CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLOGICO INDUSTRIAL Y DE

SERVICIOS N° 12

PROYECTO DE LABORATORIO N° 1.

TECNICAS DE DETRMINACION DE LA HORMONA TSH

INTEGRANTES

Elizabeth Arredondo Sandoval

José de Jesús Del Toro Ortiz

Jesús Guerra Hernández

Anette Mariana Hernández Valencia

Yulissa Cristina Mendoza Aguilera

GRUPO 6”B”

JIQUILPAN MICHOACÁN, MÉXICO. MARZO DE 2015

1
RESUMEN

En este proyecto hablaremos brevemente del campo de estudio de la

endocrinología la relación entre el sistema endocrino, nervioso y como en conjunto
regulan el organismo.
El sistema inmunológico es nuestro principal fuente de ataque en contra de los
patógenos al entrar un agente extraño se inició un proceso de reconocimiento y
defensa qué termina producción de inmunoglobulina las cuales tienen la
capacidad de unirse al anticuerpo.
Existen diferentes métodos para la detección y cuantificación de la reacción
antígeno anticuerpo también llamadas inmunoensayo. Los inmunoensayos pueden
ser: Por la técnica de medición
Competitivo: el Antígeno (Ag) objeto de la medición compite con un antígeno
marcado por un anticuerpo (Ac). Se mide por la cantidad del antígeno marcado sin
conjugar que se considera es inversamente proporcional al analito.
No competitivo (llamado también tipo sándwich): el Ag de la muestra reacciona
con dos Ac diferentes que se fijan a distintas partes del Ag . Uno de los Ac
generalmente está en soporte sólido para facilitar la separación de la fracción
ligada, y el otro Ac lleva la marca. Se mide por la cantidad del marcador
considerando que es directamente proporcional a la cantidad del analito.
Por el medio donde se realiza la medición
Homogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del antígeno y
el anticuerpo se mide directamente en el mismo medio que se utiliza para
favorecer la formación del complejo inmune.
Heterogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del antígeno y
el anticuerpo se mide en un medio diferente que el utilizado para la unión del
complejo inmune, generalmente implican una etapa intermedia de lavado para
eliminar interferencias.
Se considera que los inmunoensayos con formato homogéneo no competitivo son
los más sensibles y específicos.
Por el marcador
Radioinmunoensayo (RIA) : el marcador es un isótopo radioactivo.
Enzimoinmunoanálsis (EIA): el marcador es una enzima como por ejemplo la
técnica de enzimoinmunoensayo conocido por su abreviatura ELISA.
Fluoroinmunoanálisis: el marcador es una molécula fluorescente.
Ensayo Inmunoquimioluminiscente: la marca es en general una enzima capaz de
catalizar una reacción quimioluminiscente.

2
ABSTRAC
In this project we briefly survey the field of endocrinology the relationship between
the endocrine, nervous system as a whole governing body.
 The immune system is our primary source of attack against pathogens entering a
foreign agent a process of recognition and defense which ends immunoglobulin
production which have the ability to bind to the antibody was started.
There are different methods for the detection and quantification of the antigen-
antibody reaction also called immunoassay.
 Immunoassays can be:
For the measurement technique
Competitive: the antigen (Ag) to be measured competes with a labeled antigen by
an antibody (Ab). Measured by the amount of labeled antigen which is considered
unconjugated is inversely proportional to the analyte.
Noncompetitive (also called sandwich): Sample Ag reacts with two different Abs
that bind to different parts of Ag. Ac is one of the generally solid support to facilitate
separation of the bound fraction, and the other is marked Ac. Measured by
considering the amount of the marker which is directly proportional to the amount
of analyte.
For the environment where the measurement is performed
Homogeneous: In this type of test signal generated by the binding of antigen and
antibody is measured directly in the same medium that is used to promote the
formation of immune complex.
Heterogeneous: In this type of test signal generated by the binding of antigen and
antibody is measured in a different medium as used for binding the immune
complex, usually involve an intermediate washing step to remove interference.
It is considered that non-competitive immunoassays homogeneous format are the
most sensitive and specific.
On the net
Radioimmunoassay (RIA): the label is a radioactive isotope.
Enzimoinmunoanálsis (EIA): the label is an enzyme such as enzyme immunoassay
technique known by its abbreviation ELISA.
Fluoroimmunoassay: the marker is a fluorescent molecule, such FPIA.
Test Inmunoquimioluminiscente: the brand is generally an enzyme capable of
catalyzing a chemiluminescent reaction.

3
ÍNDICE

OBJETIVO
INTRODUCCIÓN

ANTICUERPO…………………………………………………………………………...…..8

ANTÍGENO……………………………………………………………………………….....8

ANTICUERPO MONOCLONALES Y POLICLONALES………………………….…..9

PRODUCCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES…………………………….11

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES………………………..….…14

PRODUCCION DE INMUNOENSAYO………………………………………………….21

TECNICAS DE INMUNOENSAYE………………………………………………………21

TIROTROPINA (TSH)…………………………………………………………………….25

TÉCNICA DETERMINACIÓN DE LA HORMONA (TSH)…………………………..26.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA ELISATSH………………………………………………27

CÁLCULO DE LOS RESULTADOS……………………………………………………28.

VALORES ESPERADOS ………………………………………………………………..29

RANGOS DE REFERENCIA NORMALES ……………………………………………30

CURVA DE CALIBRACIÓN TSH ………………………………………………………31

ANALIZADOR DE ELISA………………………………………………………………..32

DISCUSIÓN………………………………………………………………………………..34

CONCLUSIÓN…………………………………………………………………………….34

BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………...35

4
OBJETIVO

En el presente trabajo se tiene como objetivo comprender el proceso de la

producción de anticuerpos policlonales y monoclonales, comprender el proceso de
marcaje de anticuerpos y antígenos con enzimas, comprender cada uno de los
componentes que integran un inmunoensayo y desarrollar la técnica de Elisa para
la determinación de la hormona TSH.

