HISTAMINA

Manual de
instrucciones
PESCADO: 5-50 mg/kg
HARINA DE
PESCADO
 ÍNDICE

1. Tecnología y Aplicación BIOFISH....................................................4

2. Material Necesario para el Análisis ................................................6

3. Preparación a la Medida .................................................................7

a) Almacenaje e Hidratación del Biotest ........................................7

b) Preparación de Reactivos ..........................................................7

4. Puesta en Marcha del Biosensor ................................................... 9

a) Montaje del Biosensor .............................................................. 9

b) Activación y Calibración del Biotest. Medida de Patrón ...........11

5. Extracción y Análisis de Muestras ................................................ 14

6. Recomendaciones de Uso ........................................................... 16

7. Registros .......................................................................................17

Versión: V.HIS.11.17.E.B

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1. Tecnología y Aplicación BIOFISH

Un biosensor es un dispositivo analítico compacto que combina

un componente biológico con un transductor físico-químico, para
la detección de analitos de interés.

La base de la tecnología radica en el desarrollo del Biotest,

electrodo de trabajo, que lleva inmovilizado el enzima junto con
otros componentes electroactivos, los cuales producen un cambio
de corriente eléctrica al entrar en contacto con el analito a
detectar.

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 ¿Cómo se lleva a cabo el análisis?
Cualquiera de los procesos que se llevan a cabo en el Biofish 300
(activación, calibración, análisis, etc.) constan de dos partes
diferenciadas.
En la primera fase el equipo registra la señal eléctrica que circula
por la celda electroquímica (establecimiento del blanco) nada más
comenzar el proceso (AJUSTANDO REFERENCIA), con la cubeta
de medida únicamente llena con Solución de Medida.
La segunda fase (ANALIZANDO MUESTRA) comienza con la
adición del Patrón de Calibración o de la muestra en la cubeta de
medida, una vez el equipo haya emitido una señal auditiva,
indicativo de que se ha establecido bien el blanco de cada medida.
Dicha adición supone un aumento de la corriente eléctrica en la
celda debido a la secuencia de reacciones redox que tienen lugar
en la superficie del Biotest.
De la diferencia de intensidades registradas antes y después de la
adición, el equipo calcula una variación de intensidad de corriente
que correlaciona con la concentración de histamina mediante una
calibración previa del equipo.

Biofish-300 HISTAMINA, es una aplicación de Biolan para la

determinación de histamina en dos tipos de muestras de una
manera cuantitativa:
Pescado: Rango de 5-50 mg/kg.
Harina de Pescado: Rango de 100-1000 mg/kg o rango de
300-3000 mg/kg.

Tabla 1. Especificaciones de los Rangos de Medida

Pescado Harina de Pescado
5-50 mg/kg 100-1000 mg/kg 300-3000 mg/kg
LC 5 100 300
Error 10% 10% 10%
Extracción Muestra 1/5 1/10 1/30

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2. Material Necesario para el Análisis

Materiales
- Biosensor: equipo, cubeta de medida, electrodo de referencia
y alimentador.
- Biotest (electrodo de trabajo).
- Kit Calibración HIS.
- Kit de Medida HIS.
- Pipeta de 20-200 µl y 0,5-5 ml.
- Agua destilada.
- Balanza analítica (g).
- Bote para la extracción de la muestra.
- Picadora.

Referencias Biolan
- BF 300-01: Biosensor.
- BTFHIS5: Biotest HIS para 5 análisis.
- BTFHIS10: Biotest HIS para 10 análisis.
- BTFHIS20: Biotest HIS para 20 análisis.
- BTFHIS50: Biotest HIS para 50 análisis.
- BTFHIS100: Biotest HIS para 100 análisis.
- KITCFHIS: Kit Calibración HIS (8 tubos de Reactivo de Calibración
(CFHIS), para 24 días de trabajo).
- KITMFHIS 1: Kit de Medida HIS1 (8 tubos de Reactivo de Medida
(MFHIS1),para un total de 160 análisis).
- KITMFHIS 2: Kit Medida HIS2 (8 tubos de Reactivo de Medida
(MFHIS2), para un total de 640 análisis).
- ELEREFN: Electrodo de referencia.

Material Recomendado
- Botella de 1 litro, para la preparación de la Solución de Medida.
- KITEFHIS: Kit Extracción HIS ( (jeringas, pipetas Pasteur y tubos
para la extracción). Este kit sirve para la filtración de la muestra tras
el proceso de extracción, en caso necesario.

