CITOMETRÍA DE FLUJO

Esta técnica analítica que permite conocer la duración

del ciclo y sus fases y además aspectos funcionales y
morfológicos de las células. Con esta técnica, se puede
realizar un histograma de la cantidad de células en
función de su cantidad de ADN. Con esta información,
se pueden distinguir las diferentes fases del ciclo,
observándose que en la fase S aumenta la cantidad
de ADN con respecto a la fase G0-G1 y finalmente
hay un pico que corresponde a la fase G2.

Este sistema está formado por:

• Fluidos: introducen las células en el punto de interrogación

• Componentes ópticos: genera y recoge las señales

• Componentes electrónicos: convierte las señales ópticas en señales eléctricas.

REPARACIÓN DEL ADN

Existen diferentes agentes físicos, químicos y biológicos que pueden alterar la proliferación celular
mediante alteraciones en el ADN, enzimas o membranas.
→ Los agentes físicos son por ejemplo radiaciones ionizantes (Rx y Rγ), radiaciones no ionizantes
(UV) y la temperatura.
→ Los agentes químicos pueden ser por ejemplo drogas radiomiméticas, son capaces de provocar
daño en el ADN.
→ Los agentes biológicos, virus, capaces de producir daño a nivel genomico.
 RADIACIONES IONIZANTES Y NO IONIZANTES
Ionizantes

Las radiaciones ionizantes son aquellas que tienen una energía superior al potencial de ionización de un
átomo, eso quiere decir que tiene una energía suficiente como para interaccionar con un electrón y que
este salga eyectado, quedando un átomodesbalanceado energéticamente.

La etapa física de la acción biológica de estas radiaciones puede darse

por:

• Acción directa: consecuencia de ionizaciones que se producen

en los átomos que forman la molécula de ADN cuando el haz de
radiación interactúa directamente con esta molécula.
• Acción indirecta: interacción del haz de radiación con otros
átomos y moléculas de la célula (por ejemplo, el agua),
produciendo radicales libres que, al difundir hasta la molécula
de ADN, la dañan de manera indirecta.

La radiólisis del agua

produce especies
reactivas del oxígeno,
las cuales son iones de
oxígeno, peróxidos o
radicales libres. Estos
últimos son sustancias
muy reactivas ya que
tienen electrones que no
están apareados en la
capa de valencia e
intentan estabilizarse
“robando” electrones a
otros átomos o
moléculas provocando
una reacción en cadena
de radicales libres.

La célula tiene un mecanismo en el cual puede procesar estas sustancias reactivas. Estos mecanismos
están dados por enzimas como:
▲ Superóxido dismutasas (SOD): procesa el radical superóxido (O-2) dando lugar a la
formación de peróxido de hidrogeno (H2O2) y oxígeno.
▲ Peroxidasas y catalasas: son capaces de procesar el peróxido de hidrogeno.
▲ Las vitaminas C y E, los fenoles y el glutatión, son capaces de interrumpirá las
reacciones en cadena de los radicales libres.
No ionizantes

Este tipo de radiación no tiene la energía suficiente como para ionizar la materia, pero si son capaces
de producir cambios a nivel del genoma. La más estudiada es la radiación UV, siendo la luz solar su
fuente más importante.
Se puede clasificar según su longitud de onda:
→ UVC de 100 a 280 nm (es la de mayor energía)
→ UVB de 280 a 320 nm
→ UVA de 320 a 400 nm
Los principales daños que se producen por exposición a la radiación UV son la formación de dímeros en
pirimidinas adyacentes.
Estos dímeros pueden ser:
→ Dímeros de pirimidinas cis-syn ciclobutano (CPD): es el daño más común, siendo el más
frecuente el dímero de timinas, luego el de timina y citosina y los menos frecuentes son de
citosina-citosina.
→ Fotoproducto pirimidina (6-4) pirimidona (6-4PP): en este caso, el dímero más frecuente es
C-C y el menos frecuente el T-T.

La formación de enlaces covalentes entre pirimidinas genera una gran distorsión a nivel del genoma,
por lo tanto, este tipo de lesiones son potencialmente letales, mutagénicas y oncogénicas.