INTRODUCCIÓN:

Los anticuerpos (Ab) o inmunoglobulinas, son glicoproteínas del tipo gamma

globulina. Se encuentran presentes en el plasma y en los tejidos, es producida
como respuesta del sistema inmunitario ante la presencia de una sustancia
extraña llamada antígeno.

Los reactivos para anticuerpo se desarrollan a partir de anticuerpos policlonales

como monoclonales. Los anticuerpos policlonales son derivados de diferentes
líneas de células B, son una mezcla de inmunoglobulina, secretados en contra de
un antígeno específico, cada una reconociendo diferentes epitopes. Habitualmente
se obtienen de lo que se denomina un antisuero policlonal. Obtenido de la
inyección reiterada de un antígeno en un animal como puede ser ovejas, conejos,
o cabras. Del animal se toma una muestra de sangre y de esta muestra es
obtenido el suero que finalmente es purificado para obtener la variedad de
anticuerpos policlonales de interés.

Un anticuerpo monoclonal (AcMo) es un anticuerpo homogéneo producido por una

célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una
sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral. Una ventaja de los
AcMo es que la línea celular hibridoma que los produce es potencialmente
“inmortal” y que puede producir los mismos anticuerpos en forma constante e
indefinida. Los anticuerpos monoclonales se diferencian de los anticuerpos
policlonales en que son muy específicos para un epítope simple en un antígeno
multivalente

Para detectar la presencia anticuerpo-antígeno conocido como inmuno-complejo,

utilizamos un inmunoensayo, esta prueba usa complejos de anticuerpo y antígeno
como medio para generar un resultado perceptible. Los inmunoensayos utilizan un
anticuerpo selecto o más para detectar analitos de interés. Los analitos que se
miden pueden ser aquellos que están presentes en el cuerpo naturalmente tal
como una hormona tiroidea de la que hablaremos a continuación, aquellos que el
cuerpo produce pero no están típicamente presentes como un antígeno de cáncer,
o aquellos que naturalmente no existen en el cuerpo por ejemplo una droga de
abuso.

5
En los inmunoensayos, ambos anticuerpos monoclonales y policlonales se utilizan
para detección de antígenos, cada uno con fortalezas específicas para
aplicaciones particulares. Es probable que los inmunoensayos que detectan
anticuerpos en sueros de pacientes supongan la detección de anticuerpos
policlonales generados por el sistema inmunológico del paciente.

La secreción de hormonas tiroideas está mediada directamente por mecanismos

de regulación del hipotálamo. Cuando el organismo se ve en la necesidad de
aumentar los niveles de hormonas tiroideas, el hipotálamo envía señales
neuroendocrinas a la adenohipofisis induciendo la secreción de TSH, dicha
hormona viaja por el torrente sanguíneo hasta la tiroides, donde provoca la
secreción de T3 y T4 al organismo

Las hormonas tiroideas se determinan mediante métodos de ELISA, el cual

consiste en el uso de antígeno y anticuerpos marcados con una enzima de forma
que el complejo antígeno-anticuerpo tenga actividad inmunológica y enzimática.
Dicho complejo quedará inmovilizado por un substrato, y gracias a la acción de la
enzima sobre el substrato, producirá un color que lograremos ver mediante la
colorimetría.

ANTICUERPO

Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una

combinación especifica con el antígeno que ha causado su producción en un
animal susceptible. Ellos son producidos en respuesta a la invasión de moléculas
foráneas en el cuerpo. Los anticuerpos existen como una o mas unidades en
forma de Y, compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. Cada Y contiene dos
copias idénticas de una cadena pesada (HC, heavy chain), y dos copias idénticas
entre sí de una cadena ligera (LC, light chain), llamadas así por sus pesos
moleculares relativos que son de aproximadamente 50kDa la cadena pesada y de
cerca de 25kDa la cadena ligera. Estas cadenas se mantienen unidas mediante
enlaces disulfuros intercatenarios. Estas cadenas pueden separarse por reducción
de los enlaces S-S y acidificación.(1)

ANTÍGENO

La definición clásica de antígeno es cualquier sustancia foránea que elicita una

respuesta inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales
susceptibles y que son capaces de combinar con los anticuerpos específicos
formados. Los antígenos son generalmente de alto peso molecular y comúnmente
son proteínas o polisacáridos. Polipéptidos, lípidos, ácidos nucleicos y otras

6
moléculas pueden también funcionar como antígenos. La respuesta inmune puede
también ser generada contra sustancias pequeñas, llamadas haptenos, si estos
esta acoplados a una proteína acarreadora, como la albúmina de suero bovino
(BSA) u otras matrices sintéticas. Una variedad de moléculas como drogas,
azucares simples, aminoácidos, pequeños péptidos, fosfolípidos o triglicéridos
pueden funcionar como haptenos. Así, dándole suficiente tiempo, cualquier
sustancia foránea será identificada por el sistema inmune y evocara la producción
de un anticuerpo específico. Sin embargo, esta respuesta inmune específica es
altamente variable y depende mucho en parte del tamaño, estructura y
composición de los antígenos. Los antígenos que elicitan una fuerte respuesta
inmune se dice que son altamente inmunogénicos.(4)

ANTICUERPO MONOCLONALES
Y POLICLONALES

Cuando se diseña un procedimiento

experimental, es importante
diferenciar entre anticuerpos monoclonales y policlonales, ya que estas diferencias
son el fundamento de las ventajas y limitaciones en su uso. Muchos de los
anticuerpos usados en técnicas inmunoquímicas son producidos por inmunización
repetida de un adecuado animal, por ejemplo, conejo, cabra u oveja, con una
suspensión del antígeno apropiado. El suero es tomado en el pico de producción
del anticuerpo. Concentraciones específicas de IgG de aproximadamente 1 a
10mg/mL de suero pueden ser obtenidas con este método. Moléculas débilmente
antigénicas pueden requerir la adición de un adyuvante, el cual permite una salida
mas lenta del antígeno haciendo que sea mas rápidamente atrapado por los
macrófagos. Moléculas pequeñas como drogas pueden ser acopladas a
estructuras más antigénicas (proteínas acarreadoras) para estimular la respuesta
inmune.(4)

7
Algunos usos de las propiedades de anticuerpos policlonales son:

• Los anticuerpos policlonales frecuentemente reconocen múltiples epítopes

haciéndolos más tolerantes a pequeños cambios en la naturaleza del antígeno.
Son frecuentemente la opción preferida para la detección de proteínas
desnaturalizadas.

