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Universidad Francisco de Paula Santander

Informe de Laboratorio N° 6. Extracción y Purificación del ADN de

Moniliophthora roreri Hongo que Ataca el Cacao, en Norte de Santander

Ramos O. María del Pilar.1 – 1611718*, Martínez B. Adriana M.1 – 1611729*, Coronado S.

Daniela J.1 -1611738*

1(Estudiante de séptimo Semestre De Ingeniería Biotecnológica) y * (Código Institucional)

Grupo B: 1610701 Biología Molecular (A2)

Introducción:

En la actualidad y con los avances de la Genética y la Biología Molecular como una

ciencias que estudian la herencia y de la variación de los genes y sus mejoramientos, estas

disciplinas abarcan el estudio del ADN de los organismos biológicos, los individuos

pluricelulares y unicelulares, sus descendientes y las poblaciones en que viven, utilizando

muchos enfoques experimentales distintos (Pérez, 2022)

El género Geotrichum componen aquellos microorganismos hallados

cosmopolitamente en suelo, agua, aire, detritos, plantas, cereales, productos lácteos e incluso

en la flora normal del hombre y se aísla en esputo y heces. Estos tipos de hongos afectan

directamente a las plantas produciendo deterioro de sus tejidos e incluso la muerte progresiva

o total, lo cual genera grandes pérdidas a nivel económico en la agricultura de la mayoría de

los países (Carreón, 2015)

En el presente informe se busca comprender y realizar un protocolo descrito por la

docente para la extracción, purificación y aislamiento de ADN de hongos y adquirir los

conocimientos básicos para el desarrollo de la práctica. En este protocolo Suarez, en el 2005

presente la manera mas sencilla y precisa para hacer una correcta extracción del hongo

Moniliophthora roreri de algunos municipios del Departamento Norte de Santander.

Metodología
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En la presente practica se realizó la extracción de ADN del Hongo Geotrichum sp, un

proceso paso a paso que se describe en el siguiente diagrama:

Figura 1: Procedimiento extracción ADN del Hongo Geotrichum sp.

Coronado, D.J(2023). Procedimiento extracción de ADN de hongos

En la práctica se hizo la extracción de ADN de 4 muestras del mismo hongo; dentro

del procedimiento la relación 1:1 de fenol-cloroformo y la relación 1:1 de isopropanol fue:

Tabla 1: Relación de Volumen Fenol-Cloroformo

Muestra Volumen del sobrenadante Relación fenol-cloroformo

100 ul cloroformo
PR 200 ul
100 ul fenol
100 ul cloroformo
AM 200 ul
100 ul fenol
75 ul cloroformo
JC 150 ul
75 ul fenol
75 ul cloroformo
AM+ 150 ul
75 ul fenol
Coronado, D.J(2023). Relación de volumen fenol-cloroformo
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Tabla 2: Relación de Volumen Isopropanol

Muestra Volumen del sobrenadante Relación Isopropanol

PR 100 ul 100 ul Isopropanol
AM 150 ul 150 ul Isopropanol
JC 100 ul 100 ul Isopropanol
AM+ 100 ul 100 ul Isopropanol
Coronado, D.J(2023). Relación de Volumen Isopropanol
Resultados

Imagen (a) Imagen (b)

Martínez, A. M. (2023) [Fotografía a y b] Laboratorio de Biología Molecular,

UFPS, Los Patios, Norte de Santander

Nota: Obtención de muestras de hongos que se van a cuantificar y cualificar. Imagen

(a) tubo Eppendorf con el botón para posteriormente mezclar con el buffer y la Imagen (b)

secado a temperatura ambiente para aplicar el buffer una vez se sequen totalmente.

En la extracción de ADN, se cultivó previamente el hongo en este caso Geotrichum

sp. En el medio requerido se cultiva durante días, sin agitación y sin glucosa con el fin de que

permanezca intacto, aunque se pudo evidenciar que el crecimiento de este era lento y se

detenía por tiempos prolongados según el protocolo que desde hace años se ha estandarizado

(Martínez & Soto, 1993). Luego de este crecimiento se realizó todo el montaje de la

metodología de extracción de ADN genómico que en el caso de hongo se hizo con la

metodología estandarizada de la Moniliophthora roreri en el cacao. Se tomó la misma

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metodología porque se puede realizar en tres (3) horas exactas, evitando ciertos compuestos

que pueden ser nocivos y tóxicos o que en ocasiones hacía más larga la práctica de

laboratorio (Suárez, 2005).