Bleomicina: antibiótico que se intercala con el ADN por acciones de oxido-reducción con iones
metálicos generando radicales libres. Genera daños del tipo producidos por la acción indirecta de
las radiaciones ionizantes, por eso se dice que es un radiomimético (se mimetiza con los efectos
producidos por la radiación ionizante indirecta).
Benzopireno: producto de la combustión del combustible y cigarrillos. Al metabolizarse se fija en
forma de diolepóxido al ADN, el cual es un agente cancerígeno muy poderoso.

DAÑOS EN EL ADN

Tanto los daños exógenos como

endógenos, son una fuente potencial
de inestabilidad genómica, originando
alteraciones que van desde
mutaciones puntuales a grandes
reordenamientos cromosómicos.

La inestabilidad genética es necesaria

en algunos momentos ya que puede
considerarse un mecanismo de
variabilidad genética, pero esto está
regulado de manera que se preserve la
integridad del genoma. También es un
fenómeno asociado al envejecimiento celular y a la predisposición, inicio y desarrollo de varios tipos de
cáncer y de enfermedades hereditarias, por lo que es imprescindible que la célula sea capaz de
reaccionar adecuadamente al daño producido en el ADN y así mantener la integridad del genoma.
Para evitar la inestabilidad genómica que compromete la sobrevida
celular, los eucariotas cuentan con un mecanismo de vigilancia
denominado checkpoint. Este mecanismo cuenta con una serie de
sensores que detectan el daño y generan una señal, que, mediante
la acción de proteínas adaptadoras, se transmite hacia
efectores. Los efectores actúan sobre una serie de dianas.
Dependiendo de la fase del CC en la que se encuentre el daño, se
van a dar diferentes respuestas celulares:

→ Bloqueo o retraso de la progresión del CC hasta que se

complete la reparación del daño.
→ Activación de la reparación a distintos niveles. Por ejemplo:
inducción transcripcional de genes de reparación, activación
directa de proteínas de reparación, relocalización de los
factores de reparación hacia los sitios de daño.
→ Estabilización de las horquillas de replicación que detienen su
avance al encontrarse con un error. Luego se reanudará la
síntesis de ADN cuando se repare el daño.
→ En el caso de eucariotas superiores, la activación de rutas de
apoptosis cuando no se pudo reparar el daño.

La respuesta más estudiada ha sido el bloqueo del CC, y en particular el acoplado a la actividad del gen
p53, el cual es un gen supresor de tumores. Este gen está regulado de manera postraduccional por una
proteína llamada MDN2.

En condiciones normales, la célula expresa continuamente el gen p53, produciendo la proteína p53,
pero a la vez se degrada de manera continua.
Frente a ciertas señales se puede bloquear
su degradación y la cantidad de p53
aumenta. Si el daño no es demasiado grave,
p53 se activa de manera que detiene el CC
abriendo una “ventana temporal” para su
reparación.
La estabilización de p53 es inducida por
factores como la anoxia, daño en el
ADN, desbalance de señales,etc.
Provoca la detención del ciclo celular por
inducción de P21
Reparación de ADN, angiogénesis,
apoptosis.
Los componentes clave de señalización de
daño en el ADN en células de mamíferos
son las proteínas quinasas ATM y ATR.
ATM y ATR don los transductores
maestros de las señales de ADD, y
orquestan una gran red de procesos
celulares para mantener la integridad
genómica.
ATM se activa principalmente por la rupturas de hebras de ADN de doble hebra (DSBs) y ATR
responde a un amplio espectro de daños en el ADN . Los blancos a ser foaforilados por ATM
incluyen a p53, Chk2, BRACA1 y NBS1

REPARACIÓN DEL ADN

• Las lesiones producidas en el ADN por distintos agentes pueden repararse con cierta
probabilidad, dependiendo de factores:
✓ Genéticos
✓ Metabólicos Ambientales
• Involucran sistemas enzimáticos y se encuentran presentes desde virus hasta mamíferos, incluso
células tumorales.

