EXTRACCIÓN DE ADN (Ácido desoxirribonucleico)

INTRODUCCIÓN
La extracción de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad
posible del ADN de alto peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y
otros inhibidores de enzimas.
Diferentes métodos de extracción han sido descritos para el aislamiento de
ácidos nucleicos, aquí se trabajara específicamente con la extracción de AND
vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren
estos en el aislamiento del ADN.
En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extracción,
es necesario degradarla empleando métodos físicos o químicos. Los métodos
físicos son los más empleados, especialmente la congelación y la maceración.
Para bacterias y células desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas
en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares.
Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y
soluciones de alta (o baja) fuerza iónica para permitir que el ADN se libere en
el buffer.
La inhibición de nucleasas es un factor critico, esta se alcanza empleando
buffer1 con pHs poco óptimos para acción de estas enzimas y adicionando
agentes quelantes de iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato).
Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las
proteínas del ADN como fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es
precipitado con alcohol y centrifugación. El ADN libre de proteínas y otros
compuestos celulares se disuelve en un buffer2 .
Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacáridos, para
separarlos de los ácidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer
extracción o sustancias como CTAB ( cetil trimethyammonium) que colabora
en la precipitación del ADN.
El pH durante el proceso de extracción debe ser óptimo, que evite la acción de
enzimas degradativas del ácido nucleico. La mayoría de los procedimientos
de extracción de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0-9.0.
Para cuantificación del ADN se hace uso de la espectrofotometría
(absorbancia a una longitud de honda de 260nm), o la observación directa con
fluorescencia después de teñir el gel de extracción con bromuro de
etidio.(método de saram wrap, método del plato de agarosa, método del minigel)
o por fluorometria.
OBJETIVO
Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena
calidad y alta pureza.
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Material del que se extrae el DNA ( se recomienda utilizar material fresco),
bisturí, mortero, balanza analítica, tubos de ensayo con tapa, centrífuga
refrigerada, baño agua (60 °C), pipetas de 5 ml, micropipetas y puntas, tubos
eppendorf, espectrofotómetro.
Buffer 1
• 50mM Tris-HCl (pH8.0)
• 5mM EDTA
• 350mM Sorbitol
• 0.1% Mercaptoetanol
• 10% polyetilienglicol
Buffer 2
• 50 mM Tris- HCl (pH 8.0)
• 5 mM EDTA
• 350 mM Sorbitol
• 0.1% Mercaptoetanol
• 1% Sodio Sarkosyl
• 710 mM NaCl
• 0.1% Cetiltrimetilamonio. (CTAB)
Otros reactivos
Cloroformo, alcohol Isoamilico, iIsopropanol, etanol 70%
PROCEDIMIENTO No. 1
• Pesar 70mg del tejido, llevarlo a mortero y macerar.
• Agregar 1ml de buffer1por cada 70mg de la muestra
• Agitar
• Centrifugar a 5000 rpm /10min en frió a 4°C
• Descartar sobrenadante
• Resuspender sólido agregando 500μl del buffer2 por cada 70mg de la
muestra.
• Incubar a 60 °C por 15 minutos
• Adicionar un volumen de cloroformo: alcohol isoamilico en una
proporción 24:1
• Centrifugar a 5000rpm/10mit
• Transferir la fase acuosa a otro tubo
• Agregar 2 volúmenes de isopropanol frió -20 °C (para precipitar el ADN)
• Centrifugar y eliminar el Alcohol (isopropanol)
• Lavar con Etanol 70%
• Centrifugar y eliminar el Alcohol (etanol)
• Resuspender el precipitado en 300μl de Tris-Edta, agitar suavemente.
• Leer espectrofotómetro a 260nm. (50μg/ml ADN absorbancia de 1)
Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido realizamos la siguiente
relación
ADN/Proteina =260nm/280nm
Un valor menor de 1.8 indica contaminación por proteínas.