Durante el proceso de extracción se utilizó la misma metodología de la

Moniliophthora roreri en donde se realizó los procesos de aislamiento y conservación; la

extracción del ADN; la purificación y verificación de ADN; además el mismo ensayo se

probó en otro hongo para verificar la estandarización del protocolo según Suárez.

Según la metodología manejada en el laboratorio, se obtuvo como primera parte luego

de adicionar el buffer de extracción para hongos y la centrifugación el sobrenadante, en este

protocolo es de gran importancia el sobrenadante en donde realmente se encuentra el ADN;

cuando se adiciona el fenol-cloroformo realiza la completa lisis celular y la eliminación de

componentes lipídicos; esto para poder iniciar la última parte en donde luego de la

purificación se visualizan las hebras de ADN. En el caso del Geotrihum sp. Se logró

evidenciar el botón en donde se encuentra el ADN presente en 3 tubos Eppendorf de los 4

que se realizó en la extracción, que por último se conservan con el Buffer TE para después

realizar la cuantificación y cualificación genómica.

Discusión

En la extracción de ADN, se realiza para observar la alta calidad de los hongos que

estarán en estudio y observar la presencia de una pared celular compleja con alto contenido

de los polisacáridos y metabolitos secundarios (Huanca et al, 2014), esto con el fin de realizar

un método corto y, simple de extracción y purificación de ADN en los hongos (Penicillium

sp, Geotrichum sp, Trichoderma sp, Aspergillus sp.) que fueron los trabajados en clase.

En los protocolos de extracción del ADN se estudia precisamente la recolección de

material genético para posteriormente realizar un análisis molecular gráfico cuantitativo y un

análisis con el Fotodocumentador de característica cualitativa. Hay diferentes protocolos por

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realizar o mencionar según sea la necesidad de la muestra o el resultado que se desea obtener,

pueden encontrarse varios protocolos, pero se debe tener en cuenta los medios de crecimiento

y que sean viables con respecto al tiempo y la metodología estudiada. (Ruiz, 2022).

En varios protocolos se pueden demostrar que puede resultar más sencillos, pero suele

ser más costosos por la cuestión de los reactivos; por eso se busca con los protocolos de

Moniliophthora roreri y la Palma de Aceite realizados por Suarez en 2005 y seguidamente

por Rocha en 2002, Esto con el fin pueda establecer una estandarización- Realizando un

análisis en la cepa Geotrichum sp, se logra ver que el micelio del hongo luego de pasar por un

proceso de extracción y purificación logra tener resultados en un 30%. Esto porque el micelio

se encuentra bastante grueso y sus pedazos no suele disolverse fácilmente durante la práctica,

pero aún así se pudo recuperar por medio del protocolo estandarizado de Suarez en 2005, que

suele ser un poco distinto al propuesto por Rocha con la variación de reactivos y la cantidad

de tiempo que suele invertirse para obtener una extracción de ADN de calidad.

En el análisis de resultados, se permiten evidenciar hebras de ADN durante el proceso

de extracción al agregar el etanol al 70%, comprobando lo mencionado por Suarez & Yañez

en 2018 que para tener una buena muestra representativa debe realizarse una buena

extracción y un buen aislado de ADN y una forma de evidenciar esto es por medio de las

hebras y el botón ubicado en la parte final del tubo Eppendorf.

Conclusiones:

• En la práctica de extracción de ADN se logró evidenciar las técnicas correctas de

aislamiento, conservación, extracción, purificación y verificación de muestra

representativa del hongo Geotrichum sp. con el fin de obtener cantidad y calidad del

genoma.
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• Se logró realizar una metodología guiada con respecto a un protocolo ya

estandarizado realizado con Moniliophthora roreri que funcionó para cada uno de los

hongos evaluados en ejercicio de clase

• Se obtuvo la muestra significativa con la cantidad de ADN extraído del hongo, con el

fin de conservarse para realizar a futuro una buena electroforesis y una buen

cuantificación de ADN para saber si hay presencia de este genoma puro, aunque

depende mucho de la paso principal y es la extracción.

Referencia Bibliográfica

Cardoon, D. Geotrichum sp. (2015). Prezi.com.

https://prezi.com/56dyiux8ullg/geotrichum-sp/

Huanca, W., Salvatierra, R., & Sepúlveda, G. (2014). Un método rápido y eficiente

para la extracción total de ADN de hongos filamentosos del suelo. SCIELO.

https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-

34292014000200010

Martinez, & Soto, &. (1993). Extracción del ADN de Fusarium Oxysporum f.sp.