• Pueden ser generados en una variedad de especies, incluyendo conejos,

cabras, ovejas, asnos, gallinas y otros, dándole al usuario muchas opciones en el
diseño experimenta.

• Los anticuerpos policlonales son a veces usados cuando la naturaleza del

antígeno en una especie no estudiada no se conoce.

• Los anticuerpos policlonales se une a múltiples epítopes y así ellos

generalmente proveen una detección más robusta.(1)

Algunos usos y propiedades de anticuerpos monoclonales son:

• Debido a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son excelentes como

anticuerpos primarios en un ensayo, o para detectar antígenos en un tejido y

8
frecuentemente dan significativamente menos tinción de fondo que los anticuerpos
policlonales.

• Cuando se compara con los anticuerpos policlonales, la homogeneidad de los

anticuerpos monoclonales es muy alta. Si las condiciones experimentales se
mantienen constantes, los resultados provenientes de anticuerpos monoclonales
son altamente reproducibles entre experimentos.

• La especificidad de los anticuerpos monoclonales los hacen extremadamente

eficientes para la unión al antígeno dentro de una mezcla de moléculas
relacionadas, como para el caso de la purificación por afinidad.(1)

PRODUCCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

La producción de anticuerpos monoclonales se estableció con la tecnología

creada en 1975 por Georges Köhler y César Milstein, que consistía en la
generación de una línea celular estable, secretora de un isotipo determinado de
inmunoglobulina contra un antígeno específico, fruto de la fusión de dos células
diferentes por medios físicos y químicos

.La técnica se desarrolló inicialmente utilizando células de ratón, pero en la

actualidad se producen hibridomas a partir de células de varias especies,
incluyendo la humana.

9
Inmunización

Para la inmunización es conveniente el uso de preparaciones puras de antígeno

en las cuales el peligro de competencia antigénica, que pudiese desviar la
respuesta inmune humoral hacia una molécula irrelevante, no existe.

La inmunización se realiza rutinariamente mediante la inyección M antígeno por

vía subcutánea o intraperitoneal y en la forma de una emulsión. Ello permite la
liberación lenta y constante del antígeno, asegurando una estimulación
permanente. Se efectúa en múltiples ocasiones, normalmente en intervalos de dos
semanas, para asegurar una buena estimulación y amplificación de los clones de
linfocitos B específicos para el antígeno de interés. La última estimulación
usualmente se hace tres días antes de la fusión y por vía intravenosa para así
obtener, en el bazo del animal inmunizado, una máxima respuesta y una población
de células respondientes en fase de división.

10
Fusión

Consiste en fusionar células linfoides (productoras de anticuerpos) con células de

mieloma (tumorales) en presencia de poli-etilen-glicol (PEG), que provoca la fusión
de las membranas y la formación de híbridos celulares. Las células productoras
del anticuerpo se obtienen a partir de los órganos linfoides periféricos (bazo y/o
ganglios linfáticos) de animales hiper-inmunizados con un antígeno o patógeno
concreto. Las células de mieloma a utilizar deben reunir, al menos, las siguientes
características:

Ser histocompatibles con las células productoras de anticuerpos

• No secretar inmunoglobulinas

• No tener la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT)

Los híbridos resultantes pueden ser de cualquier tipo: Linfocito-Linfocito, Linfocito-

Mieloma o Mieloma-Mieloma. Los que conocemos como hibridomas son los
híbridos Linfocito Mieloma.

Selección

Los hibridomas se recuperan cultivando la mezcla celular anterior en un medio de

cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina es un
inhibidor del ácido fólico, sustancia que interviene en la síntesis de los nucleósidos
y nucleótidos necesarios para la replicación del DNA. En este medio los híbridos
LB-LB y los LB no fusionados mueren, ya que tienen una vida media limitada. Los
híbridos M-M y las células de mieloma no fusionadas mueren por carecer de la
enzima HGPRT. La células que sobreviven son los hibridomas LB-M, que heredan
la capacidad de vivir indefinidamente y capacidad biosintética y capacidad de
producir anticuerpos y sintetizar guanina vía HGPRT de los linfocitos B. HGPRT
participa en la llamada “vía de salvamento”, la cual una célula puede usar la
hipoxantina como precursor de otras bases nitrogenadas.

Tras la selección en medio HAT las células supervivientes se reparten en los

pocillos de placas de cultivo y se incuban para que se produzca su crecimiento.
En aquellos pocillos que presentan un crecimiento adecuado se recogen muestras
del sobrenadante y se analizan en ELISA para ver si contienen anticuerpos
específicos para el antígeno inicial.