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 3. Preparación a la Medida
a) Almacenaje e Hidratación del Biotest
Los Biotest se envían a temperatura ambiente, envasados al vacío
y con una piedra de silica gel para preservarlos de la humedad
ambiental.

Deberán conservarse de este modo, una vez recibidos, entre

3-8ºC,hasta su fecha de caducidad.

Para la hidratación del Biotest previo a su uso (se recomienda

realizar este proceso al menos 12 horas antes de usarlo),
deberá desecharse la piedra de silica gel del interior del tubo y
rellenarlo con Solución de Medida hasta que la base del Biotest
quede sumergida.

Una vez hidratado, el Biotest deberá almacenarse entre 3- 8ºC

en posición vertical por un máximo de 15 días.

b) Preparación de Reactivos
• Solución de Medida (SM)
Kit Medida HIS1 o Kit Medida HIS2 suministran 8 tubos de
Reactivo de Medida para la preparación de la Solución de Medida,
necesaria para la preparación de Reactivos y Patrones, así como
para la realización de las medidas (ver Tabla 2).

Tabla 2. Preparación de la Solución de Medida

Tipo de Muestra Kit Medida HIS1 Kit Medida HIS2
Disolver el contenido Disolver el contenido
Pescado: 5-50 mg/kg y de 1 tubo (MFHIS1) de 1 tubo (MFHIS2)
Harina: 100-3000 mg/kg en 250 ml de agua en 1 litro de agua
destilada destilada

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• Reactivos y Patrones de Calibración

El Kit Calibración HIS suministra 8 tubos de Reactivo de

Calibración en polvo, junto con dos tubos vacíos para la
preparación de los Patrones de Calibración.
El Patrón de Calibración se prepara por dilución del Reactivo de
Calibración y es el reactivo que se usa para la calibración diaria
del Biosensor (ver tabla 3).

Tabla 3. Preparación del Reactivo y Patrón de Calibración

Pescado: 5-50 mg/kg Harina de Pescado
Reactivo de
Calibración (RC) 10 ml SM 10 ml SM
Patrón 19,9 ml SM + 9,5 ml SM +
de Calibración 0,1 ml RC 0,5 ml RC

Los tubos de Reactivo de Calibración llevan un tapón

preperforado por el que se introduce la punta de la pipeta para
evitar pérdidas de reactivo.
Las condiciones de almacenaje de cada uno de los
reactivos preparados se especifican en la Tabla 4.

Tabla 4. Condiciones de Almacenaje de los Reactivos

Biotest Reactivo Patrón Reactivo Extracto
Calibración Calibración de Medida Muestra

Seco 3-8ºC /*** 3-8ºC/*** r.t */ d.d**/***

3-8ºC / 3-8ºC / 3-8ºC / r.t* / d.d** / 3-8ºC /

Hidratado 3 días 1 día 15 días 4h
15 días
r.t* temperatura ambiente
d.d** almacenar en lugar seco y oscuro
*** hasta fecha de caducidad

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 4.Puesta en Marcha del Biosensor
a) Montaje del Biosensor
Para el correcto montaje del Biosensor:

1. Acoplar tanto el Biotest (BTFHIS) (introduciéndolo en el

portabiotest y apretándolo con el tornillo) como el electrodo de
referencia (ELEREFN) en sus respectivos conectores.

4 1

Nº
Descripción
elemento

1 Biotest
2 Contraelectrodo
3 Cubeta de Medida
4 Electrodo de Referencia
5 Agitador

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2. Rellenar la cubeta de medida con 10 ml de Solución de Medida
y colocarla en el portacubetas de modo que todos los
componentes de la celda electroquímica queden sumergidos.

3. Conectar el equipo a una toma de corriente estable de

100-240 VAC y apretar el botón de encendido que se
encuentra al lado de la pantalla durante 2 segundos.

4. Pulsar la opción BIOTEST: seleccionar HISTAMINA pulsar »,

introducir la codificación del Biotest (dicha codificación se
encuentra en la etiqueta identificadora del Biotest), pulsar » y
finalmente seleccionar tipo de muestra (Pescado o Harina de
Pescado) con el que se va a trabajar y pulsar el botón
GUARDAR.