Dianthi. Revista Colombiana de Química.

https://revistas.unal.edu.co/index.php/rcolquim/article/view/16168

Métodos de Extracción de ADN. (2014 1). Wakolatinamerica.com.

https://www.wakolatinamerica.com/blog-reactivos/post/10-metodos-de-

extraccion

Pérez Sánchez, G. (2022). Método para la extracción y purificación de ADN en restos

óseos humanos, para el estudio de los polimorfismos, mediante el kit de

amplificación Identifiler (16 STR). Benemérita Universidad Autónoma de

Puebla.
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Ruíz, S. (2022). Consolidación de un método de extracción de ADN de levaduras y

caracterización molecular de microorganismos a ingresar en el Banco de

Cepas y Genes del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de

Colombia. Biblioteca Universidad del Bosque.

https://repositorio.unbosque.edu.co/bitstream/handle/20.500.12495/7920/Cons

olidaci%c3%b3n%20de%20un%20m%c3%a9todo%20de%20extracci%c3%b

3n%20de%20ADN%20de%20levaduras%20y%20caracterizaci%c3%b3n%20

molecular%20de%20microorganismos%20a%20ingresar%20en%20el%20Ba

nco%20de%20Cepas%20y%20Genes%20IBUN.pdf?sequence=1&isAllowed

=y

Suarez, L. (2005). Extracción y purificación del ADN de Moniliophthora roreri hongo

que ataca el Cacao, Norte de Santander. REVISTA Respuestas UFPS.

https://revistas.ufps.edu.co/index.php/respuestas/article/view/629/633

Suárez, L., & Yañez, L. (2018). Extracción de ADN de bacterias conservadas en el

banco de cepas de la Universidad Francisco de Paula Santander sede

Campos Elíseos. REVISTA Respuesta UFPS.

https://revistas.ufps.edu.co/index.php/respuestas/article/view/1496
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Anexo

Métodos De Extracción Utilizados Para Obtener ADN.

1. Precipitación por Sales

En primer lugar, se procede a una lisis celular con un detergente aniónico que

solubiliza los componentes celulares e inhibe la acción de las nucleasas intracelulares.

A continuación, se desnaturalizan y se eliminan las proteínas por precipitación salina.

El ADN en solución se precipita con isopropanol y se lava con etanol para finalmente

ser resuspendido en un tampón estabilizante para ADN. Este método se utiliza para la

obtención de ADN de los siguientes tipos de muestra:

➢ Sangre Periférica: volúmenes de entre 3 ml hasta 20 ml (las cantidades de

reactivos de estos métodos son escalables en función del volumen de muestra).

➢ Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSPs): las preparaciones de

CMSPs pueden tener un volumen variable de entre 0,1-2 ml de medio y pueden ser

procesados entre 1 y 3x 107 células. Células: el número de células que puede ser

procesado depende del tipo celular y del modo de obtención de las células

(por.ejemplo: cultivos celulares, células purificadas por citometría de flujo). En

cualquier caso, puede procesarse un

amplio rango de células, desde 1 x106 hasta 50 x106, siempre y cuando se escalen

proporcionalmente las cantidades de soluciones de reactivos.

Saliva: pueden procesarse 2 ml de saliva mezclados con 2 ml de preservante Oragene.

➢ Tejidos: se pueden procesar cantidades muy variables de tejido desde 5 mg a 1 g de

tejido fresco congelado. Este protocolo también puede ser aplicado para la obtención

de ADN de tejido fijado en formol e incluido en parafina (abreviado como FFPE del

inglés “formaline - fixed paraffin-embedded”). (National &Network, 2015).

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2. Incubación del Lisado para su uso: Una posible forma de aislar el ADN genómico es

incubar el lisado crudo a temperaturas entre 90 – 100 °C y luego usarlo directamente.

Es evidente que mediante este método el ADN obtenido es de muy baja pureza y con

aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este método son las pérdidas de ADN

por acción de las nucleasas y otros componentes de los orgánulos que están en

contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para almacenar el

ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN. (Komski,

2014).