11
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES

Anticuerpos policlonales son anticuerpos derivados de diferentes líneas de células

B, los linfocitos encargados de la respuesta ante elementos ajenos (antígenos)
mediante anticuerpos. Los anticuerpos policlonales son una mezcla
de inmunoglobulina, secretados en contra de un antígeno específico, cada una
reconociendo diferentes epitopes.(3)

A partir de un suero policlonal se puede obtener un suero específico para el

antígeno mediante aislamiento y purificación. Estos anticuerpos se producen
típicamente mediante la inoculación de un mamífero adecuado. Un antígeno se
inyecta en el mamífero. Esto induce a los linfocitos B para producir
inmunoglobulinas IgG específicos para el antígeno. Este policlonal IgG se purificó
a partir del suero de mamíferos.(4)

Selección Animal

Los animales utilizados con frecuencia incluyen pollos, cabras, cobayas, hámsters,
caballos, ratones, ratas, y las ovejas. El conejo es el animal de laboratorio más
comúnmente usado para este propósito.

Debe basarse en:

La cantidad de anticuerpo necesaria, la relación entre el donante del antígeno y el

anticuerpo receptor y productor las características necesarias de los anticuerpos
que se hagan. Inmunización y sangrías son el estrés asociado y, por lo menos
cuando el uso de conejos y roedores, se prefieren los animales libres de
patógenos específicos.

Preparación del antígeno

El tamaño, la extensión de la agregación y nacionalidad relativa de todos los

antígenos de la proteína puede afectar dramáticamente la calidad y la cantidad de
anticuerpo producido.

12
 Polipéptidos pequeños y antígenos no proteicos generalmente necesitan ser
conjugados o reticulado, para, proteínas transportadoras inmunogénicas más
grandes para aumentar la inmunogenicidad y proporcionar epítopos de células T.
En general, cuanto mayor sea la proteína inmunogénica es mejor.

Cantidad de antígeno

Selección de la cantidad de antígeno para la inmunización varía con las

propiedades del antígeno y el adyuvante seleccionado.

Los niveles de antígeno de proteína óptimos y habituales para la inmunización de

especies específicas han sido reportados en los siguientes rangos:

Conejo: 50-1000 g

Ratón: 10-50g

Conejillo de indias: 50-500 g

Cabra 250-5000 g.

La afinidad de los anticuerpos en suero aumenta con el tiempo después de la

inyección de mezclas de antígeno-adyuvante y como antígeno en el sistema
disminuye.

Los antígenos deben estar libres de subproductos de preparación y los productos

químicos, tales como el gel de poliacrilamida SDS, urea, endotoxina, partículas y
extremos de pH.

Procedimiento a seguir en el protocolo de inmunización

Día 1 (07-10-2010) Primera inmunización

Objetivos:

• Inocule cada ratón del grupo A, en la cavidad peritoneal, un volumen total de 0,2
ml de emulsión que contiene 100 μg de la proteína recombinante ,(concentración
inicial 1 mg/ml) en presencia de adyuvante completo de Freud (ACF).

1. Identifique los ratones que serán inmunizados colocando una marca, con una
gasa embebida en una solución de ácido pícrico (en la frente, una de las patas,
lomo o abdomen del animal utilizando). Otra manera de realizar el marcaje es
realizando pequeños cortes, previa asepsia, en la oreja y cola del animal.
13
2. Pese los ratones.

3. Lleve en su cuaderno el registro de los datos de identificación del animal: sexo,

peso, marca con ácido pícrico, edad del animal, fecha de nacimiento, fechas de
inmunizaciones, señas particulares del ratón (marca de corte), tipo de
inmunógeno, dosis del inmunógeno, vías de inoculación y desangrado total.

Muestra de sangre

 Extraiga del seno orbital antes de la primera inmunización. Separe el suero,

colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene a -20° C.
 Prepare la emulsión del antígeno junto con el adyuvante
 Cada ratón del grupo A recibirá, en cavidad abdominal, 200 μl de la mezcla
de inmunógeno y adyuvante completo de Freud (proporción 1:1 v/v), que
contiene un total de 100 μg de Pgr24 recombinante.
1. Prepare 1 ml de emulsión de inmunógeno y adyuvante completo de Freud
para inocular los 5 ratones de la caja A, de tal manera que 0.2 ml de emulsión
contenga 100 μg del antígeno.

2. Prepare 1 ml de emulsión con adyuvante completo de Freud y solución salina

para inocular los ratones del grupo B

El procedimiento para preparar la emulsión es el siguiente:

14
 Coloque 0.5ml de la solución de antígeno en una jeringa y en otra jeringa 0.5
ml adyuvante completo y/o incompleto de Freud (ACF). Remueva las agujas.
Elimine las burbujas de aire y conecte ambas jeringas mediante una aguja con
doble conector. Justo antes de la inmunización, la preparación de antígeno
con el ACF (1 ml) haciendo pasar repetidas veces de un lado a otro de las
jeringas la mezcla, ver Cuando la mezcla se torne homogénea y blanca,
desconecte la aguja conector, colóquele una aguja de 21-G y pruebe si la
emulsión es estable. Para ello vierta una gota de la emulsión en 50 ml de 5
agua fría en un vaso de precipitación. Una buena emulsión de agua y aceite
debe mantenerse como una gota aislada sobre la superficie del agua sin
dispersarse. Si la gota se dispersa, continúe emulsificando la mezcla.

Inoculación del antígeno por vía intraperitoneal

1. Inocule los ratones del grupo A, en el área abdominal, dentro de cavidad

peritoneal con 200 μl de emulsión del antígeno y el ACF. El ratón recibirá un total
de 100 μg del antígeno.

2. Inocule cada ratón del grupo B, por vía intraperitoneal, con 200 μl de emulsión
preparada con adyuvante completo de Freud y solución salina estéril

3. Inocule cada ratón del grupo C, por vía intraperitoneal, con 200 μl de solución
salina estéril.

Día 15 (21-10-2010) Segunda inmunización (Primer refuerzo)

Objetivos: Inocule cada ratón del grupo A, por vía intradérmica, un volumen total
de 100 μl de emulsión que contiene 50 μg de la proteína recombinante.

• Inocule cada ratón del grupo B, por vía intradérmica, un volumen de 200 μl de
emulsión que contiene adyuvante incompleto de Freud (ACF) en solución salina.

