UNIVERSIDAD AUTÓNOMA

DEL BENI
“JOSÉ BALLIVIÁN”
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
CARRERA BIOQUÍMICA Y FARMACIA

TEMA: ‘‘ELISA NO COMPETITIVO’’

INTEGRANTES: MAURICIO LANGUIDEY VILCHES

GLORIA ANGELA SALVATIERRA
JOSE CARLOS SEDAMANO YUMACALE
YUSARA JALDIN HURTADO
MARITSA MOSUA DURI
CARMEN ROSA MUSUA DURI

DOCENTE: DRA. ROMY JANINE FARAH CABRAL

ASIGNATURA: INMUNOLOGIA II

SEMESTRE: SEPTIMO SEMESTRE

GESTION:

2022
 ELISA NO COMPETITIVO
ELISA NO COMPETITIVO Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase
sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado
reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.
Dentro de los no competitivos tenemos, los directos que detectan antigenos y los indirectos que detectan
anticuerpos.
Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)
Los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA, Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay) utilizan
antígenos o anticuerpos conjugados con una enzima, de forma que, además de mantener su actividad
inmunológica, tengan actividad enzimática.
El uso de enzimas como marcadores de anticuerpos o de antígenos ha tenido como consecuencia la aparición
de numerosos métodos inmunoenzimaticos capaces de reemplazar, en muchos casos, a los métodos
inmunológicos que utilizaban otros marcadores, como los fluorocromos o los isótopos radiactivos.
Características generales
Uno de los componentes de la reacción (antígeno o anticuerpo) está marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte (técnica hetero-génea). De esta forma, la reacción antígeno-anti-cuerpo queda inmovilizada
en el soporte y puede ser fácilmente revelada mediante la adición de un sustrato especifico que tras la
actuación de la enzima produce un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.
El soporte
El soporte debe ser inmunoadsorbente.Uno de los más habituales son las micro placas de poli estireno, que
pueden ser estándares o de alta captación. Estas últimas, además de los grupos hidrofóbicos característicos de
este material, tienen una fina red e grupos hidrofilicos capaces de establecer puentes de hidrógeno.
Las enzimas
Las enzimas más utilizadas para marcar antígenos anticuerpos en las reacciones de LSA son la fosfatasa
alcalina y la peroxidasa de rábano y, en menor grado, la β-galactosidasa.
Estas enzimas son muy estables si se almacenan y manipulan adecuadamente (pueden almacenarse a 4 ℃
durante más de seis meses). Están disponibles comercialmente tanto en forma de enzima libre o como
conjugados con algunos antígenos y anticuerpos. Así mismo, existen diversos sustratos comercializados para
cada una de ellas.
Dos propiedades delas enzimas que es necesario tener en cuenta son:
El impedimento estérico. La enzima se debe unir a un antígeno o a un anticuerpo, y tras esta conjugación
ambas moléculas deben mantener su actividad: el antígeno o el anticuerpo tienen que ser capaces de formar
inmunocomplejos, y la enzima de unirse a su sustrato. Si alguna de las moléculas es muy grande o dos puntos
de unión están muy próximos, se produce un impedimento estérico que hace imposible alguna de las
reacciones.
Debido a su tamaño, la β-galactosidasa, causa con frecuencia impedimento estérico.
La relación de conjugación. Cuantas más moléculas de enzimas se puedan conjugar con cada molécula de
anticuerpo, mayor será la intensidad de la señal.
El sustrato
Se usa sustratos cromogenicos (cromógenos) que son compuestos incoloros inicialmente y se colorean de
forma evidente después de la reacción enzimática para cuantificar la reacción se mide la variación de densidad
óptica que se produce.
Uno de los cromógenos más utilizados en las técnicas de ELISA es la ortofenilendiamina (OPD)

Operaciones básicas de las técnicas ELISA

Hay una serie de pasos comunes a las distintas técnicas ELISA:
El tapizado. Es la adsorción de los antígenos o anticuerpos, conjugados o no, en el soporte. El método más
común consiste en diluirlos en tampón carbonato a pH 9,6, colocar la dilución sobre el soporte e incubar
durante 3 h a 37℃ o 16h a 4°C. El pH utilizado favorece la fijación de las proteínas al soporte.
El bloqueo o postapizado. Se hace mediante la adición de una proteína irrelevante, para evitar fijaciones
inespecíficas. Se puede usar por ejemplo,BSA (albúmina sérica bovina).
La conjugación. Es la unión de los antígenos o anticuerpos con la enzima que actúa como marcador. Algunos
antígenos o anticuerpos conjugados con enzimas están comercializados, pero también se pueden preparar en
el laboratorio. Para hacerlo se usa un agente puente entre ambos elementos, que suele ser el glutaraldehído o
el m-peryodato sódico.
Las incubaciones y los lavados. En distintas fases se adicionan anticuerpos y/o antígenos para que, si su
molécula complementaria está fijada al soporte, se formen inmunocomplejos que a su vez queden fijados. Los
anticuerpos y/o antígenos sobrantes se eliminan mediante lavados. Como solución de lavado se suele usar
solución salina o PBS con Tween 20.

