ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL

FACULTAD DE INGENIERÍA MECÁNICA Y CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN

INGENIERÍA EN ALIMENTOS

Laboratorio de Biotecnología de Alimentos

Guía Práctica de Curso

FERMENTACIÓN Y ENZIMOLOGÍA
ALIMENTARIA

Diana Coello Montoya, MSc.

2018 ALIG-1009
Tabla de contenido
1 Simulación de procesos fermentativos “Elaboración de yogurt” .................. 3
2 Cinética del crecimiento microbiano ............................................................ 7
3 Cinética e inhibición enzimática ................................................................. 15
4 Aplicación de enzimas en la industria alimentaria .................................... 23
5 Factores que influencian la cinética enzimática ......................................... 26
6 Uso de biorreactores “Curva de crecimiento de S. cerevisiae” .................. 33
ANEXO 1: Formulario de cinética microbiana .................................................. 37
ANEXO 2: Formulario de cinética enzimática................................................... 38

pág. 2
1 Simulación de procesos fermentativos
“Elaboración de yogurt”

Los procesos de fermentación han sido, durante décadas, uno de los métodos de
conservación más empleados para alargar la vida útil de los alimentos perecibles
(Josephsen y Jespersen, 2004). Existen diversos tipos de productos alimenticios
obtenidos por la fermentación natural o controlada de materias primas como vegetales
(kimchi, sauerkraut), cereales (cerveza, pan), frutas (vino), leche (yogurt, leche), entre
otros (Bech Hansen, 2004). Los microorganismos que se emplean en la fermentación
incluyen bacterias, hongos y levadura, siendo los más empleados las especies
Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus lactis y Streptococcus thermophilus (Bech,
2004).

La fermentación ácido-láctica es el proceso fermentativo más empleado en la

producción de alimentos fermentados y es considerada el tipo de fermentación más
antiguo (Steinkraus, 2004). El principal grupo de bacterias que se utilizan en esta
fermentación reciben el nombre de bacterias ácido-lácticas (LAB, por sus siglas en
inglés), debido al principal metabolito que producen (ácido láctico) a partir de la
fermentación de la lactosa o azúcar de la leche (Josephsen y Jespersen, 2004). Estas
bacterias son bacilos o cocos gram-positivos, no esporuladas, catalasa y oxidasa
negativa, microaerófilas, fermentativas usualmente no mótiles con elevados
requerimientos nutricionales para su crecimiento (Josephsen y Jespersen, 2004).

Los procesos fermentativos pueden ser espontáneos, debido al crecimiento de la flora

inicial propia del alimento. Pueden darse por el proceso de back-slopping, el cual
consiste en utilizar una parte de un producto anteriormente fermentado como inóculo
inicial para un nuevo proceso de fermentación (Josephsen y Jespersen, 2004). O,
pueden realizarse por la adición de un cultivo iniciador (starter culture), llamado así
porque se lo utiliza para comenzar el proceso fermentativo luego de eliminar la flora
inicial del producto a fermentar (Josephsen y Jespersen, 2004).

Uno de los procesos fermentativos en los cuales se puede aplicar la adición de cultivos
iniciadores o la fermentación por back-slopping, es la producción de yogurt. Este
producto obtenido de la fermentación de la leche es el producto fermentado lácteo más
conocido y popular a nivel mundial (Staff, 1998). La textura, aroma y sabor de este
producto cambian dependiendo de su origen, teniendo yogurts que van desde líquidos
altamente viscosos hasta aquellos que son geles suaves, o incluso líquidos bebibles
con o sin la adición de frutas u otros ingredientes (Staff, 1998).

Las etapas de producción de yogurt incluyen estandarización de la leche, tratamiento

térmico, homogenización, inoculación e incubación y enfriamiento; no obstante,
dependiendo del tipo de yogurt pueden llevarse a cabo otras etapas de producción
(Chandan y ORell, 2013). La etapa de inoculación e incubación es la más importante en
la producción de yogurt, ya que en ésta se desarrollarán las principales características
sensoriales del producto (Staff, 1998). Los cultivos iniciadores más utilizados a nivel
industrial incluyen las especies Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus

pág. 3
salivarius ssp. thermophilus; sin embargo, otras especies como Lactobacillus delbrueckii
ssp. lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus y Bifidobacterium spp.,
son también utilizadas (Staff, 1998).

Entre las bacterias Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y Streptococcus salivarius

ssp. thermophilus se produce una interacción durante su crecimiento en la leche, que
resulta favorable para ambas, denominada proto-cooperación (Staff, 1998; Mchiouer et
al., 2017). La interacción entre ambas bacterias permite una mayor tasa de crecimiento,
debido al intercambio de metabolitos producida por una especie y aprovechada por la
otra (Smid y Lacroix, 2013; Mchiouer et al., 2017), como se observa en la Figura 1.1.
Además, esta cooperación produce el aumento de la tasa de acidificación de la leche y
la disminución del pH, dándole estabilidad al producto final (Mchiouer et al., 2017).

Figura 1.1. Esquema de proto-cooperación entre L. bulgaricus y S. thermophilus.

Fuente: Mihail y Kostov (2009)

El proceso de la fermentación puede ser monitoreado de diferentes formas, ya sea por

el crecimiento de las bacterias, la disminución de pH, la formación de ácido láctico, la
disminución del contenido de lactosa o la formación de galactosa a partir de la lactosa
(Staff, 1998). Dependiendo de los parámetros establecidos para la obtención de un
yogurt estable (pH<4.5), el tiempo de fermentación cambiará. La simulación del proceso
de fermentación es una herramienta que permite evaluar diferentes escenarios sin la
necesidad de realizar pruebas in situ.

La simulación es la representación de la operación de un sistema en la vida real a través

del tiempo, el cual muestra las principales características del sistema o proceso (Hira,
2008). La simulación nos permitirá visualizar los efectos que ejercen diferentes
parámetros durante el proceso, probar condiciones extremas con mayor facilidad que
en un experimento real y probar varias hipótesis sin la necesidad de llevar a cabo las
pruebas reales.

pág. 4
Para la simulación de cualquier proceso, primero es necesario desarrollar un modelo
que represente sus principales características, comportamientos y funciones (Banks,
1998). El modelo de crecimiento microbiano dependiente del pH es el que mejor se
adapta para los procesos de fermentación debido a que, durante el proceso, los cambios
de pH se dan a través del tiempo y ejercen una influencia directa en la tasa de
crecimiento microbiano. La ecuación 1.1 muestra el modelo utilizado para calcular la
tasa de crecimiento microbiano (µ) en función del pH.

µ = µmax - b(pH - pHopt)² Ec.1.1

OBJETIVO

Analizar el proceso de fermentación del yogurt para la obtención de un producto estable

a través de la simulación del crecimiento de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus y
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus.

PROCEDIMIENTO

Actividades durante la práctica

1. Armar grupos de 2 personas.
2. Descargar y guardar en el ordenador el documento “Simulación Yogurt 2018”
(Disponible en el Sidweb).
3. Abrir el documento y activar la herramienta Macro.
4. Seguir las instrucciones detalladas en el documento, empezando con la pestaña
“intro”.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Utilizar el modelo de fermentación para responder y explicar las siguientes

preguntas:
- ¿Cómo se puede reducir el tiempo de fermentación a 150 minutos y al mismo
tiempo obtener un yogurt estable en función del pH? ¿Cómo realizaría estos
cambios en la vida real? ¿Qué implicaciones monetarias podrían llegar a tener
estos posibles cambios? Presentar las gráficas que apoyen su respuesta.
- ¿Cree que es posible producir yogurt con una sola cepa de bacteria? Demuestre
las gráficas de la simulación de los escenarios planteados.
- ¿Cuál es el efecto de los diferentes parámetros del modelo sobre los resultados
de la simulación? Por ejemplo, el efecto de la tasa máxima de crecimiento,
dependencia del pH en la tasa de crecimiento, la cantidad de inóculo utilizado,
la relación entre las concentraciones iniciales de cultivo y el tiempo de
fermentación.
2. Proponer dos hipótesis de su interés y usar el modelo de fermentación para evaluar
los resultados de sus hipótesis. Presentar las gráficas y discutir los resultados.

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3. Responder las siguientes preguntas:
- Describir el rol de los diferentes parámetros en la ecuación del crecimiento
microbiano dependiente del pH.
- ¿Por qué S. thermophilus crece antes que el L. bulgaricus durante la
fermentación?
- ¿Por qué el pH alcanza cierto valor constante?
- ¿Por qué un organismo podría llegar a desaparecer del sistema luego de varias
fermentaciones de back-slopping?
- ¿Es posible encontrar los mismos resultados de las simulaciones de
computadora en experimentos reales? Explique.

BIBLIOGRAFÍA

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261. West Sussex, UK: John Wiley & Sons, Inc.
Hira, D.S. (2008). Simulation System. Segunda edición. Ram Nagar, India: S. Chand &
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Mchiouer, K., Bennani, M. & Meziane, M. (2017). Microbial interactions between
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Materials and Environmental Sciences, 8, 1460–1468.
Mihail, A. & Kostov, G. (2009). Proto-cooperation factors in yogurt starter cultures. Revue
de Génie Industriel, 3, 4–12.
Smid, E.J. & Lacroix, C. (2013). Microbe – microbe interactions in mixed culture food
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Staff, M.C. (1998). Cultured milk and fresh cheeses. En: The Technology of dairy
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Tortora, G.J., Funke, B.R. & Case, C.L. (2007). Introducción a la Microbiología. Novena
edición. Buenos Aires, Argentina: Ed. Médica Panamericana.
Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S. & Higton, G. (2001). Industrial Microbiology :
An Introduction. Oxford, UK: Blackwell Science Ltd.

pág. 6
2 Cinética del crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como el aumento ordenado de los

componentes celulares, que resultará en el alargamiento de la célula y posterior división
celular, o puede solo resultar en el aumento de la biomasa por incremento del tamaño
celular (Waites et al., 2001). Para el estudio del modelo de crecimiento microbiano, se
analizará la reproducción por fisión binaria cuando éstos son cultivos homogéneos en
un medio líquido, en donde la división de la célula madre da como resultado células hijas
idénticas (Figura 2.1).