• Inocule cada ratón del grupo C, por vía intradérmica, un volumen de 200 μl de
solución salina. Muestra de sangre Extraiga una muestra de sangre del seno

15
orbital de los ratones antes de la segunda inmunización. Separe el suero,
colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el suero a -20°C.
Prepare el antígeno junto con el adyuvante

• Prepare 0.5 ml de emulsión de inmunógeno y adyuvante incompleto de Freud

para inocular los 5 ratones del grupo A

Inoculación del antígeno por vía intradérmica

1. Inocule cada ratón del grupo A, en a región dorsal, por vía intradérmica, en
aproximadamente 10 sitios (0.01 ml por sitio), con 100 μl de emulsión que contiene
50 μg del antígeno y AIF.

2. Inocule cada ratón del grupo B, por vía intradérmica, con 100 μl de emulsión
preparada con adyuvante incompleto de Freud y solución salina estéril

3. Inocule cada ratón del grupo C, por vía intradérmica, con 100 μl de solución
salina estéril

Día 22 (04-11-2010): Tercera inmunización (Segundo refuerzo)

Objetivos: 1. Inocule cada ratón del grupo A, por vía subcutánea, un volumen total
de 100 μl de disolución que contiene 50 μg de la proteína recombinante (Pgr24)
purificada de T. cruzi (concentración inicial 1 mg/ml)

Inocule cada ratón del grupo B y C, por vía subcutánea, un volumen de 100 μl de
solución salina. Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el suero
Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera inmunización.
Separe el suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y almacene el
suero a -20°C. Prepare el antígeno

16
Inoculación del antígeno por vía subcutánea

1. Inocule los ratones del grupo A, por vía subcutánea, en cinco sitios diferentes,
con un volumen de 100 μl de solución salina que contiene 50 μg del antígeno.

2. Inocule los ratones del grupo B, y C por vía subcutánea, en cinco sitios
diferentes, con un volumen de 100 μl de solución salina estéril.

Día 37 (18-11-2010) Cuarta inmunización (Tercer refuerzo)

Objetivo: 1. Inocule cada ratón del grupo A, por vía subcutánea, un volumen total
de 100 μl de disolución salina que contiene 50 μg de la proteína recombinante
(Pgr24) purificada de T. cruzi (concentración inicial 1 mg/ml).(2)

Inocule cada ratón de los grupos B y C, por vía subcutánea, un volumen de 100 μl
de solución salina. Extraiga una muestra de sangre de los ratones y prepare el
suero Extraiga una muestra de sangre del seno orbital antes de la tercera
inmunización. Separe el suero, colóquelo en un vial de congelación, rotule el vial y
almacene el suero a -20°C. Prepare el antígeno Prepare el antígeno de la misma
manera que se preparó en la tercera inmunización Inoculación del antígeno por vía
subcutánea - Ver anexo Inocule los tres grupos de ratones, por vía subcutánea y
con la misma dosis que lo hizo en la tercera inmunización (2)

Día 52 (02-12-2010) Obtención de antisuero policlonal

Desangrado de los ratones Sangrado total de los ratones por punción cardiaca a
cielo abierto para obtener sueros inmunes y determinar los niveles de anticuerpos
específicos producidos después de la cuarta inmunización.(3)

PRODUCCION DE INMUNOENSAYO

Un inmunoensayo es una prueba que usa complejos de anticuerpo y antígeno

como medio para generar un resultado perceptible. Un complejo anticuerpo:
antígeno también es conocido como inmuno-complejo. “Inmuno” se refiere a una

17
respuesta inmunológica que hace que el cuerpo genere anticuerpos, y “ensayo” se
refiere a una prueba. Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas
de laboratorio, como las pruebas colorimétricas, ya que usan complejos
anticuerpo: antígeno para generar una señal que pueda medirse.(7)

Técnicas del Inmunoensayo

Los inmunoensayos utilizan un anticuerpo selecto o más para detectar analitos de

interés. Los analitos que se miden pueden ser aquellos que están presentes en el
cuerpo naturalmente (una hormona tiroidea), aquellos que el cuerpo produce pero
no están típicamente presentes (un antígeno de cáncer), o aquellos que
naturalmente no existen en el cuerpo (una droga de abuso). (7)Inmunoensayos
competitivos y no competitivos

La medición del analito en un inmunoensayo se logra usando tanto un formato

competitivo como uno no competitivo En los formatos competitivos, el analito sin
marcar (generalmente antígeno) en la muestra se mide por su capacidad para
competir con un antígeno marcado en el inmunoensayo. El antígeno sin marcar
bloquea la capacidad del antígeno marcado de unirse puesto que ese punto de
unión en el anticuerpo ya se encuentra ocupado.(6)

18
Formato Competitivo

En el formato competitivo de dos pasos, la concentración de anticuerpo del

reactivo se encuentra presente en exceso comparada con la concentración de
antígeno. El reactivo del anticuerpo primero se incuba con una muestra que
contenga antígenos de interés, luego en el segundo paso, se agrega el antígeno
marcado.(6)

19
Técnica No Competitiva (sándwich)

En los ensayos no competitivos, la medición del analito marcado, generalmente un

anticuerpo, es directamente proporcional a la concentración de antígeno presente
en la muestra. Esto puede representarse por medio de una curva de respuesta a
la concentración. El eje X traza la concentración de un antígeno. El eje Y traza la
respuesta, que en este caso se trata de la señal. Así, cuanto mayor sea la
cantidad de antígeno presente, más anticuerpos marcados se unirán. Esta
proporción directa contrasta con la indirecta de los inmunoensayos competitivos
tratados anteriormente.(6)

Técnicas
de Inmunoensayo Homogéneas y Heterogéneas

Las técnicas homogéneas generalmente se han aplicado a la medición de

pequeños analitos como por ejemplo las drogas de abuso y terapéuticas. Debido a
que las técnicas homogéneas no requieren la separación de la unión Ab-Ag* del
Ag* libre, generalmente son más fáciles y más rápidas de realizar.(6)

 Homogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del

antígeno y el anticuerpo se mide directamente en el mismo medio que se
utiliza para favorecer la formación del complejo inmune.
 Heterogéneo: En este tipo de ensayo la señal generada por la unión del
antígeno y el anticuerpo se mide en un medio diferente que el utilizado para
la unión del complejo inmune, generalmente implican una etapa intermedia
de lavado para eliminar interferencias.(6)

20
Se considera que los inmunoensayos con formato homogéneo no competitivo son
los más sensibles y específicos.

Por el marcador

 Radioinmunoensayo (RIA): el marcador es un isótopo radioactivo.