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 5. La opción ANÁLISIS conduce al menú principal de análisis:
- Activar.
- Calibrar.
- Medir Patrón.
- Medir Muestra.
- Stand by.

b) Activación y Calibración del Biotest. Medida de Patrón

Una vez al día, antes de comenzar con la realización de
análisis, se ha de activar y calibrar el Biotest.
Además, se recomienda realizar estas dos operaciones
tras largas pausas del equipo (más de 2 horas).
Una vez montado el Biosensor (ver Sección 4, Punto a.1),
asegurarse de que la cubeta de medida contiene 10 ml de
Solución de Medida y que todos los componentes de la celda
electroquímica estén sumergidos.

• Activar:
1. Pulsar ACTIVAR en la opción ANALISIS.
2. Verificar que la cubeta de medida contiene 10 ml de Solución
de Medida y pulsar CONTINUAR para comenzar el proceso.
3. Esperar a que el equipo registre el blanco de la
medida y a que emita una señal auditiva. Inyectar Patrón de
Calibración dentro de la cubeta de medida, con la ayuda de
una micropipeta (ver Tabla 5).
4. Esperar a que el proceso termine. En la pantalla aparecerá
un mensaje "Biotest activado. Listo para calibrar".
5. Cambiar el contenido de la cubeta por 10 ml de Solución de
Medida nueva.

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• Calibrar:
La calibración se realiza mediante la adición del Patrón de
Calibración dos veces en la cubeta de medida, en dos momentos
diferentes. Para el trazado de la recta de calibrado el equipo
tendrá en cuenta el blanco, la variación de intensidad producida
por la primera adición del Patrón de Calibración y la suma de las
variaciones de intensidades producidas por ambas adiciones.
1. Pulsar CALIBRAR en la opción ANALISIS.
2. Verificar que la cubeta de medida contiene 10 ml de
Solución de Medida y pulsar CONTINUAR para comenzar el
proceso.
3. Esperar a que el equipo resgistre el blanco de la medida y
emita una señal auditiva. Inyectar Patrón de Calibración
dentro de la cubeta de medida (ADICIÓN 1), con la ayuda de
una micropipeta (ver Tabla 5).
4. Esperar a que el equipo registre el cambio de corriente y a
que vuelva a emitir un sonido.
5. Pulsar CONTINUAR e inyectar el Patrón de Calibración
de nuevo (ADICIÓN 2) (ver Tabla 5).
6. Esperar a que el proceso termine. Aparecerán en pantalla los
parámetros de la recta de calibrado obtenida.
7. Cambiar el contenido de la cubeta por 10 ml de Solución de
Medida nueva.
Es importante que se hagan las adiciones del Patrón de
Calibración justo después de pulsar el botón CONTINUAR para
un buen registro de la intensidad de corriente en el momento de
las adiciones.

Valores de R y m iguales o superiores a 0,9990 y 150.000,

respectivamente, se considerarán como válidos para proceder
con los análisis.

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 Tabla 5. Volúmenes en la Activación, Calibración y Análisis de Patrón

Pescado: Harina de Pescado

5-50 mg/kg 100-1000 mg/kg 300-3000 mg/kg
Volumen de
Patrón de 2 ml 200 µl 200 µl
Calibración

• Medir Patrón:
Para comprobar el estado de la calibración, trás una serie de
medidas o tras una pausa larga del equipo, se recomienda testar
el estado de la misma en la opción PATRON. Para ello:
1. Pulsar PATRON en la opción ANALISIS.
2. Verificar que la cubeta de medida contiene 10 ml de
Solución de Medida y pulsar CONTINUAR para comenzar el
proceso.
3. Esperar a que el equipo registre el blanco de la medida y a
que emita una señal auditiva. Inyectar Patrón de Calibración
dentro de la cubeta de medida, con la ayuda de una
micropipeta (ver Tabla 5).
4. Esperar a que el proceso termine. En la pantalla
aparecerá un mensaje de "Biosensor calibrado" o "Biosensor
descalibrado".

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5.Extracción y Análisis de Muestra
Para realizar el análisis de la muestra es necesario un paso previo
de extracción de la histamina de la matriz sólida a la fase líquida,
de tal modo que se pueda pipetear en la cubeta de medida.