• Importancia de la reparación:
✓ Estabilidad del genoma
✓ Mutagénesis – biodiversidad
✓ Envejecimiento (acumulación de errores)
✓ Transformación maligna
✓ Muerte celular

MECANISMSO E REPARACION:
• Mecanismos simples de reparación: es la reversión directa del daño. Dentro de este mecanismo
se encuentran:
o Reparación por foto-reactivación
o Reparación de bases alquiladas

• Mecanismos complejos de reparación:

o Reparación escicional ( de nucleótidos, de base, de base
mal apareadas)
o Reparación recombinacional
o Reparación post-replicativa

Entre los diferentes tipos de lesiones que afectan al ADN las DSBs pueden considerarse las más
peligrosas.
Las células cuentan con dos mecanismos de reparación de DSBs:

• Union de extremos no homólogos (NHEJ)

• Recombinacion homologa (HR)
 Para las roturas dobles de ADN (DBS) existen dos mecanismos de reparación:
UNIÓN DE EXTREMOS NO HOMÓLOGOS
(NHEJ)
El sitio de corte es reconocido por un complejo
heterodímero de dos proteínas, KU70 y KU80,
que protegen el ADN de la acción de
exonucleasas y mantienen unidas a las cadenas.
La unión de la proteína KU al ADN recluta a la
subunidad catalítica de la proteína quinasa
dependiente de ADN (DNA-PKcs), formando
DNA-PK activado. Esta actividad quinasa facilita
el reclutamiento de un complejo de ligación que
abarca la ADN ligasa IV, complemento cruzado
de rayos X grupo 4 (XRCC4) y XRCC4-like
factor (XLF).
Todos los complejos proteicos que intervienen,
además de intentar estabilizar esos dos
fragmentos del ADN para que no se alejen, van
a microprocesar los extremos de la molécula de
ADN buscando algún tipo de homología, de
manera de poder encontrar algo para “pegar”. A
partir de eso, la ADN ligasa unirá los dos
fragmentos.
Este mecanismo de reparación es propenso a
error ya que este procesamiento en los
extremos de la molécula puede provocar cierto
grado de pérdida de información. Es un
mecanismo mutagénico.
Union de extremos no homologos (NHEJ)
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA (HR)
En este caso, lo que se hace es copiar un sector
homólogo del ADN que no esté dañado. Esto da lugar a
la transferencia de información genética hacia la
molécula que sufrió la rotura (conversión génica) o un
intercambio recíproco entre las dos moléculas
(entrecruzamiento).
Las DSB son reconocidas por un complejo proteico
llamado MRN (RAD50/MRE11/NBS1), donde la nucleasa
MRE11 degrada el ADN produciendo regiones de ADN
simple con extremos 3´OH libres.
La proteína de replicación A (RPA) rápidamente se une a
la cola de ADN de cadena sencilla, previniendo la
formación de estructuras secundarias.
Después, RPA es desplazado por RAD51 y este
promueve la invasión sobre la secuencia homologa no
dañada.
Luego, la proteína RAD54 estimula a RAD51 para que se
alineen las 2 cadenas y se sintetice la cadena empleando
como molde la secuencia homologa que repone la
información perdida en la doble rotura.
Finalmente se forma el intermediario Holliday, que corta
y liga el proceso de reparación de forma adecuada,
evitando rearreglos cromosómicos.
Es una vía de reparación que mantiene la fidelidad ya que
es una vía libre de error por el hecho de que copia
información de un sitio fiel.
Recombinación homóloga (HR)
Reparación por escisión de nucleótidos (ruta NER)

Elimina los daños que distorsionan la estructura de la doble hélice. Es un mecanismo de reparación que
reconoce regiones dañadas debido a la distorsión creada en la estructura del ADN y procede a su
escisión y reemplazo. En eucariotas hay dos alternativas de reparación NER que se diferencian en
cómo se da la detección del daño:

→ Reparación en genoma global (GGR): es un proceso

que se da lentamente y actúa en regiones que no
están transcribiendo, osea en genes que no están
activos. Se da un reconocimiento de la lesión mediada
por la proteína XPC. Luego de que es reconocida, se
une un complejo al sitio de la lesión compuesto por el
factor de transcripción II humano, la proteína XPA y
la proteína RPA. Este se denomina complejo pre-
escicional. Se encarga de estabilizar y demarcar
la lesión. Luego puede actuar la proteína XPG
(actividad endonucleasa) desde el extremo 3´ y el
complejo ERCC1/XPF con acción endonucleasa desde
el extremo 5´.
Una vez escindida la zona de la lesión, la ADN polimerasa
sintetiza el nuevo fragmento usando como base la hebra no
dañada y la ADN ligasa une el fragmento a la hebra. Este
es un sistema de reparación libre de error, ya que copia
información de un lugar fiel.