Figura 2.1. División celular microbiana. Fuente: Maier (2009)

Cada vez que una célula se divide se denomina generación (n), mientras que el tiempo
que le toma a la célula duplicarse se denomina tiempo de generación, tiempo de
duplicación, o tiempo generacional (td). Por lo tanto, el tiempo de generación es el tiempo
requerido para que una población microbiana se duplique, refiriéndose a un crecimiento
exponencial (Tortora et al., 2007).

Cuando se representa la reproducción binaria de los microorganismos como el logaritmo

del número de células o biomasa versus el tiempo de incubación, la curva resultante se
compone de cuatro fases diferentes como se observa en la Figura 2.2. La primera fase
es la fase de latencia o fase lag, en la cual la tasa de crecimiento es cero (Maier, 2009).
Esta fase corresponde al tiempo entre la inoculación y el momento en el que se alcanza
la tasa máxima de división; la duración depende del cultivo previo y el medio empleado
(Schlegel, 1997).

Figura 2.2. Curva de crecimiento microbiano. Fuente: Waites et al. (2001)

La segunda fase es la fase exponencial o fase log que se caracteriza por una tasa de
crecimiento constante y depende de la especie bacteriana y el medio de crecimiento
(Schlegel, 1997). Esta fase es la más adecuada para realizar los estudios de las
propiedades bioquímicas y fisiológicas de las células, debido a que las células son
metabólicamente más activas y uniformes en este periodo; sin embargo, en esta fase
son también más sensibles a condiciones adversas (Tortora et al., 2007).

Matemáticamente, este crecimiento exponencial puede ser descrito por medio de dos
métodos, uno relacionado al número de células (N) y otro relacionado a la cantidad de
biomasa (x) (Waites et al., 2001). Por ejemplo, si en una unidad de volumen se tiene un
número inicial de células (N0), el número de células luego de un determinado tiempo
(Nt), al cabo de n divisiones, será igual a:

𝑁𝑡 = 𝑁0 2𝑛 Ec. 2.1

Siendo n el número de generaciones (Figura 2.1). Pasando a logaritmo la ecuación 2.1,

se obtiene la fórmula para calcular el número de generaciones, como se muestra en la
ecuación 2.2.

ln 𝑁𝑡 −ln 𝑁0
𝑛= ln 2
Ec. 2.2

Mientras que el tiempo de generación (td) es calculado a través de la ecuación 2.3.

𝑡 𝑡 ln 2
𝑡𝑑 = 𝑛 = ln 𝑁 −ln 𝑁 Ec. 2.3
𝑡 0

Siendo t el tiempo que transcurre entre N0 y Nf. Para la concentración de biomasa se

establece que la tasa de cambio de la biomasa (dx) durante el tiempo de crecimiento
(dt) está dada por la ecuación 2.4.

𝑑𝑥
= 𝜇𝑥 Ec. 2.4
𝑑𝑡

Donde x es la concentración de biomasa (g/l), t el tiempo (h) y µ es la tasa específica de

crecimiento (h-1). La ecuación 2.4 puede integrarse para obtener la concentración de
biomasa en cualquier tiempo del crecimiento exponencial:

𝑥𝑡 = 𝑥0 𝑒 𝜇𝑡 Ec. 2.5

Donde xt es la concentración de biomasa en un tiempo t, y x0 es la concentración de

biomasa al inicio de la fase exponencial. Pasando a logaritmo natural la ecuación 2.5,
se obtiene:

ln 𝑥𝑡 = ln 𝑥0 + 𝜇𝑡 Ec. 2.6

Cuando se grafica la concentración de biomasa versus el tiempo (Ec. 2.5), se obtiene

una curva con un incremento constante de la pendiente, como se observa en la Figura
2.3a. Mientras que, al graficar el logaritmo natural del aumento de biomasa en el tiempo

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(Ec. 2.6), se obtiene una recta con una pendiente igual a µ (Figura 2.3b). Cuando se
grafica el logaritmo en base 10 en lugar de logaritmo natural, la pendiente de la recta es
igual a µ/2.303 (Figura 2.3c).

Figura 2.3. Fase log de la curva de crecimiento microbiano. (a) gráfica aritmética, (b)
gráfica semilog con logaritmo natural y (c) gráfica semilog con logaritmo base 10.
=tasa de crecimiento específico. Fuente: Waites et al. (2001)

Durante la fase de crecimiento exponencial, asumiendo que el tamaño celular promedio

es constante, existe una relación directa entre el número de células y la concentración
de la biomasa, lográndose establecer una relación entre la tasa de crecimiento
específica (µ) y el tiempo de generación (td), tal como muestra la ecuación 2.7 (Waites
et al., 2001).

0.693
𝜇= 𝑡 Ec. 2.7
𝑑

Sin embargo, la tasa de crecimiento celular (µ) va a depender de la concentración de un

sustrato esencial, denominado sustrato o nutriente limitante (Waites et al., 2001). La
relación entre la tasa de crecimiento y la concentración del nutriente limitante es
representada mediante la ecuación de Monod (Ec. 2.8).

𝜇 [𝑆]
𝜇 = 𝐾𝑚𝑎𝑥 Ec. 2.8
𝑠 +[𝑆]

Donde µ es la tasa de crecimiento (h-1), µmax es la tasa de crecimiento máxima (h-1), S

es la concentración del nutriente limitante y Ks es la constante de saturación o constante
de afinidad definida como la concentración de nutriente en la cual el crecimiento ocurre
a la mitad del valor de µmax.

La Figura 2.4 muestra que cuando los microorganismos crecen en un medio en el cual
la concentración de sustrato es mucho mayor al valor de Ks, éstos crecerán a su máxima
tasa de crecimiento. Por ejemplo, bajo las condiciones encontradas al inicio de un cultivo
microbiano en batch cuando los nutrientes están en concentraciones elevadas, o bajo
las condiciones encontradas en un cultivo microbiano continuo en el cual se está
ingresando continuamente nutrientes (Waites et al., 2001; Maier, 2009).

pág. 9
Cuando el crecimiento se da en concentraciones de sustrato menores a Ks, la tasa de
crecimiento dependerá de la concentración del sustrato limitante (Figura 2.4). Estas
condiciones son las que se encuentran típicamente en un cultivo en batch al final de la
fase log, cuando la mayor parte del sustrato ha sido consumido y el cultivo entra en la
fase estacionaria (Waites et al., 2001; Maier, 2009).

Figura 2.4. Tasa de crecimiento dependiente de la concentración de nutriente

limitante. Fuente: Maier (2009)

La fase estacionaria se da debido a que la población se estabiliza al disminuir la tasa de

crecimiento celular e igualarse a la tasa de muerte celular (Tortora et al., 2007), o debido
a un cese en la división celular, a pesar de que las células siguen metabólicamente
activas (Sreekrishna, 2006). Este crecimiento neto igual a cero se debe al agotamiento
de las fuentes de carbono y energía en el medio, la acumulación de compuestos de
desecho que pueden inhibir el crecimiento o resultar tóxicos para las células, los
cambios perjudiciales de pH y la densidad poblacional (Schlegel, 1997; Maier, 2009).
Debido al estrés causado por la falta de nutrientes, las células en esta fase son más
pequeñas y redondas comparadas a las células en la fase log (Maier, 2009). La masa
bacteriana alcanzada en la fase estacionaria se denomina producción (Schlegel, 1997).
La productividad de biomasa es un indicador que mide la cantidad de biomasa generada
en la unidad de volumen de cultivo en el tiempo (Ec. 2.9); puede aplicarse también para
la producción de un metabolito de interés. La productividad máxima hace referencia a
la cantidad de biomasa formada hasta alcanzar la fase estacionaria y la productividad
total considera todo el tiempo del proceso de fermentación.

𝑑𝑥
𝑃 = 𝑑𝑡 ∗ 100% Ec. 2.9

La última fase es la fase de muerte o de declinación, la cual se da cuando la tasa de

muerte celular es mucho mayor a la tasa de crecimiento celular, y el número de células
viables puede descender exponencialmente, principalmente por la acumulación
excesiva de metabolitos, e.g., ácidos (Schlegel, 1997).

Las fermentaciones en batch son posible optimizarlas mediante el conocimiento de

parámetros de importancia como los coeficientes de rendimiento (Waites et al., 2001).
Entre los más importantes tenemos el rendimiento biomasa-sustrato definido como la
cantidad de biomasa producida por cantidad de sustrato consumido (Ec. 2.10) y el
rendimiento producto-sustrato definido como la cantidad de metabolito producido por
cantidad de sustrato consumido (Ec. 2.11).

pág. 10
 𝑑𝑥
𝑌𝑥/𝑆 = − 𝑑𝑆 Ec. 2.10

𝑑𝑃
𝑌𝑃/𝑆 = − 𝑑𝑆 Ec. 2.11

Además, otros parámetros importantes en los cultivos en batch son la velocidad de

consumo de sustrato (Ec. 2.12), la velocidad de crecimiento de biomasa (Ec 2.13) y la
tasa específica de consumo de sustrato por parte del microorganismo (Ec 2.14).

𝑑𝑆
𝑟𝑆 = − Ec. 2.12
𝑑𝑡

𝑑𝑥
𝑟𝑥 = Ec. 2.13
𝑑𝑡

𝜇
𝑞𝑆 = Ec. 2.14
𝑌𝑥/𝑆

Reordenando las ecuaciones 2.10, 2.12 y 2.13 se obtiene la relación entre la velocidad
de consumo de sustrato (rS) y la velocidad de crecimiento de biomasa (rx).

𝑟𝑥
𝑟𝑆 = Ec. 2.15
𝑌𝑥/𝑆

En base a la ecuación 2.15, se establece que el consumo de sustrato será solo posible
cuando haya crecimiento. Sin embargo, cuando el sustrato considerado es la fuente de
carbono y energía, puede ocurrir que haya consumo del sustrato sin crecimiento de
biomasa, debido a que el sustrato utilizado fue destinado al mantenimiento de las
funciones celulares (Fuchs y Kroger, 2009).

La ecuación de Pirt (Ec 2.16) relaciona el rendimiento de biomasa-sustrato observable

(Yx/S) con el crecimiento y mantenimiento microbiano.

1 1 𝑚
=  + 𝜇𝑠 Ec. 2.16
𝑌𝑥/𝑆 𝑌 𝑥/𝑆

Donde Yx/S es el rendimiento de biomasa-sustrato máximo que se daría cuando no hay

mantenimiento y ms es el coeficiente de mantenimiento celular.

Las fermentaciones en continuo son sistemas diseñados para trabajar por periodos más
largos. Lo hacen a través de la adición permanente de medio de cultivo que contiene los
nutrientes y sustrato necesarios, el cual desplaza un volumen igual de medio ya utilizado
que contiene células, metabolitos, productos de desecho y nutrientes o sustratos no
utilizados (Waites et al., 2001; Maier, 2009).

Los parámetros controlados para la optimización de estos sistemas abiertos son la tasa
de dilución (D) y la concentración del sustrato que ingresa (flujo del medio), por lo que
la tasa de adición del medio fresco controlará la velocidad de crecimiento del

pág. 11
microorganismo (Waites et al., 2001). La tasa de dilución (D) se calcula como muestra
la ecuación 2.17.

𝐹
𝐷=𝑉 Ec. 2.17

Donde F es el flujo de ingreso del medio (l/h) y V es el volumen del biorreactor (l). Al
mantener una tasa de dilución constante, el balance neto de biomasa en el equipo se
describe como muestra la ecuación 2.18.

𝑑𝑥
= 𝜇𝑥 − 𝐷𝑥 Ec. 2.18
𝑑𝑡

En condiciones de estado estacionario la tasa de pérdida (Dx) iguala a la tasa de

crecimiento (x), entonces D = . Por lo tanto, en estas condiciones  depende de D
hasta un valor máximo de max. Si la tasa de dilución aumenta por encima de max, las
células serán eliminadas (wash-out) del sistema sin tener tiempo para aumentar. El
punto en el que se evita este fenómeno se denomina tasa crítica de dilución (Dcrit),
mostrada en la Figura 2.5.

Figura 2.5. Crecimiento microbiano en sistema continuo. Fuente: Waites et al. (2001)

La concentración de sustrato residual en el biorreactor, en estado estacionario, para

cualquier tasa de dilución puede ser calculada reemplazando D en la ecuación de
Monod (Ec. 2.8), obteniendo la ecuación 2.19.

𝜇 [𝑆𝑟 ]
𝐷 = 𝐾𝑚𝑎𝑥 Ec. 2.19
𝑠 +[𝑆𝑟 ]

Donde Sr es la concentración residual de sustrato en el biorreactor en estado

estacionario, en una tasa de dilución fija. Reordenando la ecuación 2.19, tenemos la
ecuación 2.20 para el cálculo de Sr.

𝐷𝐾𝑠
𝑆𝑟 = Ec. 2.20
𝜇𝑚𝑎𝑥 −𝐷

pág. 12
OBJETIVO

Calcular parámetros de operación de los sistemas de fermentación en batch y en

continuo, utilizando los fundamentos de cinética microbiana para la resolución de
problemas.

PROCEDIMIENTO

Actividades durante de la práctica

1. Armar grupos de 2 personas.
2. Desarrollar en clases los ejercicios entregados por el profesor.
3. Al finalizar la clase, entregar los ejercicios resueltos en hojas A4 con el nombre de
cada integrante.

NOTA: Se puede solicitar solo la ayuda del profesor y se puede hacer uso del formulario
que se encuentra en el Anexo 1 de esta guía.

REPORTE

1. Una empresa requiere producir 150 kg de biomasa de Saccharomyces cerevisiae,

para ello cuenta con glucosa como sustrato. Estime la cantidad de sustrato que se
debe utilizar en el medio de cultivo para la producción de biomasa, tomando en
consideración el rendimiento de biomasa-sustrato como 0.45 y un consumo del
sustrato de 88%.

2. Una industria requiere formular un medio de cultivo para un microorganismo

específico que posee un rendimiento biomasa-sustrato de 0.41. Se le pide a usted
determinar la cantidad de sacarosa (C12H22O11), extracto de levadura (8.8% de N),
KH2PO4, K2HSO4 que debe estar presente en la formulación para poder producir 15
g/L de biomasa. Adicional se necesita saber cuál es la relación carbono/nitrógeno
del medio. Considere que se consume el 80% de la fuente de carbono y que la
composición de la biomasa en base seca es 50% carbono, 10% nitrógeno, 5%
fósforo y 3% azufre.

3. La industria de alimentos “ABC” desea incursionar en la venta de cultivos iniciadores

(starters), principalmente en la producción de Saccharomyces cerevisiae.
Inicialmente se han realizado pequeños estudios de laboratorio y se obtuvo la curva
de crecimiento que se muestra en la Figura 2.1. Se le solicita a usted que realice
las siguientes actividades:
- Explique cuál es el nutriente limitante en el proceso.
- Calcule la tasa específica de crecimiento.
- Calcule la productividad máxima y total. Considerar los siguientes tiempos:
fase lag=10 h, fase log=40 h, fase est=22 h, tiempo de esterilización=5 h)
- Calcule Yx/S
- ¿Qué recomendación daría para poder mejorar la productividad? Demuestre
numéricamente.
pág. 13
 Figura 2.1. Producción de biomasa y consumo de nutrientes del S. cerevisiae

BIBLIOGRAFÍA

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An Introduction. Oxford, UK: Blackwell Science Ltd.

pág. 14
3 Cinética e inhibición enzimática

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas;

es una forma fundamental para la descripción, predicción y cálculo de cómo una enzima
se une a un sustrato para formar un producto, y qué tan rápido y eficiente sucede este
proceso (Whitehurst y van Oort, 2010). Para estudiar la cinética enzimática se mide el
efecto de la concentración de sustrato ([S]) sobre la velocidad inicial de la reacción (v0),
manteniendo la cantidad de enzima constante.

Michaelis y Menten fueron los primeros en proponer el modelo para la actividad

enzimática en 1913, sugiriendo que la enzima libre se unía al sustrato para formar un
complejo enzima-sustrato, el cual sufría una transformación liberando al final el producto
y la enzima libre (Marangoni, 2003). Este proceso se esquematiza en la ecuación 3.1,
donde E es la enzima, S el sustrato, ES el complejo enzima-sustrato y P el producto.

Ec. 3.1

En base a su esquema, Michaelis y Menten propusieron también la ecuación que

describiría las reacciones enzimáticas en base a su modelo de equilibrio (Ec. 3.2).

𝑉 [ 𝑆]
𝑣0 = 𝑚𝑎𝑥 Ec. 3.2
𝐾𝑚+[𝑆]

Donde Vmax es la velocidad máxima de la reacción y Km es la constante de Michaelis-

Menten o constante de disociación del complejo enzima-sustrato. La constante de
Michaelis-Menten (Km) es definida también como la medida de afinidad de la enzima por
el sustrato, y corresponde a la concentración de sustrato en la cual la velocidad de la
reacción es la mitad de la velocidad máxima (Figura 3.1); por lo tanto, mientras más bajo
sea el valor de Km, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato (Marangoni, 2003).

Figura 3.1. Gráfica de la velocidad inicial de la reacción (v0) a diferentes

concentraciones de sustrato ([S]). Fuente: Chang (2000)

Cuando las concentraciones de sustrato son bajas la velocidad de la reacción es

proporcional a la concentración de sustrato, por lo tanto, se dice que la reacción es de
primer orden. Mientras que, a concentraciones elevadas de sustrato, la velocidad
permanece aproximadamente constante y es insensible a los cambios de concentración
de sustrato, por lo tanto, en esta región la reacción es de orden cero (Figura 3.2).

Figura 3.2. Orden de la reacción enzimática con respecto a la concentración de

sustrato. Fuente: Marangoni (2003)

Las constantes de primer orden y orden cero de las reacciones enzimáticas son
calculadas mediante las ecuaciones 3.3 y 3.4, respectivamente.

𝑉
𝑘 = 𝑚𝑎𝑥 Ec. 3.3
𝐾𝑚

𝑘 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 Ec. 3.4

Para el cálculo de las constantes cinéticas (Vmax y Km) es necesaria la transformación

lineal de la ecuación de Michaelis-Menten. Existen tres métodos utilizados para este fin,
siendo el más tradicional el método Lineweaver–Burk o recíproca doble (Clarke, 2013).
La ecuación 3.5 muestra la relación Lineweaver–Burk, en la cual se grafica la inversa
de la velocidad en el eje de las Y y la inversa de la concentración de sustrato en el eje
de las X, obteniendo como pendiente Km/Vmax e intercepto en el eje de las Y la inversa
de la Vmax (Figura 3.3).

1 𝐾𝑚 1 1
= × + Ec. 3.5
𝑣0 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

Figura 3.3. Representación de Lineweaver–Burk de la ecuación de Michaelis-Menten.

Fuente: Rogers y Gibon (2009)

El segundo método es considerado más confiable (Clarke, 2013), y es la representación

lineal de Eadie–Hofstee (Ec. 3.6), en la cual se representa la velocidad (eje de las Y)
versus la relación de la velocidad con la concentración de sustrato (eje de las X), lo cual

pág. 16
da como pendiente el negativo de la constante Km y en el intercepto del eje de las Y el
valor de Vmax (Figura 3.4).

𝑣
𝑣 = −𝐾𝑚 [𝑆] + 𝑉𝑚𝑎𝑥 Ec. 3.6

Figura 3.4. Representación de Eadie–Hofstee de la ecuación de Michaelis-Menten.

Fuente: Rogers y Gibon (2009)

El tercer método empleado es la representación lineal de Hanes-Woolf (Ec. 3.7), en el

cual se grafica la relación de la concentración de sustrato y la velocidad (eje de las Y)
versus la concentración de sustrato (eje de las X), obteniéndose la inversa de la Vmax
como pendiente y la relación de Km/Vmax en el intercepto del eje de las Y (Figura 3.5).

[𝑆] 1 𝐾𝑚
= [𝑆 ] + Ec. 3.7
𝑣 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

Figura 3.5. Representación de Hanes-Woolf de la ecuación de Michaelis-Menten.

Fuente: Rogers y Gibon (2009)

La unidad de actividad enzimática (U) es la unidad estándar más común para definir la
actividad enzimática; se define como la cantidad de enzima que causa la conversión de
1 μmol de sustrato, u obtención de 1 μmol de producto en un minuto (Marangoni, 2003).
Otra unidad para actividad enzimática es la del Sistema Internacional, el katal (kat), un
katal es igual a 60x106 U. Se utilizan submúltiplos como el μkat (10-6 kat) o kat (10-9
kat).

La actividad específica es definida como el número de unidades de enzima por unidad

de masa, la cual puede corresponder a la masa de la enzima pura, a la cantidad de
proteína de un aislado, o al total de la masa del tejido del cual proviene la enzima
(Marangoni, 2003).

pág. 17
La cinética enzimática depende de algunas variables como concentración del sustrato,
concentración de la enzima, concentración de cofactores, presencia y concentración de
inhibidores, pH y temperatura (Whitaker, 2003). El efecto de la temperatura en la
velocidad de reacción se representa mediante la ecuación de Arrhenius de relación
exponencial (Leskovac, 2007); por lo tanto, al obtener el logaritmo natural de esta
ecuación se obtiene una relación lineal del efecto de la temperatura sobre la constante
de inactivación de la reacción (Ec. 3.8).

𝐸
ln 𝑘𝑑 = ln 𝑘∝ − 𝑅𝑇𝑎 Ec. 3.8

Donde kd es la constante de inactivación enzimática, k es la constante de Arrhenius,

Ea es la energía de activación, R la constante universal de los gases y T la temperatura
absoluta. Al graficar la ecuación 3.8, se obtiene como pendiente la relación entre la
energía de activación (Ea) y la constante de los gases (R), como se observa en la Figura
3.6.

Figura 3.6. Representación gráfica de la ecuación de Arrhenius. Fuente: Leskovac

(2007)

Tenemos así que la ecuación 3.2 se ve afectada por esta constante de inactivación kd,
obteniendo la ecuación 3.9.

𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑒−𝑘𝑑𝑡 [𝑆]

𝑣 = 𝐾𝑚 +[𝑆]
Ec. 3.9

De la ecuación 3.9 se establece el término de actividad enzimática residual, la cual

representa el porcentaje de actividad enzimática que no se ha perdido por inactivación,
y se representa mediante la ecuación 3.10.

𝐴𝑐𝑡𝑟𝑒𝑠 = 𝑒 −𝑘𝑑𝑡 ∗ 100 Ec. 3.10

El tiempo de vida medio es un término utilizado para describir el tiempo en el cual la

actividad de la enzima se reduce a la mitad debido a inactivación (Marangoni, 2003) y
se representa mediante la ecuación 3.11.

ln 2
𝑡0.5 = 𝑘 Ec. 3.11
𝑑

Otro factor que influye en la velocidad de las reacciones enzimáticas es la presencia de

inhibidores. Un inhibidor enzimático es un compuesto que altera la actividad catalítica

pág. 18
de una enzima disminuyendo, o en algunos casos, parando su actividad (Whitehurst y
van Oort, 2010). Esta acción sobre la actividad de la enzima puede describirse como
inhibición reversible o irreversible (Chang, 2000). La inhibición irreversible no puede
aplicarse a la cinética de Michaelis-Menten, y su efectividad no puede ser determinada
por una constante de equilibrio, sino por la velocidad de unión del inhibidor a la enzima
(Chang, 2000). La inhibición reversible puede ser calculada utilizando la cinética de
Michaelis-Menten, pero va a depender del tipo de inhibición reversible: competitiva (Ec.
3.12), no competitiva (Ec 3.13) y acompetitiva (Ec 3.14).

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑣 = Ec. 3.12
∝𝐾𝑚 +[𝑆]

(𝑉𝑚𝑎𝑥 ⁄∝) [𝑆]

𝑣 = Ec. 3.13
𝐾𝑚+[𝑆]

(𝑉𝑚𝑎𝑥 ⁄∝) [𝑆]

𝑣 = Ec. 3.14
(𝐾𝑚⁄∝)+[𝑆]

Donde  es el factor adimensional de inhibición y se define como:

[𝐼]
∝= 1+ Ec. 3.15
𝐾𝑖

Siendo I la concentración del inhibidor y Ki la constante de disociación del complejo

enzima-inhibidor. Si se linealizan las ecuaciones 3.12, 3.13 y 3.14 mediante el método
de Lineweaver–Burk, se pueden calcular los parámetros cinéticos y los parámetros de
inhibición reversible, como se observa en las Figuras 3.7, 3.8a y 3.8b para las
inhibiciones reversibles competitiva, no competitiva y acompetitiva, respectivamente.

a) b)

c)

Figura 3.8. Gráfica de Lineweaver–Burk de inhibición reversible. a) competitiva, b) no

competitiva, c) acompetitiva. Fuente: Chang (2000)

pág. 19
OBJETIVO

Calcular los parámetros cinéticos de una enzima sobre un sustrato y el efecto de los
inhibidores sobre su actividad catalítica para la selección de parámetros en procesos de
producción de ingredientes o alimentos.

PROCEDIMIENTO

Actividades previas a la práctica

1. Armar grupos de 2 personas.
2. Desarrollar los ejercicios que se encuentran en la sección “Reporte”.
3. Al iniciar la clase, entregar los ejercicios resueltos en hojas A4 con el nombre de
cada integrante.

NOTA: Es necesario mostrar las fórmulas y cálculos detallados de cada ejercicio, así
como la respuesta correctamente identificada.

Actividades durante la práctica

1. Armar grupos de 2 personas.
2. Desarrollar en clases los ejercicios entregados por el profesor.
3. Al finalizar la clase, entregar los ejercicios resueltos en hojas A4 con el nombre de
cada integrante.

NOTA: Se puede solicitar solo la ayuda del profesor y se puede hacer uso del formulario
que se encuentra en el Anexo 2 de esta guía.

REPORTE

1. La enzima -galactosidasa (EC 3.2.1.23) cataliza la hidrólisis de la lactosa en

glucosa y galactosa, es una enzima ampliamente usada en la industria láctea. Una
preparación comercial líquida de -galactosidasa de Kluyveromyces marxianus var
lactis es usada para la producción de leche baja en lactosa. Se sabe que 500 U/l
de leche de -galactosidasa se requiere para reducir el contenido de lactosa en
leche en un 80% durante su almacenamiento. Se requiere calcular la dosis de
enzima requerida (ml de preparación enzimática a ser añadida por litro de leche).
Para esto, la actividad de la preparación enzimática debe ser determinada. El
procedimiento consiste en añadir 0.3 ml de la preparación enzimática, diluida tres
veces, a 1.2 ml de la solución de lactosa con una concentración de 150 g/L,
incubando la mezcla a 35 ºC y pH 6.4. Las muestras son tomadas a diferentes
tiempos de reacción y sujetas a inactivación enzimática. Los resultados obtenidos
se muestran en la Tabla 3.1.

Tabla 3.1. Concentración de glucosa en la muestra (g) luego del tiempo de

incubación (t) con la enzima -galactosidasa
t (min) 0 2 4 6 8 12 18 26 36 48
g (mM) 0 150 307 461 597 912 942 976 999 1015

pág. 20
2. Una lipasa de Candida cylindracea es usada para la hidrólisis de ésteres. La enzima
actúa selectivamente sobre S-enantiómeros para producir alcoholes como
productos de hidrólisis. Los datos de velocidades de reacción obtenidos con dicha
enzima se muestran en la Tabla 3.2.

Tabla 3.2. Velocidad de formación de producto (v) a diferentes concentraciones

de sustrato (éster) e inhibidor (OH)
v (umoles OH/min genzima)
Éster (mM) OH = 0 mM OH = 20 mM OH = 40 mM OH = 90 mM
4 33.3 32.4 31.6 29.6
8 57.1 54.6 52.2 47.1
16 88.9 82.8 77.4 66.7
24 109.1 100 92.3 77.4
32 123.1 111.6 102.1 84.2

- Identificar el mecanismo de inhibición ejercido por el alcohol sobre la lipasa.

- Calcular los correspondientes parámetros cinéticos de la reacción con y sin
inhibición.
- Determinar la constante de inhibición.

3. Durante la producción de jugo de manzana, las manzanas son molidas y tratadas

con pectin-esterasas. La pectina es un polisacárido y partes de las unidades del
carbohidrato tienen grupos metil conectados vía enlaces ésteres. La enzima pectin-
esterasa cataliza la hidrólisis de los enlaces metil-éster. La actividad residual del
enzima luego de 4 horas fue medida a diferentes temperaturas y los resultados se
muestran en la Tabla 3.3.
- Calcular, ¿en qué tiempo del proceso la actividad residual del enzima disminuye
en un 25%?

Tabla 3.3. Tiempo de vida medio de la enzima a diferentes temperaturas

Temperatura (ºC) Tiempo de vida medio (h)
30 14.98
40 7.92
50 4.35

A 45 ºC y pH=7, los parámetros Michaelis-Menten son Vmax = 0.003 kg/m3 s y Km =

0.65 mg pectina/ml. La cantidad de pectina como sustrato es de 8 kg/m3.
- Calcular el valor de la constante de reacción (de primer orden o de orden cero).
- Recientemente una nueva pectin-esterasa está disponible. Los parámetros
Michaelis-Menten de este nuevo enzima son Vmax = 0.001 kg/m3 s y Km = 4.0
mg pectina/ml. La constante de inactivación a 45 ºC es 8*10-7 s-1. ¿Es correcto
esperar una mejora en el proceso si se utiliza esta nueva enzima? Justifique su
respuesta. (No es necesario hacer cálculos para sustentar la respuesta).

pág. 21
BIBLIOGRAFÍA

Chang, R. (2000). Physical Chemistry for the Chemical and Biological Sciences.
University Science Books.
Clarke, K.G. (2013). Bioprocess Engineering: An Introductory Engineering and Life
Science Approach. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited.
Leskovac, V. (2007). Comprehensive Enzyme Kinetics. New York, USA: Kluver
Academic Publishers.
Marangoni, A.G. (2003). Enzyme Kinetics: A Modern Approach. New Jersey, USA:
John Wiley & Sons, Inc.
Rogers, A. & Gibon, Y. (2009). Enzyme kinetics : Theory and practice. En: Plant
Metabolic Networks (editado por J. Schwender). Pág. 71–103. New York, USA:
Springer Science+Business Media, LLC.
Whitaker, J.R. (2003). Enzyme-catalyzed reactions. En: Handbook of Food
Enzymology (editado por J.R. Whitaker, A.G.J. Voragen & D.W.S. Wong). New
York, USA: Marcel Dekker, Inc.
Whitehurst, R.J. & Oort, M. van. (2010). Enzymes in Food Technology. Iowa, USA:
John Wiley & Sons, Ltd.

pág. 22
4 Aplicación de enzimas en la industria alimentaria

Las enzimas, debido a su naturaleza de catalizadores, tienen un gran potencial para la

aplicación en la industria de alimentos (James et al., 1996). Son utilizadas
principalmente para beneficios económicos como el aumento de los rendimientos y la
eficiente recuperación de proteínas, mientras proveen a los productos de calidad y
estabilidad (James et al., 1996). Además, ayuda a la elaboración de productos
amigables con el ambiente, ya que los procesos de fabricación se realizan con una
reducción en el consumo de energía, agua y materias primas, y con una baja generación
de desechos (James et al., 1996). Entre las aplicaciones más importantes están el
procesamiento de carnes, la elaboración de productos lácteos, el uso en panificación,
elaboración de jugo de frutas y producción de bebidas alcohólicas (Aehle, 2004).

En la industria cárnica, uno de los principales usos de enzimas es la tenderización o

ablandamiento de carnes, el cual es un proceso que se da naturalmente en el músculo
de los animales durante el proceso de rigor mortis, con la participación de proteasas
endógenas, principalmente catepsinas (Aehle, 2004). Este proceso ha sido estudiado
en detalle, así como el uso de enzimas exógenas para facilitarlo o mejorarlo (Aehle,
2004). Para este propósito se han estudiado aquellas enzimas capaces de degradar el
tejido conectivo y las proteínas del músculo, como es el caso de las proteasas de origen
vegetal, e.g., papaína, bromelina y ficina, las cuales son capaces de actuar en grandes
rangos de pH (Sandri et al., 2017), además de presentar ventajas sobre las proteasas
de origen bacteriano principalmente por los problemas de inocuidad como patogenicidad
u otros efectos adversos (Ketnawa y Rawdkuen, 2011).

La papaína es una enzima extraída del latex de papaya (EC 3.4.22.2) y es ampliamente
utilizada en tenderización de carnes debido a su habilidad para romper tanto las
proteínas miofibrilares como el tejido conectivo (Barekat y Soltanizadeh, 2017). Sin
embargo, el principal problema para la aplicación de enzimas es su distribución en el
tejido, lo cual está influenciado por el tiempo, difusión, contenido de sal y concentración
de la enzima (Aehle, 2004). Algunos de los métodos empleados para la tenderización
de las carnes con enzimas exógenas son inmersión, inyección, rociado y marinado
(Sandri et al., 2017).

OBJETIVO

Analizar los beneficios del uso de enzimas exógenas en la industria alimentaria

utilizando diferentes concentraciones de papaína para la tenderización de las carnes.

MATERIALES Y EQUIPOS

Carne de res
1 g de papaína
Agua destilada

pág. 23
Texturómetro
Balanza analítica
Refrigeradora
Tabla de cortar
Cuchillo
7 vasos de precipitado de 500 ml
Papel aluminio

PROCEDIMIENTO

Marinado de la carne
1. Preparar 300 ml de solución de papaína al 0.05, 0.1 y 0.2% p/p.
2. Cortar 27 trozos de carne de 3 cm3.
IMPORTANTE: El corte debe realizarse de manera perpendicular a la orientación
de la fibra muscular.
3. Sumergir 6 trozos de carne en 250 ml de cada una de las soluciones de papaína.
Para el blanco sumergir los trozos en 250 ml de agua destilada.
4. Colocar los 3 trozos sobrantes en papel aluminio (t=0).
5. Cubrir con plástico los vasos de precipitado con las muestras.
6. Colocar los vasos de precipitado con las muestras en refrigeración.
IMPORTANTE: Anotar la temperatura de refrigeración.
7. Tomar 3 muestras luego de 30 minutos (t=1) y 3 muestras más luego de 60 minutos
(t=2).
8. Realizar por triplicado el análisis de textura de las muestras en los diferentes
tiempos (t=0, t=1 y t=2), de acuerdo al procedimiento “Medición de textura”.

Medición de textura
1. Seleccionar la sonda de corte y colocar la muestra sobre la placa del texturómetro,
teniendo en cuenta que el corte debe ser perpendicular a la orientación de la fibra
muscular.
2. Configurar los parámetros para el test de textura, e.g., selección de sonda,
velocidad de corte (1 mm/s), tamaño de muestra, tipo de test (compresión).
3. Realizar el test de textura a través de toda la muestra.
4. Reportar la fuerza máxima de corte (firmeza) y el trabajo total (dureza).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Realizar un análisis estadístico con los diferentes tratamientos y tiempos,

analizando las diferencias significativas y la interacción entre los factores.
2. Discutir las propiedades de textura de la carne con los diferentes tratamientos y
tiempos.
3. Indicar qué tratamiento recomendaría para ser usado en la industria, ¿por qué?
4. Responder las siguientes preguntas:
- ¿Cuál es el mecanismo de acción de la papaína sobre el tejido muscular?
- Además del tiempo y temperatura, ¿qué factores cree que afectarían la actividad
de la enzima?

pág. 24
 - ¿En qué otros productos cárnicos se utilizan enzimas para su procesamiento?
- A más de utilizar enzimas, ¿qué otros procesos y/o compuestos se emplean para
la tenderización de las carnes?

BIBLIOGRAFÍA

Aehle, W. (2004). Enzymes in Industry. Segunda edición. Weinheim, Alemania: Wiley-

VCH.
Barekat, S. & Soltanizadeh, N. (2017). Improvement of meat tenderness by
simultaeous application of high-intensity ultrasonic radiation and papain treatment.
Innovative Food Science and Emerging Technologies, 39, 223–229.
James, J., Simpson, B.K. & Marshall, M.R. (1996). Application of enzymes in food
processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 36, 437–463.
Ketnawa, S. & Rawdkuen, S. (2011). Application of Bromelain Extract for Muscle
Foods Tenderization. Food and Nutrition Sciences, 2, 393–401.
Sandri, I.G., Piemolini-Barreto, L.T. & Fontana, R.C. (2017). Enzymes in Food
Processing. En: Biotechnology in Agriculture and Food Processing (editado por
P.S. Panesar & S.S. Marwaha). Pág. 329–353. Florida, USA: CRC Press

pág. 25
5 Factores que influencian la cinética enzimática

Entre los factores que afectan la cinética enzimática se encuentran la concentración del
sustrato, concentración de enzima, presencia y concentración de inhibidores o
cofactores, pH y temperatura (Whitaker, 2003). En esta práctica se considerará
principalmente el efecto del pH, temperatura y presencia de inhibidores en la actividad
enzimática.

La influencia del pH sobre la actividad enzimática se debe a su efecto sobre la

estabilidad de la enzima, al intervenir en las fuerzas electrostáticas que se forman entre
las cargas positivas y negativas de los grupos presentes en la enzima para lograr
mantener sus estructuras terciarias y cuaternarias (Whitaker, 2003). Este efecto de
desestabilización puede darse también en los aminoácidos del centro activo de la
enzima, provocando la pérdida de su conformación, así como sobre el sustrato o
cofactores presentes en la reacción (Whitaker, 2003). Todas las enzimas tienen un
rango de pH óptimo para su actividad, aunque la mayoría tiene un rango óptimo de pH
entre 5 y 7 (Jonke, 2004). Sin embargo, existen algunas enzimas que tienen valores de
pH extremos como la pepsina o tripsina (Figura 5.1).

Figura 5.1. Actividad de la enzima pepsina, sacarasa y tripsina en función del pH.
Fuente: Jonke (2004)

La temperatura afecta a las reacciones enzimáticas de la misma manera que una

reacción química; sin embargo, debido a la naturaleza proteica, la desnaturalización
térmica provoca una disminución de la velocidad de reacción (Shanmugam y
Sathishkumar, 2009). La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica
aproximadamente por cada 10 °C de aumento de temperatura (Q10=2), aunque este
coeficiente varía de una enzima a otra, debido a la barrera de energía para pasar al
estado de transición, i.e., energía de activación (Bisswanger, 2017). Como se muestra
en la Figura 5.2, la curva de actividad enzimática dependiente de la temperatura tiene
una forma de campana similar a la del pH. Sin embargo, debe ser interpretada de una
manera diferente, debido a que el incremento dado por el coeficiente Q10 al inicio de la
curva, se verá contrarrestado por el proceso de desnaturalización que sufre la enzima
luego de ciertas temperaturas (Bisswanger, 2017). La máxima actividad de una enzima
a cierta temperatura dependerá también del tiempo del ensayo o del proceso, pues la
exposición en tiempos prolongados a temperaturas elevadas, i.e., mayores a 37 °C,
provocará su desnaturalización (Shanmugam y Sathishkumar, 2009).
Figura 5.2. Actividad enzimática en función de la temperatura. Fuente: Shanmugam y
Sathishkumar (2009)

El efecto de inhibidores sobre la actividad catalítica de las enzimas puede ser reversible
o irreversible, dependiendo del mecanismo con el cual ejerza su efecto (Jonke, 2004).
En la inhibición irreversible el inhibidor se une covalentemente al centro activo del
enzima y esta unión no puede revertirse (Jonke, 2004). En el caso de la inhibición
reversible, la unión se da por enlaces no covalentes por lo que es posible revertirse
(Whitaker, 2003). Existen tres mecanismos de inhibición reversible. La inhibición
reversible competitiva se da cuando el inhibidor compite con el sustrato para lograr
unirse al centro activo de la enzima, lo cual se da porque su estructura química es
similar, este efecto puede revertirse aumentando la concentración de sustrato (Whitaker,
2003). La inhibición no competitiva ocurre cuando el inhibidor se une a la enzima en un
lugar diferente del centro activo, i.e., sitio alostérico, evitando la formación del producto,
pero no la unión del sustrato a la enzima. Esta inhibición depende de la concentración
del inhibidor y no puede ser contrarrestada por aumento de la concentración de sustrato
(Jonke, 2004). La inhibición acompetitiva se da cuando el inhibidor se une al complejo
enzima-sustrato o al complejo enzima-producto (Whitaker, 2003).

La investigación del efecto de los factores antes mencionados sobre la actividad de las
enzimas se realiza a través de la medición del cambio de la actividad enzimática en
función de estos factores, por ello, es posible determinar los rangos de pH y temperatura
óptimos, y el tipo de inhibición que ejerce un compuesto sobre determinada enzima.

La -amilasa es una endo-enzima utilizada principalmente en la industria de

panificación, hidroliza enlaces glucosídicos del almidón en la posición α-1,4, resultando
dextrinas de cadenas cortas con grados de polimerización de DP2 a DP12, actuando
sobre el almidón gelatinizado o con daños (van Oort, 2010). Las condiciones óptimas
para esta enzima van a depender de su origen, sea este microbiano, fúngico o vegetal.
La enzima -amilasa más usada en panadería es la enzima de origen fúngico
proveniente del Aspergillus oryzae, siendo una enzima termoestable, que inicia su
desnaturalización por encima de los 70 C (Aehle, 2004).

OBJETIVO

Analizar el efecto de la temperatura, el pH e inhibidores sobre la actividad enzimática

de la enzima alfa-amilasa mediante la medición de su actividad catalítica sobre almidón
de maíz en un tiempo determinado.

pág. 27
MATERIALES Y EQUIPOS

15 g de almidón de maíz
1.5 g de enzima -amilasa
1 g de glucosa en polvo
1 g de 3,5 ácido dinitrosalicílico (DNS)
30 g de tartrato mixto de sodio y potasio (sal de Rochelle)
50 ml de 2 M NaOH
150 ml de 0.2 M Na2HPO4
50 ml de 0.1 M ácido cítrico
1 ml de H2O2 al 3%
Hielo
Agua destilada
Espectrofotómetro
Baño María
Termómetro
Plato calentador con agitación
Balanza analítica
Medidor de pH
1 matraz aforado de 100 ml
65 tubos Eppendorf de 2 ml
3 gradilla para tubos Eppendorf
10 tubos Falcon 50 ml
3 micro-placas de 96 pocillos
1 vaso de precipitado de 50 ml
2 vasos de precipitado de 250 ml
1 vaso de precipitado de 1000 ml
Pipeta de 500 y 1000 ul
Puntas desechables
Pipetas de 5 y 10 ml
Rollo de parafilm

PROCEDIMIENTO

Preparación del reactivo para medición de azúcares (DNS)

1. En un vaso de precipitado de 250 ml, disolver 1 g de DNS en 40 ml de agua
destilada pre-calentada a 80 °C.
2. Adicionar poco a poco 30 g de sal de Rochelle.
3. Añadir 20 ml de 2 M NaOH y mezclar.
4. Verter cuidadosamente la mezcla en un matraz aforado de 100 ml.
5. Aforar con agua destilada.
6. Almacenar el reactivo a temperatura ambiente (20 - 25 °C) en un envase de vidrio
oscuro, o cubrir el envase de vidrio con papel aluminio.

Elaboración de curva de calibración

1. Preparar 50 ml de una solución de 10 g/l de glucosa en polvo (solución madre).

pág. 28
2. Realizar diluciones a diferentes concentraciones de la solución madre en tubos
Eppendorf, como se muestra en la Tabla 5.1.

Tabla 5.1. Volúmenes de diluciones para elaboración de la curva de calibración

A B C D E F G
Agua (ml) 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70
Solución de glucosa
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
10 g/l (ml)
Concentración de
0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00
glucosa (g/l)

3. Realizar el procedimiento “Medición de azúcares reductores”, para la determinación

de la relación Absorbancia (ABS) vs. Concentración de glucosa.

Preparación de soluciones buffers

1. Preparar 20 ml de soluciones buffers de pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 y 8.0, mezclando los
volúmenes indicados de 0.2 M Na2HPO4 y 0.1 M ácido cítrico, de acuerdo al
procedimiento para la obtención de McIlvaine buffer (McIlvaine, 1921).

Preparación de la enzima
1. Disolver 0.5 gramos de enzima -amilasa en 40 ml de agua destilada.

Preparación de 20 g/l de almidón (sustrato)

1. Mezclar 5 gramos de almidón de maíz en aproximadamente 200 ml de agua, con
agitación continua y temperatura aproximada de 50 °C.
2. Verter la solución en un matraz aforado de 250 ml y añadir agua hasta alcanzar el
volumen de aforo.
3. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

Efecto del pH en la velocidad enzimática

1. Preparar las soluciones de sustrato a diferentes pHs, mezclando en un tubo
Eppendorf 500 ul del sustrato con 500 ul de los diferentes buffers.
2. Colocar 1.5 ml de la solución de enzima en dos tubos Eppendorf.
3. Colocar todos los tubos Eppendorf (soluciones de sustrato más buffers y solución
de enzima) en baño María a 37 °C por 3 minutos.
4. Retirar los tubos Eppendorf del baño María.
5. Colocar 250 ul de las soluciones de sustrato, previamente atemperadas, en dos
tubos Eppendorf, uno será el blanco y otro será la muestra para cada valor de pH
analizado.
6. Añadir 250 ul de agua destilada a los tubos Eppendorf del blanco.
7. Añadir 250 ul de la solución de amilasa, previamente atemperada, a los tubos
Eppendorf de muestra de cada valor de pH analizado.
8. Dejar reposar todos los tubos Eppendorf en baño María a 37 °C por 10 minutos.
IMPORTANTE: El tiempo de reacción debe ser el mismo para cada tubo, por lo que
se debe asegurar que no sobrepase el tiempo establecido.
9. Retirar los tubos Eppendorf del baño María.
10. Añadir a todos los tubos Eppendorf (blanco y muestra) 0.5 ml de la solución 2 M
NaOH para detener la reacción enzimática.

pág. 29
11. Realizar la medición de la concentración de productos, de acuerdo al procedimiento
“Medición de azúcares reductores”.

Efecto de la temperatura en la velocidad enzimática

1. Mezclar 500 ul de sustrato y 500 ul de la solución buffer pH 7.0 en 5 tubos
Eppendorf.
2. Colocar 500 ul de la solución de enzima en 5 tubos Eppendorf.
3. Atemperar por 3 minutos un tubo Eppendorf con solución de sustrato (sustrato más
buffer) y un tubo Eppendorf con solución de enzima a 37, 45, 55 y 65 °C. Los tubos
Eppendorf restantes se analizarán a temperatura ambiente.
IMPORTANTE: Tomar y anotar la temperatura ambiente.
4. Retirar los tubos Eppendorf de los baños María.
5. Colocar 250 ul de las soluciones de sustrato previamente colocadas a las diferentes
temperaturas, en dos tubos Eppendorf, uno será el blanco y otro será la muestra
para cada temperatura analizada.
6. Añadir 250 ul de agua destilada a los tubos Eppendorf del blanco de cada
temperatura.
7. Añadir 250 ul de la solución de amilasa, previamente colocada a la misma
temperatura, a los tubos Eppendorf de muestra de cada temperatura analizada.
8. Dejar reposar los tubos Eppendorf en baño María a 37, 45, 55, 65 °C y temperatura
ambiente, según corresponda, por 10 minutos.
IMPORTANTE: El tiempo de reacción debe ser el mismo para cada tubo, por lo que
se debe asegurar que no sobrepase el tiempo establecido.
9. Añadir a todos los tubos Eppendorf (blanco y muestra) 0.5 ml de la solución 2 M
NaOH para detener la reacción enzimática.
10. Realizar la medición de la concentración de productos, de acuerdo al procedimiento
“Medición de azúcares reductores”.

Efecto de inhibidores en la velocidad enzimática

1. Mezclar en 3 tubos Eppendorf 500 ul de sustrato y 500 ul de solución buffer pH 7.0.
2. Preparar en diferentes tubos Eppendorf las soluciones de la Tabla 4.2, utilizando
los tubos Eppendorf preparados previamente (sustrato más buffer).

Tabla 4.2. Volúmenes para preparación de soluciones con H2O2

A B C
Sol. sustrato+buffer (ml) 1.0 0.60 0.20
H2O2 al 3% (ml) 0 0.40 0.80

3. Colocar 1.5 ml de solución de enzima en un tubo Eppendorf.

4. Colocar todos los tubos Eppendorf (soluciones A, B, C y solución de enzima) en
baño María a 37 °C por 3 minutos.
5. Retirar los tubos del baño María.
6. Colocar 250 ul de las soluciones previamente atemperadas (soluciones A, B y C)
en dos tubos Eppendorf, uno será el blanco y otro será la muestra para cada
solución preparada.
7. Añadir 250 ul de agua destilada a los tubos Eppendorf del blanco de cada solución.
12. Añadir 250 ul de la solución de amilasa, previamente atemperada, a los tubos
Eppendorf de muestra de cada solución preparada.

pág. 30
8. Dejar reposar todos Eppendorf en baño María a 37 °C por 10 minutos.
IMPORTANTE: El tiempo de reacción debe ser el mismo para cada tubo, por lo que
se debe asegurar que no sobrepase el tiempo establecido.
9. Añadir a todos los tubos Eppendorf (blanco y muestra) 0.5 ml de la solución 2 M
NaOH para detener la reacción enzimática.
10. Realizar la medición de la concentración de productos, de acuerdo al procedimiento
“Medición de azúcares reductores”.

Medición de azúcares reductores

1. Mezclar 500 ul de las muestras, incluidos los blancos, con 500 ul del reactivo DNS
en tubos Eppendorf.
2. Cubrir los tubos Eppendorf con papel parafilm.
3. Calentar a 100 °C por 10 minutos en baño María.
4. Enfriar en hielo por 5 minutos.
5. Realizar la lectura de absorbancia a 540 nm de la micro-placa vacía.
6. Colocar 200 ul de las muestras en los pocillos de la micro-placa, POR TRIPLICADO.
7. Realizar la lectura de la absorbancia de las muestras a 540 nm.
IMPORTANTE: Cuando la absorbancia es mayor a 1.0 se debe diluir la muestra,
para obtener valores menores a 1.0. A los valores de absorbancia de cada muestra
se le debe restar los valores de absorbancia de la micro-placa vacía y del blanco.
En caso de haber realizado diluciones, primero se hacen las restas y luego se
multiplica por el factor de dilución correspondiente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Realizar la curva de calibración, graficando Absorbancia (ABS) vs. Concentración

de glucosa (g/l), calcular la ecuación que describe a la recta (Excel). Verificar el R2.
Mostrar cálculos en sección Anexos.
2. Calcular la velocidad de reacción (concentración de glucosa/tiempo) de cada
tratamiento (temperatura, pH e inhibidor), utilizando los datos de ABS y la ecuación
de la recta de la curva de calibración. Mostrar cálculos en sección Anexos.
3. Realizar las gráficas de Velocidad de reacción (mM glucosa/min) vs. Temperatura
y vs. pH. Discutir: la temperatura y pH óptimos de la enzima. ¿A qué temperatura
y pH ocurre la desnaturalización de la enzima? ¿Por qué se da la disminución o
aumento de la actividad enzimática?
4. Analizar si el peróxido de hidrógeno presentó algún efecto inhibidor sobre la
actividad enzimática. Si es así, ¿qué tipo de inhibición se observó? Explique.
5. Responder las siguientes preguntas:
- Según el rango de temperatura y pH para la actividad de la enzima ¿Cuál cree
usted sería su origen?
- ¿Qué otra sustancia puede actuar como inhibidor para la alfa-amilasa?
- ¿Qué espera observar en las curvas de temperatura, pH y concentración de
inhibidor si se continúan aumentando o disminuyendo los valores en el eje de
las X? Explique.
- ¿Cuál es el principio del método colorimétrico con DNS para la medición de
azúcares reductores?

pág. 31
BIBLIOGRAFÍA

Aehle, W. (2004). Enzymes in Industry. Segunda edición. Weinheim, Alemania: Wiley-

VCH.
Bisswanger, H. (2017). Enzymes Kinetics: Principles and Methods. Tercera edición.
Weinheim, Alemania: Wiley-VCH.
Jonke, A. (2004). Catalytic activity of enzymes. En: Enzymes in Industry (editado por
W. Aehle). Pág. 13–26. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH.
McIlvaine, T.C. (1921). A buffer solution for colorimetric comparison. The Journal of
Biological Chemistry, 49, 183–186
Oort, M. van. (2010). Enzymes in bread making. En: Enzymes in Food Technology
(editado por R.J. Whitehurst & M. van Oort). Pág. 103–143. Iowa, USA: John
Wiley & Sons, Ltd.
Shanmugam, S. & Sathishkumar, T. (2009). Enzyme Technology. New Delhi, India: I.
K. International.
Whitaker, J.R. (2003). Enzyme-catalyzed reactions. En: Handbook of Food
Enzymology (editado por J.R. Whitaker, A.G.J. Voragen & D.W.S. Wong). New
York, USA: Marcel Dekker, Inc.

pág. 32
6 Uso de biorreactores
“Curva de crecimiento de S. cerevisiae”

Los biorreactores son equipos utilizados para llevar a cabo reacciones bioquímicas con
el fin de convertir un sustrato en producto o biomasa, manteniendo las condiciones
óptimas para el crecimiento de células o producción de metabolitos mediante la
regulación estricta de varios factores ambientales claves, i.e., físicos y químicos
(Georgiev, 2014).

En la mayoría de los procesos lo que se requiere es la producción de un metabolito, e.g,

antibióticos, etanol, ácidos orgánicos, siendo la producción de biomasa algo incidental,
por lo que es posible su supresión. En estos casos una vez que se alcanza la cantidad
deseada de producto, el organismo productor termina siendo un desecho que debe ser
descartado de manera segura y con un costo, o usada como una fuente barata para
alimento animal (Waites et al., 2001). No obstante, en el proceso de producción de
biomasa, las células producidas durante la fermentación son los productos que se
requieren obtener, por lo que el proceso de fermentación es optimizado para lograr la
máxima producción de concentración de células (Waites et al., 2001).

Entre los principales usos de la biomasa microbiana en la industria se encuentran su

uso como cultivo iniciador para procesos de fermentación, tratamiento de desechos, o
como fuente de proteínas para alimento humano o animal (Waites et al., 2001).

A nivel industrial el medio que normalmente se utiliza para la producción de biomasa es

la melaza como fuente de carbón y energía, la cual es sometida a pre-tratamientos para
eliminación de ciertos componentes y esterilización del medio, además de la adición de
ciertos aminoácidos y sales ausentes en el medio (Waites et al., 2001). Una producción
elevada de biomasa se obtiene a través de una fermentación aerobia, por lo que el
objetivo es mantener estas condiciones durante el proceso a través de una aireación
que debe aumentar conforme se da el proceso de fermentación, evitando la producción
de etanol que resultaría en una disminución del rendimiento de biomasa (Waites et al.,
2001).

OBJETIVO

Realizar la curva de crecimiento microbiano de la levadura S. cerevisiae mediante la

operación de un biorreactor en batch a escala de laboratorio.