• Preparación de la muestra:
- Pescado enlatado: Homogeneizar la carne con la ayuda de
una picadora. Eliminar previamente el líquido con ayuda de un
tamiz de 3mm de malla.
- Pescado fresco o descongelado crudo: Limpiar y eviscerar el
pescado. Cortar una muestra del músculo y homogeneizar con
ayuda de una batidora.
- Pescado cocido/harina de pescado: No necesita preparación.

• Extracción PESCADO:
1. Añadir 10 g de muestra homogeneizada a un bote
de plástico hermético.
2. Añadir 40 ml de agua destilada.
3. Agitar vigorosamente durante 15-20 segundos y dejar
reposar hasta que decante (ver Tabla 6).
4. En caso de muestras sucias, filtrar antes de
inyectarlo al equipo (ver Kit Extracción Biolan).
5. Para el caso de pescado crudo es recomendable un
paso extra de homogeneización, con ayuda de una batidora o
similar, una vez se haya añadido el agua sobre la muestra, para
proceder a su total disgregación.
• Extracción de HARINA:
1. Añadir 10 g de harina de pescado a una botella de
plástico hermética.
2. Añadir 90 ml (para el rango de 100-1000 mg/kg) o
290 ml (para rango de 300-3000 mg/kg) de agua
destilada (ver Tabla 6).
3. Agitar mecánicamente durante 15 minutos y dejar reposar 5
minutos.

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 Tabla 6. Extracción en función del tipo de muestra
Rango de Medida Muestra (g) Agua destilada (ml)
Pescado: 5-50 mg/kg 10 40
Harina de Pescado: 100-1000mg/kg 10 90
Harina de Pescado: 300-3000mg/kg 10 290

Las muestras, una vez extraídas, han de analizarse en un plazo

máximo de 4 horas desde su extracción, almacenándolas entre
3-8ºC durante este periodo. Antes de proceder al análisis es
importante dejar atemperar el extracto.

• Análisis del extracto:

Para proceder al análisis de los extractos obtenidos:
1. Pulsar MUESTRA de la opción ANALISIS y elegir el rango
de análisis deseado.
2. Verificar que la cubeta de medida contiene 10 ml de Solución
de Medida y pulsar CONTINUAR para comenzar el proceso.
3. Esperar a que el equipo registre el blanco de la medida y a
que emita una señal auditiva. Pulsar CONTINUAR e
inyectar el extracto con ayuda de la micropipeta dentro
de la cubeta de medida (ver Tabla 7).
4. Esperar a que el proceso termine. En la pantalla aparecerá el
resultado del análisis.

Tabla 7. Volúmenes de extracto a inyectar

Pescado: Harina de Pescado
5-50 mg/kg 100-1000 mg/kg 300-3000 mg/kg
Volumen muestra 2 ml 200 µl 200 µl

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6. Recomendaciones de uso

1. Proceder a la Activación y Calibración del equipo justo antes

de comenzar con los análisis, a diario.
2. Trabajar con el Biotest y todas las soluciones (Solución de
Medida y Patrones de Calibración) bien atemperadas, ya que la
temperatura afecta fuertemente a la actividad enzimática del
Biotest.
3. Asegurarse en cada proceso que los tres componentes de la
celda electroquímica (Biotest, electrodo de referencia y
contraelectrodo) estén bien sumergidos en la Solución de
Medida.
4. Se recomienda testar el estado de la calibración, mediante el
análisis del Patrón de Calibración, cada 15 medidas o tras 2
horas de pausa del equipo.
5. Cerciorarse de cambiar el contenido de la cubeta tras cada
proceso.
6. Si el resultado de un análisis es superior al extremo superior del
Rango de Medida en el que se está trabajando (por ejemplo, un
valor de 75 mg/kg en el Rango de 5-50 mg/kg), cambiar el
contenido de la cubeta y poner el equipo en modo Stand By
durante 30 segundos antes de proceder con el siguiente análisis.
7. El electrodo de referencia deberá permanecer sumergido en su
solución de almacenaje (KCl 4M) y en posición vertical siempre
que no esté conectado al equipo.

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 7.Registros

Para guardar el resultado de un análisis, pulsar GUARDAR.

Para ver estos resultados, una vez guardados tendremos
que entrar en la opción REGISTROS.
Existe la posibilidad de descargar los análisis guardados en el
equipo a un ordenador, a través de un Software específico
desarrollado por Biolan para ello.
Si se desean borrar los datos guardados habrá que ir a
REGISTROS y pulsar BORRAR TODOS.

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