes agentes de contaminacin en los laboratorios de

microbiologa diversas especies del gnero Fusarium causan infecciones en humanos, tanto superficiales como sistmicas llamadas en general filariosis. Entre otras: queratomicosis, onicomicosis, infecciones cutneas, enfermedad de Panam. De acuerdo a la actividad solubilizadora de fosfato podran existir cepas con un uso potencial como bioinsumo en la elaboracin de biofertilizantes. Al observar en el microscopio las muestra se descubrieron las estructuras en forma de media luna adems de haber observado previamente la colonia y su color caracterstico blanco con tonos rosas, que a medida que envejece se tornan ms fuertes, con esto podemos concluir que el hongo observado es un fusarium ya que ningn otro tiene estas caractersticas especificas *Tricofito Trichophyton es un gnero de hongos que se caracterizan por el hecho de que desarrollan micro y macroconidios de paredes lisas. En la mayor parte de los casos, los macroconidios estn adheridos lateralmente y directamente a la hifa o en cortos pedicelos. Pueden ser de paredes gruesas o delgadas, clavados a fusiformes, y de 4 a 8 por 8 a 50 um de tamao. Los macroconidios son pocos o estn ausentes en muchas especies. Trichophyton es un hongo queratinoflicos filamentoso que tiene la capacidad de invadir los tejidos queratinizados as. Del nmero total de especies, once son comnmente asociados con la tia del cuero cabelludo, las uas y la piel en los seres humanos, mientras que slo cuatro estn a menudo aislados de los animales. Adems, Trichophyton especies pueden causar infecciones invasivas en pacientes inmunocomprometidos. Al observase las estructuras macroscpicas dio indicios de ser un Trichophyton ya que presentaba una textura algodonosa y un poco cerosa con un color blanco al frente de la placa y un color obscuro al reverso, al contrario de la estructura microscpica fue un poco ms difcil tomar una conclusin ya que las estructuras reproductoras de este hongo son visibles hasta los 14 das.

Conclusiones: Para la identificacin de hongos filamentosos fue necesario aprender otras tcnicas bsicas que son usadas durante el proceso, siendo la culminacin de estas el microcultivo, el cual se puede considerar una buena tcnica para este propsito. Los hongos son identificados por sus estructuras macro y microscpicas, las cuales son conservadas gracias a su previo aislamiento y cultivo.

Se lograron identificar 5 hongos diferentes de 9 muestras (uno no creci y tres se repiten) hasta el genero, con lo cual, en general se logro el objetivo.

Bibliografa: www.ecologia.unam.mx/.../Prctica%204%20%20Medios%20de%20... bvs.sld.cu/revistas/mgi/vol17_6_01/mgi09601.pdf www.uco.es/aerobiologia/hongos/cladospo.htm www.datuopinion.com/penicillium www.doctorfungus.org/ www.solociencia.com/biologia/microbiologia-microorganismos-industria.htm Microbiologa, Prescott Lasing 2000 McGraw Hill Interamericana Dra. Gloria M. Gonzlez G.Dpto. MicrobiologaFac. Medicina, UANL. Mtodos Bsicos en el Laboratorio de Micologa Identificacin de Hongos Filamentosos

Anexo1: