Práctica 9A

ELISA INDIRECTO Y DE SANDWICH

POR INMUNOCROMATOGRAFÍA
 Introducción
• Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA, por sus
siglas Enzyme-linked immunosorbent assay) es un método
en el cual un antígeno de interés (o anticuerpo) es captado
usando un anticuerpo (o antígeno) y para la
detección/cuantificación de dicha molécula se usa una
reacción enzimática con un sustrato.

• De manera general en el ELISA, se pueden emplear

prácticamente cualquier combinación de antígeno y
anticuerpos para poder ser detectados, siempre y cuando
uno o el otro estén acoplados a una enzima cuya actividad
sea medida colorimétricamente
 se necesita un agente oxidante, generando un producto oxidado de color

• La actividad enzimática (fijada

en la reacción antígeno-
anticuerpo) es medida usando un
sustrato que cambia de color
cuando es transformado
(oxidado) por la enzima.
Para saber la concentracion se usa una curva patron

• La absorción de
luz del producto
formado es
medida para
transformar el
resultado a
valores numéricos.
• Dependiendo de la combinación de antígeno-
anticuerpo el ensayo es llamado ELISA directo,
ELISA indirecto, ELISA sándwich, ELISA competitivo

ELISA Directo SE DEBE LAVAR Y USAR BUFFER DE FOSFATOS; SE USA

UN SUSTRATO QUE RECONOCE LA ENZIMA USADO(unida
La proteína de interés (entre una mezcla al anticuerpo), EL SUSTRATO DE OXIDA (H2O2)
compleja de otras varias proteínas) es GENERANDO UN COMPUESTO COLOREADO QUE SE
inmovilizada en la superficie de una MIDE
microplaca con pocillos e incubada con
un anticuerpo acoplado a una enzima. El
anticuerpo reconoce específicamente la
proteína de interés. Después de varios
lavado, la actividad enzimática en la
microplaca es medida Se tiene una mezcla de proteinas con la de interes, se
espectrofotométricamente. ADSORBE en una superficie de plastico (poliestirineno o
policarbonato). En un pH ligeramente alcalino se puede
hacer la reaccion Ag-Ig (en su porsion FC, tiene unida una
ENZIMA SIEMPRE PARA PODER RECONOCERSE)
• ELISA Directo 1 ANTICUERPO Y ES CARA

• Ventajas:
• Es rápido porque solo se emplea un anticuerpo, se realiza en
menos pasos.
• Se elimina la posibilidad de reacción cruzada por un
anticuerpo secundario.
• Desventajas:
• Cuando se emplean células no adherentes como sustrato, es
necesario dar un tratamiento para que se adhieran a la
superficie de la placa
• La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse
afectada al acoplar enzimas. ENZIMA + ANTICUERPO COMERCIAL PARA MAS FACIL
• El marcaje de un anticuerpo primario para cada ELISA
específico consume tiempo y es caro.
• No hay flexibilidad de elección para los anticuerpos primarios
a utilizar de un experimento a otro.
• No es posible amplificar la señal.
 ELISA Indirecto
SE USA UN ANTICUERPO SECUNDARIO QUE RECONOCE LA
PORCION FC DEL ANTICUERPO PRIMARIO, SE LAVA
La proteína de interés es inmovilizada en la superficie de los pocillo de la
microplaca de ELISA, luego se incuba con un anticuerpo que reconocerá la
proteína de interés (el anticuerpo puede encontrarse en el suero de pacientes
–anticuerpo primario-), se agrega un anticuerpo secundario que reconoce
específicamente la región Fc del anticuerpo primario. Después de varios
lavados, la actividad enzimática en la microplaca se mide
espectrofotométricamente
Aunque el ELISA indirecto requiere mas pasos que el ELISA directo, los
anticuerpo secundarios son más “genéricos” y se puede utilizar un mismo
anticuerpo secundario para identificar varios anticuerpo primarios dirigidos
contra diferentes antígenos.
ES UNA PLACA DE PLASTICO, CON EL ANTIGENO DE INTERES, SE AGREGA ANTICUERPOS SIN ENZIMA, SE UNEN
AMBOS. SE USA UN ANTICUERPO QUE RECONOCE LA PARTE FC (FC GAMMA- IGG; FC EPSILON(/ALFA - IGE O IGA; ;
FCMU-IGM)
• ELISA Indirecto
• Ventajas:
• Hay una amplia gama de anticuerpos secundarios
comercialmente disponibles.
• Es versátil, poruqe muchos anticuerpos primaries pueden
haber sido generados en una misma especie y el mismo
anticuerpo secundario puede ser usado para detector cada
uno de ellos.
• La máxima inmunoreactividad del anticuerpo primerio es
retenida porque no esta marcado, por lo que no hay
posibilidad de alterar esta capacidad.
• La sensibilidad se puede incrementar porque cada anticuerpo
primario contiene varios epitopes que pueden unir al
anticuerpo secundario, lo que permite la amplificación de la
señal. SE UNEN VARIOS ANTICUERPOS SECUNDARIO A DIFERENTES PARTE DEL
• Desventajas: ANTICUERPO PRIMARIO, AMPLIANDO SEÑAL
• Cuando se emplean células no adherentes como sustrato, es
necesario dar un tratamiento para que se adhieran a la
superficie de la placa
• Riesgo de reacción cruzada entre el anticuerpo secundario y
la proteína de interés
TIENE ANTICUERPO EN LA PLACA NO TIENE ANTIGENO, SE USA PARA CUANTIFICAR HORMONAS, SE USA UN
ANTICUERPO SECUNDARIO QUE RECONOCE UN EPITOPO DISTINTO AL DE EL ANTIGENO PRIMARIO, SE USA UN
SUSTRATO UNIDO A AL ANTICUERPO SECUNDARIO

ELISA Sandwich
Un anticuerpo específico para reconocer la proteína de interés es inmovilizado
a la superficie de la placa de ELISA y es incubado con la muestra que contiene
la proteína de interés, y luego con otro anticuerpo específico para esa
proteína el cual esta acoplado a una enzima. Después de varios lavados, la
actividad de la enzima es medida espectrofotométricamente. El anticuerpo
adsorbido y el que esta acoplado a la enzima deben reconocer epítopos
diferentes sobre la misma proteína de interés (antígeno)
• ELISA DE Sandwich
• Ventajas:
• Alta especificidad: el antígeno es especificamente capturado
y detectado.
• Es adecuado para muestras complejas (mezcla de varias
proteínas): el antígeno no require purificación antes de ser
medido.
• Flexibilidad y sensibilidad: se puede desarrollar bajo un
método directo o indirecto.
• Desventajas:
• Requiere varios pasos para su desarrollo y es caro
Toxoplasma
gondii PARASITO

•Apicomplexa LOCOMOCION DEFINIDO

NO ORGANO DE

•Es un coccidio tisular intracelular obligado, de distribución

cosmopolita
•La toxoplasmosis es una zoonosis de relevancia, puede infectar
casi a cualquier mamífero de sangre caliente, terrestres, acuáticos
y aves. Los felinos son los hospederos definitivos.
•La infección puede asociarse a severas complicaciones en los
principales grupos en riesgo: Sujetos inmunocomprometidos,
mujeres embarazadas, fetos y recién nacidos, pacientes con
toxoplasmosis congénita asintomática
Toxoplasma gondii
EN EL INTESTINO SE DA EL CICLO SEXUAL-GATO

FASE INFECTANTE

Ooquistes: Los felinos, hospederos definitivos, eliminan los

ooquistes no esporulados en heces fecales, infectantes al cabo de
1 -5 días en medio ambiente (suelo). Los ooquistes esporulados son
ovoidales, miden 10 -12 μm y contienen 2 esporoquistes, cada uno
con cuatro esporozoítos.
Toxoplasma gondii
MUSCULO NERVIOSO O CORAZON

Taquizoítos: formas replicativas, intracelulares. Se

observan en la fase aguda y son responsables de la
diseminación y la destrucción tisular. Miden 3 μm x 6 μm,
de forma oval, con un extremo aguzado y el otro
redondeado. Se reproducen rápidamente por división
binaria (endodiogenia) en vacuolas parasitóforas que
forman en células nucleadas. Son de importancia el
conoide, anillos polares, micronemas, roptrias y gránulos
densos en la adhesión, invasión, formación de la vacuola
parasitófora y adquisición de nutrientes. La replicación
conduce a la lisis celular y a la diseminación de
taquizoítos a diferentes tejidos. SIGUIENTE FASE.....
Bradizoítos: T. gondii se diferencia en formas de muy
lento crecimiento, contenidas en quistes tisulares. Los
bradizoítos miden 1.5 μm x 7.0 μm y su morfología es
semejante a la de los taquizoítos. Existen mecanismos
por los cuales entran en una etapa "quiescente" (latente).
Estas formas, en su conjunto, con su membrana,
constituyen los quistes tisulares, y dan lugar a inmunidad
no estéril; en condiciones de inmunocompromiso los
bradizoítos que contienen se reactivan y diseminan como
taquizoítos.
 Posibles resultados

Pocillo Absorbancia Concentración

Blanco 0.001
Control Negativo 0.036
Control Positivo 0.732
Estándar 1 0.467 50 UI/mL
Estándar 2 0.755 100 UI/mL
Estándar 3 1.143 200 UI/mL
Muestra 1 0.643
Muestra 2 0.497

Generar curva estándar y determinar con la ecuación de la recta la

concentración de las muestras 1 y 2