→ Reparación acoplada a la transcripción (TCR): es un proceso estrechamente relacionado a la

transcripción, más específicamente a la ARN polimerasa II. Este mecanismo actúa en zonas de
transcripción mediante la proteína CSB. Esta proteína se acopla a la ARN polimerasa II y bloquea
su acción cuando llega al lugar del daño. CSB recluta a la proteína CSA liberando a la ARN
polimerasa. Luego se recluta al complejo pre-escisional y a partir de ahí los pasos siguientes son
iguales a GGP.

Los genes implicados en la expresión de estas proteínas se conocen como XP, en el caso de los genes de
TCR son de la familia CS.

MÉTODOS DE ESTUDIO DE REPARACIÓN

Análisis de sobrevida y rendimiento mutagénico en función de la dosis de radiación

Se exponen cultivos celulares a diferentes dosis de radiación y se las siembra en placas de Petri. Se va
a esperar a que se formen clonas, lo cual indica que las células proliferaron.

Cuantas más clonas haya, significa que hay sobrevida en presencia de radiación. Con la fracción de
sobrevida y la dosis de radiación se puede representar gráficamente.
La fracción de sobrevida se halla de la siguiente manera:
 En cuanto a una gráfica de la
frecuencia de células mutantes en
función de la dosis de radiación se
puede ver lo siguiente:
• La curva 1 tiene mutados los
sistemas de reparación libres de
error, por lo que los daños solo
podrán ser reparados por los
sistemas de reparación
mutagénicos, por eso la inducción de
mutantes es tan alta.
• La curva 2 tiene los
sistemas de reparación propensos a
error mutados, por lo que quienes se
encarguen de arreglar el daño serán
los sistemas de reparación libres de error, explicando la baja probabilidad de mutación.
•
• La curva 3 representa el genotipo salvaje, ósea, sin mutaciones, por lo que se ve una magnitud
media de frecuencia mutagénica.

La curva 3 tiene los sistemas de reparación propensos a error mutados, por lo que quienes se
encarguen de arreglar el daño serán los sistemas de reparación libres de error, explicando la baja
probabilidad de mutación.

La curva “normal” indica el genoma sin mutaciones. En esta

curva se interpreta que la célula tiene la capacidad de
reparar al daño causado por la radiación a ciertas dosis de la
misma, pero al llegar a cierta dosis, esta capacidad se pierde
y la sobrevida comienza a disminuir.

Por otor lado, en la curva “CS”, la cual indica un genoma con

mutaciones (síndrome de cokein) en los mecanismos de
reparación, se puede ver que no tiene capacidad de
reparación de daños del ADN, incluso a pequeñas dosis de
radiación, por eso se ve que la curva cae rápidamente.

La técnica de electroforesis por campos pulsados transversales y alternados (TAFE) permite detectar dobles
roturas de cadena en el ADN.

✓ Se hace migrar el ADN de células tratadas y no tratadas sobre matriz en

respuesta a un campo eléctrico.
✓ El número de DSBs (doble rotura de ADN) dependerá de la relacione ente
los picos (tratados vs controles) asumiendo la distribución de Poisson

Teniendo en cuenta que: un control, donde todos sus cromosomas estén intactos (sin
roturas de ADN ni fraciconamiento cromosomico) presentara un perfil de bandas
que vana correr en función de su tamaño, los cormososma smas chicos van a correr
mas hacia abajo (van a difundir mas) y los mas grandes quedaran mas arriba.
Si existe rotura de ADN el tamaño va a variar y abra un corrimeinto del perfil para aquellos que son tratados.