 Enzimoinmunoanálsis (EIA): el marcador es una enzima como por
ejemplo la técnica de enzimoinmunoensayo conocido por su abreviatura
ELISA.
 Fluoroinmunoanálisis: el marcador es una molécula fluorescente, por
ejemplo FPIA.
 Ensayo Inmunoquimioluminiscente: la marca es en general una enzima
capaz de catalizar una reacción quimio luminiscente. Son tanto o más
sensibles que los radioinmunoensayos, y no presentan riesgos de
manipulación de sustancias radioactivas. (6)

TIROTROPINA (TSH)

Denominada también hormona estimulante de la tiroides u hormona tirotrópica

es una hormona producida por la hipófisis que regula la producción de
hormonas tiroideas. (10)

Es secretada por el lóbulo anterior de la hipófisis (adenohipófisis) que aumenta

la secreción detiroxina y triyodotironina.(10)

Esta hormona produce unos efectos específicos sobre la glándula tiroides,

como el aumento de la proteólisis de tiroglobulina (proteína yodada que
proporciona losaminoácidos para la síntesis de las hormonas tiroideas), lo que
hace que se libere tiroxina y triyodotironina a la sangre; el aumento de la
actividad de la bomba de yodo; el aumento de la actividad secretora y del
tamaño de las células tiroideas, y el aumento de la yodación del aminoácido
tirosina, entre otros.(11)

Efectos de la hormona estimulante de la tiroides (tirotropina) sobre la secreción

tiroidea

• La TSH hormona estimulante de la tiroides, aumenta la secreción de

tiroxina y triyodotironina por las glándulas tiroides produciendo la TSH en todas
las actividades de las células glandulares tiroides.

21
 • Aumenta la proteolisis de la tiroglobulina intrafolicular, con lo que aumenta
la liberación de hormona tiroidea hacia la sangre circulante y disminuye la
substancia folicular misma.

• Aumenta la actividad de la bomba de yodo que incrementa el índice de

captación de yoduro en las células glandulares.

• Aumenta la yodación de la tirosina y de su acoplamiento para formar

hormonas tiroideas.

• Aumenta el tamaño y la función secretoria de células tiroideas.

• Aumenta el número de células de las glándulas y hace que se transformen

de cuboides en cilíndricas

• La estimulación eléctrica del área paraventricular del hipotálamo aumenta la

secreción prehipofisiaria de TSH y en consecuencia aumenta la actividad de la
glándula tiroides.(10)

TÉCNICA ELEGIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA HORMONA (TSH)

Para la determinación cuantitativa de la hormona estimulante tiroidea en suero

humano.

Inmunoensayo enzimático de TSH

La determinación de niveles en suero o plasma de la hormona estimulante tiroidea

(TSH o Tirotropina) es reconocida como un método sensible en el diagnóstico de
hipotiroidismo primario y secundario. La TSH es secretada por el lóbulo anterior de
la glándula pituitaria e induce la producción y liberación de tiroxina (T4) y
triyodotironina (T3) desde la glándula tiroides. Esta es una glicoproteína con un
peso molecular de 28,000 daltons aproximadamente, consistiendo en dos
subunidades químicamente diferentes, alfa y beta. Aunque la concentración de
TSH en sangre es extremadamente baja, ésta es esencial para el mantenimiento
de la función tiroidea normal. La liberación de TSH es regulada por una hormona
TSH-libre (TRH) producida por el hipotálamo. Los niveles de TSH y TRH están
inversamente relacionados al nivel de la hormona tiroidea. Cuando existe un nivel
alto de hormona tiroidea en sangre, menos TRH se libera por el hipotálamo, por lo
que al menos TSH es secretada por la pituitaria. La acción opuesta puede ocurrir
cuando es disminuida la hormona tiroidea en sangre. Este proceso es conocido
como un mecanismo de regeneración negativa y es responsable para mantener

22
los niveles apropiados de estas hormonas en sangre. La TSH y la glicoproteínas
pituitarias: la hormona luteinizante (LH), la hormona folículo-estimulante (FSH), y
la gonadotropina coriónica humana (hCG), tienen cadenas idénticas alfa. Las
cadenas beta son distintas pero contienen regiones con secuencias idénticas de
aminoácidos. Estas regiones de homología pueden causar considerables
reacciones cruzadas con algunos antisueros policlonales de TSH. El uso de un
anticuerpo monoclonal en esta prueba ELISA TSH elimina tal reactividad cruzada
que podría producir valores de TSH falsamente elevados en mujeres
menopáusicas o embarazadas en poblaciones cuya evaluación de un estado
tiroideo es clínicamente significante.(12)