No competitivos: ELISA directo para la detección de antígenos

1. Tapizado Fijación al soporte insoluble de la muestra problema en la que se quiere detectar los antígenos, así
como lavado para eliminar los restos de la muestra y los antígenos no fijados
2. Adición de los conjugados que en este caso son anticuerpos específicos para los antígenos que son objeto
de estudio, marcados con una enzima.
3. Incubación y lavado. Si hay antígenos en el soporte, los anticuerpos marcados se unirán a ellos. Tras el
tiempo establecido, se realiza un lavado para eliminar los conjugados que no se hayan fijado.
4. Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima que obra como marcador.
5. Incubación en oscuridad hasta el desarrollo de color.
6. Frenado de la reacción mediante la adición de una solución de frenado.
7. Lectura visual o espectrofotométrica del producto final coloreado.

No competitivos: ELISA indirecto para detección de anticuerpos

1. Tapizado. Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio y
lavado para eliminar los antígenos no fijados.
2. Adición de la muestra en la cual se quieren detectar los anticuerpos.
3. Incubación y lavado. Si hay anticuerpos en la muestra, estos se unirán a los antígenos del soporte. Tras el
tiempo establecido, se realiza un lavado para eliminar los restos de la muestra y los anticuerpos que no se
hayan fijado.
4. Adición de los conjugados, que en este caso son anti-anticuerpos específicos para los anticuerpos objeto de
estudio, marcados con una enzima.
5. Incubación y lavado los conjugados reaccionarán con los anticuerpos específicos añadidos en el paso
anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Tras el tiempo establecido, se realiza un lavado para
eliminar los anti-anticuerpos marcados que no se hayan fijado.
5. Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima que obra como marcador.
6. Incubación en oscuridad hasta el desarrollo de color.
7. Frenado de la reacción mediante la adición de una solución de frenado.
8. Lectura visual o espectrofotométrica del producto final coloreado.

No competitivos: ELISA sándwich DAS (Double Antibody Sandwich) para detección de antígenos
1. Tapizado. Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos para el antígeno o agente patógeno
objeto de estudio y lavado para eliminar los anticuerpos no fijados.
2. Adición de la muestra en la cual se quiere detectar los antígenos.
3. Incubación y lavado. Si hay antígenos en la muestra, estos se unirán a los anticuerpos del soporte. Tras el
tiempo establecido, se realiza un lavado para eliminar los restos de la muestra y los antígenos que no se hayan
fijado.
4. Adición de los conjugados, que en este caso son anticuerpos específicos del antígeno objeto de estudio,
marcados con una enzima. Es recomendable que estos anticuerpos reconozcan un epitopo diferente al
reconocido por los anticuerpos con los que se ha tapizado el soporte, aunque también pueden ser los mismos
anticuerpos que se han usado para el tapizado.
5. Incubación y lavado. Los anticuerpos marcados reaccionarán con los antígenos específicos presentes en la
muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos insolubilizados sobre el soporte. Tras el
tiempo establecido, se realiza un lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no se hayan fijado.
6. Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima que obra como marcador.
7. Incubación en oscuridad hasta el desarrollo de color.
8. Frenado de la reacción mediante la adición de una solución de frenado.
9. Lectura visual o espectrofotométrica del producto final coloreado.

No competitivos: ELISA sándwich HADAS (Double Antibody Sandwich) para detección de antígenos
1. Tapizado. Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos para el antígeno o agente patógeno
objeto de estudio obtenido de una especie animal ( por ejemplo, del raton) y lavado para eliminar los
anticuerpos no fijados.
2. Adición de la muestra en la cual se quiere detectar los antígenos.
3. Incubación y lavado. Si hay antígenos en la muestra, estos se unirán a los anticuerpos del soporte. Tras el
tiempo establecido, se realiza un lavado para eliminar los restos de la muestra y los antígenos que no se hayan
fijado.
4. Adición de los anticuerpos específicos. Para el antígeno objeto de estudio obtenido de una especie animal
Distinta a la usada para el tapizado (por ejemplo conejos)
5 Incubación y lavado. Los anticuerpos reaccionarán con los antígenos específicos presentes en la muestra
que se encuentran fijados a los anticuerpos insolubilizados sobre el soporte. Tras el tiempo establecido, se
realiza un lavado para eliminar los anticuerpos que no se hayan fijado.
6 Adición de los conjugados, que en este caso son anti-anticuerpos específicos para los anticuerpos añadidos
en el punto 4 (si se han usado anticuerpos de conejos, aquí se adicionaran inmunoglobulinas,
antiimunoglobulinas de conejo)
7. Incubación y lavado. Los anti-anticuerpos marcados reaccionarán con los anticuerpos añadidos en el punto
4 (que están unidos al antígeno, que a su vez está unido a los anticuerpos que están fijados en la placa). Tras el
tiempo establecido se realiza un lavado para eliminar los Anti-anticuerpos que no se hayan unido
8 Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima que obra como marcador.
9 Incubación en oscuridad hasta el desarrollo de color.
10 Frenado de la reacción mediante la adición de una solución de frenado.
11 Lectura visual o espectrofotométrica del producto final coloreado.