MATERIALES Y EQUIPOS

15 g de levadura activa seca (cultivo de Saccharomyces cerevisiae)

150 g de caldo glucosado Sabouraud (glucosa 20 g/l, tripteína 5 g/l, peptona de carne 5
g/l)
250 ml de KH2PO4 al 20% p/v
10 l de agua desionizada
Biorreactor
Espectrofotómetro
Balanza analítica
Matraz aforado
Agitador
3 vasos de precipitado de 500 ml
Pipeta de 1000 ul
Pipeta de 200 ul
Puntas desechables
1 micro-placa de 96 pocillos
2 tubos Falcon de 50 ml
25 g de detergente
60 ml de cloro comercial
Alcohol potable al 70%

PROCEDIMIENTO

Elaboración de la curva de calibración

1. Preparar una solución 0.5% p/v de levadura en caldo glucosado Sabouraud.
2. Realizar soluciones de caldo glucosado Sabouraud con levadura a diferentes
concentraciones en tubos Eppendorf como se muestra en la Tabla 6.1.

Tabla 6.1. Preparación de diluciones para curva de calibración

A B C D E F G
Medio (ml) 1.50 1.35 1.20 0.90 0.60 0.30 0
Solución levadura 0.5% (ml) 0 0.15 0.30 0.60 0.90 1.20 1.50
Concentración de levadura
0 0.50 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
(g/l)

3. Medir la absorbancia de las soluciones preparadas de acuerdo al procedimiento

“Medición de biomasa producida”.

Limpieza y preparación del biorreactor

1. Desconectar todos los cables del panel de control eléctrico.
2. Desajustar las 4 roscas del cabezal del equipo y quitar el cabezal que incluye el
motor, la tapa del biorreactor, el eje y las aspas de agitación.
IMPORTANTE: Tener cuidado con los cables y con el derrame de algún residuo.
3. Separar el cilindro del biorreactor de la estructura que posee los deflectores.
4. Disminuir restos visibles por medio de un enjuague con agua.
5. Lavar el cilindro, la estructura con deflectores y la tapa con las aspas de agitación
por separado, con una solución de detergente (22 g/l) y una esponja.
6. Remojar las estructuras con una solución clorada (60 ml/l) por 5 minutos.
7. Enjuagar con agua.
8. Aplicar alcohol al 70% por medio de una bomba spray y dejar secar.
9. Armar nuevamente el biorreactor con todas sus partes.
IMPORTANTE: Lavar y desinfectar las manos previamente.

pág. 34
Producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae
1. Colocar 10 litros de agua desionizada en el cilindro del biorreactor.
2. Suspender 150 gramos de caldo glucosado Sabouraud en el agua.
3. Dejar reposar por 5 minutos.
4. Activar la agitación y el calentamiento.
5. Realizar la esterilización del medio, manteniendo la temperatura a 121 °C por 15
minutos.
6. Para enfriar el medio de cultivo, apagar el biorreactor y dejar reposar por 24 horas.
7. Prender el biorreactor y programar una temperatura de 32 °C  2 °C.
8. Añadir 250 ml de una solución al 20% p/v de KH2PO4, previamente esterilizada.
9. Permitir la agitación por 2 minutos.
10. Tomar dos muestras de 50 ml del medio (blanco) y ubicarla en un tubo Falcon.
11. Medir el pH del blanco y anotar.
12. Tomar 3 alícuotas de 250 ml de medio de cultivo.
13. Preparar 3 soluciones de 1.6% p/v de levadura activa seca, utilizando el medio de
cultivo esterilizado como medio de dilución.
14. Colocar las 3 diluciones en el biorreactor.
15. Anotar la hora de inoculación.
16. Tomar una muestra antes de cumplirse los 2 minutos de inoculación (t=0).
17. Tomar cada hora una muestra del biorreactor, hasta cumplir 8 horas del proceso.
18. Medir la absorbancia de las muestras, incluido el blanco, de acuerdo al
procedimiento “Análisis de muestra”.
19. Terminado el tiempo de fermentación, esterilizar el medio de cultivo con la biomasa
producida y lavar el biorreactor de acuerdo al procedimiento “Limpieza y
preparación del biorreactor”.

Medición de biomasa producida

1. Programar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 590 nm con agitación
previa por 4 segundos de la muestra.
2. Colocar la micro-placa vacía en el espectrofotómetro y realizar la lectura de la
absorbancia de la micro-placa.
3. Guardar o copiar los resultados obtenidos.
4. Retirar la micro-placa, evitando tocar la parte inferior, y con una pipeta colocar 200
ul de la muestra en tres pocillos de la micro-placa (lectura en triplicado).
5. Colocar la micro-placa con las muestras en el espectrofotómetro y realizar la lectura
de la absorbancia.
IMPORTANTE: En caso de que la absorbancia sea mayor a 1.0 se deben realizar
diluciones para obtener valores menores a 1.0.
6. Guardar o copiar los resultados obtenidos.
IMPORTANTE: A los valores de absorbancia de cada muestra se le debe restar los
valores de absorbancia de la micro-placa vacía y del blanco. En caso de haber
realizado diluciones, primero se hacen las restas y luego se multiplica por el factor
de dilución correspondiente.

pág. 35
REPORTE

1. Realizar la curva de calibración, graficando Absorbancia (ABS) vs. Concentración

de levadura (g/l). Calcular la pendiente e intercepto de la ecuación y = ax + b (Excel)
que describe a la recta. Verificar el R2. Mostrar los cálculos en la sección Anexos.
2. Calcular la cantidad de biomasa producida por litro de medio de cultivo a través del
tiempo, utilizando la ecuación de la recta obtenida de la curva de
calibración. Mostrar los cálculos en la sección Anexos.
3. Realizar una gráfica de Concentración de biomasa (g/l) vs. Tiempo (h). Analizar y
discutir los resultados encontrados.
4. Determinar la tasa específica de crecimiento (μ), el tiempo de generación (g), el
número de generaciones (n), la productividad máxima y total de biomasa.
5. Responder las siguientes preguntas:
- ¿Qué haría falta para poder obtener el rendimiento de biomasa-sustrato?
- Basado en el tipo de organismo utilizado en la fermentación, ¿qué productos o
metabolitos podríamos encontrar en el medio de cultivo a través del tiempo?
- ¿Por qué se añade KH2PO4 al medio de cultivo?
- ¿Qué espera observar en la curva de producción de biomasa si aumentamos las
horas de proceso a más de 12? Explique
- ¿Cuáles son los métodos para la recuperación de la biomasa producida?

BIBLIOGRAFÍA

Georgiev, M.I. (2014). Design of Bioreactors for Plant Cell and Organ Cultures. En:
Production of Biomass and Bioactive Compounds Using Bioreactor Technology
(editado por K.Y. Paek, H. Niranjana Murthy & J.J. Zhong). Pág. 3–16. New York,
USA: Springer Science+Business Media, LLC.
Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S. & Higton, G. (2001). Industrial Microbiology:
An Introduction. Oxford, UK: Blackwell Science Ltd.

pág. 36
ANEXO 1: Formulario de cinética microbiana

𝑁𝑡 = 𝑁0 2𝑛

𝑡 𝑡 ln 2
𝑡𝑑 = =
𝑛 ln 𝑁𝑡 − ln 𝑁0

ln 𝑥𝑡 = ln 𝑥0 + 𝜇𝑡

0.693
𝜇=
𝑡𝑑

𝜇𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝜇=
𝐾𝑠 + [𝑆]

𝑑𝑥
𝑃= ∗ 100%
𝑑𝑡

𝑑𝑥
𝑌𝑥/𝑆 = −
𝑑𝑆

𝑑𝑃
𝑌𝑃/𝑆 = −
𝑑𝑆

𝑑𝑆
𝑟𝑆 = −
𝑑𝑡

𝑑𝑥
𝑟𝑥 =
𝑑𝑡

𝜇
𝑞𝑆 =
𝑌𝑥/𝑆

𝑟𝑥
𝑟𝑆 =
𝑌𝑥/𝑆

1 1 𝑚𝑠
= +
𝑌𝑥/𝑆 𝑌𝑥/𝑆 𝜇
ANEXO 2: Formulario de cinética enzimática

(𝑉𝑚𝑎𝑥 )([𝑆])
𝑣 =
𝐾𝑚 + [𝑆]

1 𝐾𝑚 1
= +
𝑣 (𝑉𝑚𝑎𝑥 )([𝑆]) 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝑣
𝑣 = −𝐾𝑚 + 𝑉𝑚𝑎𝑥
([𝑆])

[𝑆] 1 𝐾𝑚
= [𝑆] +
𝑣 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐸𝑎⁄ 𝐽
ln(𝐾𝑑 ) = ln(𝐾∝ ) − 𝑅𝑇 𝑅 = 8.314 𝐾
𝑚𝑜𝑙

(𝑉𝑚𝑎𝑥 )([𝑆]) [𝐼]

𝑣 = ∝= 1+
∝ 𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑖

(𝑉𝑚𝑎𝑥 ⁄∝)([𝑆]) ln(2)

𝑣 = 𝑡0.5 =
𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑑

(𝑉𝑚𝑎𝑥 ⁄∝)([𝑆])
𝑣 =
(𝐾𝑚 ⁄∝) + [𝑆]

(𝑉𝑚𝑎𝑥 )(𝑒 −𝐾𝑑 𝑡 )([𝑆])

𝑣 = 𝐴𝑐𝑡𝑟𝑒𝑠 = 𝑒 −𝐾𝑑 𝑡 ∗ 100
𝐾𝑚 + [𝑆]