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

La prueba ELISA TSH está basada en el principio de la fase sólida de la enzima-

unida a una prueba inmunoabsorbente. El sistema del ensayo utiliza un único
anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno distinto determinante en la
molécula de TSH intacta. El anticuerpo anti-TSH ratón monoclonal es usado para
la inmovilización de la fase sólida (en los micro pozos). Un anticuerpo de anti-TSH
de cabra está en la enzima-anticuerpo (peroxidasa de rábano picante) de la
solución conjugada. La muestra de la prueba es permitida que reaccione
simultáneamente con los dos anticuerpos, mientras se producen las moléculas de
TSH intercalándose entre la fase sólida y los anticuerpos unidos a la enzima.
Después de una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, los pozos se
lavan con agua para quitar los anticuerpos etiquetados desprendidos. Una
solución TMB es agregada e incubada durante 20 minutos, resultando el
desarrollo de un color azul. El desarrollo del color se detiene con la adición de
Solución de Paro cambiando el color a amarillo. La concentración de TSH es
directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra de la prueba. La
absorbancia es medida espectrofotométricamente a 450 nm. (13)

REACTIVOS

1. Placa de micropozos cubiertos con anti-TSH de ratón monoclonal con 96 pozos

2. Reactivo de Enzima Conjugada.

3. Estándares de referencia: 0, 0.5, 2, 5, 10 y 25 µlU/mL. Liofilizados

4. Reactivo de TMB

5. Solución de Paro (1N HCI) 6. Instructivo de uso (13)

Materiales requeridos pero no abastecidos

23
1. Pipetas de precisión 50 µL, 100 µL, 200 µL y 1.0 mL

2. Puntas para pipetas desechables.

3. Agua destilada o desionizada

4. Mezclador Vórtex o equivalente.

5. Papel absorbente o toalla de papel

6. Papel cuadriculado

7. Un lector de MicroElisa.(13)

RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DEL ESPÉCIMEN

1. La sangre debe ser recolectada con técnicas estandarizadas de la punción

venosa y el suero debe ser separado de los glóbulos rojos, tan pronto como sea
posible. Evite hemólisis excesiva, muestras lipémicas o turbias.

2. Las muestras de suero deben ser almacenadas de 2 a 8 °C por hasta 48 horas,

y deben ser congelados a -20°C o más bajo para periodos más largos. No utilice
muestras excesivamente lipémicas o hemolizadas. Muestras descongeladas
deben ser invertidas en varias ocasiones antes de la prueba.(13)

PREPARACIÓN DE REACTIVO

1. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 a 25 °C) antes de
su uso.

2. Todos los reactivos deben ser mezclados por inversión suave o torbellino antes
de su uso. No inducir la formación de espuma.

3. Reconstituya cada estándar liofilizado con 1.0 mL de agua destilada. Permita

que el material reconstituido repose por al menos 20 minutos y mezcle
cuidadosamente. Los estándares reconstituidos serán estables por 30 días
siempre y cuando sean almacenados de 2-8°C. 4. Muestras con valores
esperados de TSH mayor a 25 µlU/mL debe realizarse una dilución con el
calibrador cero (1:10).(12)

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

1. Asegure el número deseado de pozos cubiertos en la placa.

2. Vierta 100 µL, de estándares, muestras y controles dentro de los pozos

apropiados.

24
3. Agregue 100 µL del Reactivo de la Enzima Conjugada en cada pozo.

4. Mezcle perfectamente durante 30 segundos. Es muy importante hacer la

mezcla completa.

5. Incubar a temperatura ambiente (de 18 a 25ºC) durante 60 minutos.

6. Retire la mezcla de la incubación golpeando el contenido de la placa a un

recipiente de desechos.

7. Enjuague y de pequeños golpes a los micro pozos 5 veces con agua destilada o
desionizada (No use agua de la llave)

8. Golpeé los pozos firmemente en el papel absorbente para quitar las gotas de
agua residuales.

9. Deposite 100 µL de Solución de TMB en cada pozo. Mezcle cuidadosamente

durante 10 segundos.

10. Incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.

11. Detenga la reacción agregando 100 µL de Solución de Paro (1N HCI) a cada
pozo.

12. Mezcle cuidadosamente durante 30 segundos. Es importante asegurarse que

el color azul cambie a amarillo completamente. 13. Lea la absorbancia a 450 nm
con un lector del micropozos en un plazo no mayor a 15 minutos. (13)

CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

1. Calcule el valor de absorbancia media (A450) para cada juego de estándares

de referencia, controles, y muestras.

2. Elabore una curva estándar al trazar la absorbancia media obtenida para cada
estándar de referencia comparada con su concentración en µlU/mL sobre un papel
cuadrícula, con valores de absorbancia sobre el eje Y ó vertical y las
concentraciones sobre el eje X u horizontal.

3. Utilizando los valores de absorbancia media para cada muestra, determine la

concentración correspondiente de TSH en µlU/mL desde la curva estándar. 4.
Cualquier valor obtenido para las muestras diluidas debe ser adicionalmente
convertido al aplicar el factor de dilución apropiado en los cálculos.(13)

VALORES ESPERADOS

25
Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos normales basados en la
población de pacientes. Diferencias en la técnica de ensayo y la aplicación de
normas distintas pueden afectar los resultados. Los resultados indicados a
continuación están basados en 38 muestras de sangre normales y 77 con
hipertiroidismo. Los rangos se determinaron a partir de 2DE de la media (µlU/mL
TSH) .(12)

Estos valores pueden ser diferentes de otros datos publicados.

Normal Hipertiroidismo

N media TSH 38 77

µlU/mL (Rango) 1.44 ˂0.2

0.3 - 8.1 ˂0.2 (13)

RANGOS DE REFERENCIA NORMALES

Los rangos de referencia a continuación se basan en Tietz

Adultos

21 - 54 años 0.4 - 4.2

55 - 87 años 0.5 - 8.9

Embarazo

1er. Trimestre 0.3 - 4.5

2do. Trimestre 0.5 - 4.6

3er. Trimestre 0.8 - 5.2 (13)

Resultados típicos de una corrida estándar del ensayo se muestran a

continuación. Esta curva estándar tiene el propósito de ilustrar solamente, y no
debe ser utilizada para hacer cálculos desconocidos. La curva estándar cubre un
rango dinámico desde 0 hasta 25 µlU/Ml. (13)

26
Curva de calibración de TSH realizada por :

 Elizabeth Arredondo Sandoval

 José de Jesús Del Toro Ortiz
 Jesús Guerra Hernández
 Anette Mariana Hernández Valencia
 Yulissa Cristina Mendoza Aguilera

Realizada en el CBTis N°12,Jiquilpan,Michoacán México.

27
El analizador de ELISA

Es un espectrofotómetro especializado, diseñado para efectuar la lectura de los

resultados de una técnica que se utiliza para determinar la presencia de
anticuerpos o antígenos específicos presentes en una muestra. La técnica se basa
en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida, mediante
anticuerpos que, directa o indirectamente, producen una reacción cuyo producto
puede ser leído por el espectrofotómetro. Se le conoce también con el nombre de
Lector de ELISA.

¿Para que se usa el Analizador de Elisa?

El analizador de ELISA se utiliza para leer el
resultado de las pruebas efectuadas, utilizando la
técnica de ELISA, la cual tiene aplicación directa
en inmunología y en serología; permite confirmar
la presencia en el organismo de anticuerpos o
antígenos de un agente infeccioso, vacunas o
autoanticuerpos –artritis reumatoide, por
ejemplo–, entre otras aplicaciones.

Principios de operación
El analizador de ELISA es un espectrofotómetro especializado. A diferencia de los
espectrofotómetros convencionales que permiten efectuar lecturas en un rango
amplio de longitudes de onda, este dispone de filtros o rejillas de difracción que
limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se utilizan en la técnica

28
 ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes de onda comprendidas
entre los 400 y los 750 nm –nanómetros–. Algunos analizadores operan en el
rango ultravioleta y pueden efectuar análisis entre los 340 y los 700 nm. El sistema
óptico utilizado por muchos fabricantes utiliza la fibra óptica para llevar la luz hasta
los pozos de la placa, donde se encuentra la muestra bajo análisis.

La luz que atraviesa la muestra tiene un diámetro que varía entre 1 y 3 mm. Un
sistema de detección recibe la energía lumínica, proveniente de la muestra, la
amplifica, determina la absorbancia y, a través de un sistema de lectura, la
convierte en datos que permiten interpretar el resultado de la prueba. También hay
analizadores de ELISA que emplean sistemas lumínicos de doble haz. Las
muestras del ensayo de ELISA se colocan en placas de diseño especial, las
cuales disponen de un número definido de pozos o vasos, en los cuales se lleva a
cabo el procedimiento o ensayo.

Son comunes las placas de 8 columnas por 12 filas, con un total de 96 pozos.
También existen placas con un mayor número de pozos. Las hay de 384 pozos y
la tendencia actual busca aumentar el número de pozos, y reducir la cantidad de
reactivos y el volumen de las muestras requeridas. La ubicación de los sensores
ópticos en el analizador de ELISA varía dependiendo de los fabricantes. Algunos
los colocan sobre la placa portamuestras, mientras que otros los ponen
directamente bajo los pozos de la placa.

En la actualidad, los analizadores de ELISA disponen de controles regulados por

microprocesadores, interfases de conexión a sistemas de información, programas
de control de procesos y control de calidad que, a través del computador, permiten
la automatización completa de los ensayos requeridos.

Equipos requeridos para efectuar ensayos de Elisa

Para desarrollar la técnica de ELISA se requiere disponer al menos de los
siguientes equipos:
1. Un analizador de ELISA.
2. Un lavador de ELISA (capítulo 2).
3. Un sistema dispensador de líquidos. (Pueden usarse pipetas multicanal).
4. Una incubadora especializada para las placas.
La ilustración que se presenta a continuación da una idea de la forma en que se
encuentran interrelacionados los equipos mencionados.

29
 DISCUSIÓN

En este trabajo encontramos gran variedad de métodos para obtención de

anticuerpos policlonales y monoclonales entre la investigación realizada algunos
científicos mencionaban que para la obtención de anticuerpos policlonales resulta
mejor utilizar conejos, ya que la obtención de anticuerpos monoclonales la
inmunización se le realiza a cabras ovejas por mencionar algunos. Varios autores
mencionaban que se debe de cumplir un protocolo en la inmunización del animal
el cual consiste sufrir al animal experimentación.

CONCLUSIÓN

Al finalizar este proyecto concluimos que es de gran importancia conocer el origen

de las pruebas, que va desde la producción de anticuerpos policlonales y

30
monoclonales, el cual esto nos permite conocer el origen de las pruebas. Para
posteriormente realizar el marcaje de moléculas y realización del inmunoensayo.

BIBLIOGRAFÍA

1. http://www.ciens.ula.ve/biologia/if_practica_1_produccion_ac_raton_b2010.
pdf
2. http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
3. http://es.slideshare.net/fotomascota/anticuerpos-policlonales
4. http://medmol.es/glosario/107/
5. http://es.slideshare.net/Xideral/curso-inmunologia-24inmuno-terapia
6. http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-
_inmunoensayos_1.pdf
7. http://www.finlay.sld.cu/publicaciones/inyestrategias/Tecnicas
%20inmunoenzimaticas%20para%20ensayos%20clinicos%20de
%20vacunas%20y%20estudios%20inmunoepidemiologicos.pdf
8. http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf
9. https://www.google.com.mx/webhp?sourceid=chrome-
instant&ion=1&espv=2&ie=UTF-8#q=inmunoensayos

31
10. http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/neu
robioquimica/TRH.htm
11. http://tiroiditis.net/tirotropina/
12. http://www.tuotromedico.com/temas/hormona_estimulante_tiroides_en_suer
o.htm
13. http://www.diagnosticainternacional.com.mx/admin/tablas/productos/IIDE-
2023%200212%20Ver1%20Cliente.pdf

32