3. Lisis Por Ruptura Mecánica y Extracción con Disolventes Orgánicos: Si se opta por

realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener en cuenta

la posibilidad de ruptura de las moléculas de ADN que se intentan separar, por lo que

este debe bastar para lograr la lisis de las células, pero no ser muy agresivo para

proteger el ADN. Este método puede ser usado para extraer ADN de material crudo,

liofilizado o congelado, que puede romperse con un mortero, por congelación-

descongelación o usando ultrasonidos. El lisado de células se puede extraer con

cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, siendo las proteínas y otros componentes de la

célula solubles en el disolvente orgánico, por lo que de esta forma se logra la

separación de los ácidos nucleicos. Este método se puede usar para moléculas de

ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos rendimientos de moléculas

relativamente puras, siempre teniendo en cuenta que hay que controlar el pH de la

fase acuosa y la concentración de sales, que son los factores que aseguran una buena

separación. Las desventajas de este método son el uso de disolventes orgánicos

dañinos para la salud humana y que pueden quedar como trazas en la muestra de

ADN y luego actuar como interferentes en técnicas como el PCR, que es largo, en
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ocasiones puede dar rendimientos poco reproducibles y requiere de varios trasvases

que aumentan la posibilidad de contaminación de la muestra. (Komski, 2014).

4. Lisado y Purificación con un Detergente Iónico. Método del CTAB: Este es un

procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico

puede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de

detergentes aniónicos no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser

usado para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos. Un ejemplo de

este método, quizás el más conocido, es el uso de CTAB (bromuro de cetil trimetil

amonio) como detergente para lograr la lisis. El CTAB además, en presencia de

EDTA como agente quelatante y TRIS-HCl como tampón, forma complejo insolubles

con el ADN. Luego se extraen los residuos orgánicos con cloroformo, para separar

posteriormente el ADN por precipitación con etanol. Si se quiere evitar el uso de

disolventes orgánicos se puede llevar a cabo el método del CTAB separando

directamente los complejos insolubles formados con el ADN del sobrenadante donde

han quedado disueltos el resto de los componentes celulares. Estos complejos se

resuspenden en disolución salina y se adiciona posteriormente alcohol y RNAsa,

logrando que precipite el ADN con un grado de pureza aceptable para muchas

aplicaciones. (Komski, 2014).

5. Método De Salting-Out: A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas

de proteínas y otros contaminantes del ADN mediante la adición de altas

concentraciones de sal que hacen que disminuya la solubilidad de las moléculas

orgánicas en la fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa K,

el TRIS-HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total

inactivación de las enzimas que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la

extracción se utilizan sales inorgánicas como el perclorato de sodio y el cloruro de

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sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas orgánicas. El

precipitado formado se separa por centrifugación y luego se puede extraer el ADN de

la disolución acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación. Este método es

sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en muchas ocasiones

debe ser purificado antes de ser usado en posteriores aplicaciones. La ventaja es que

se elimina el uso de disolventes orgánicos. (Komski, 2014).

6. Uso de la Proteinasa K y el Dodecilsulfato de Sodio: El procedimiento conocido

como PK-SDS por sus siglas en inglés proteinase K - sodium dodecyl sulfate, es uno

de los más usados para la extracción de ADN ya que la digestión de la muestra se

puede realizar con proteinasa K que es activada por el dodecil sulfato de sodio. La

proteinasa K inactiva las DNAsas presentes en el lisado celular usando detergente

aniónico el SDS. La proteinasa K también es usada en otros de los métodos descritos

en este artículo para la digestión de las proteínas y otros contaminantes del lisado

celular. (Komski, 2014).

7. Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico en un

único tubo: La compañía Wako pone a disposición de los investigadores y empresas

varios kits de ADN que yoduro de sodio como agente caotrópico, que tienen la

ventaja de que la extracción se realiza en un único microtubo de centrifugado. El

yoduro de sodio además de provocar la lisis celular rompe la capa de hidratación que

rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los grupos fosfatos del ADN queden

más expuestas. En estos kits después del tratamiento de la muestra con yoduro de

sodio en el mismo tubo se adicionan detergentes aniónicos como es el caso del N-

lauril sarcosinato de sodio, proteinasa K y/o otros reactivos que permiten separar las

proteínas y lípidos contenidos en las muestras biológicas del ADN. (Komski, 2014).
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8. Extracción con gradientes de cloruro de cesio – bromuro de etidio: El ADN

genómico puede ser purificado por centrifugación selectiva a través de la generación

de gradientes de cloruro de cesio. Primeramente, se lleva a cabo el lisado celular por

métodos mecánicos o químicos y la mezcla es centrifugada durante varias horas en

presencia de bromuro de etidio. Como hay bromuro de etidio en el medio, se pueden

visualizar las diferentes capas en las que se agrupan los ácidos nucleicos según su

densidad con luz ultravioleta. Se obtienen varias capas que pueden separarse y

recuperar el ADN purificado. Este método a pesar de dar como resultado un ADN de

alta calidad tiene una serie de desventajas: es largo, imposible de automatizar, caro,

requiere una ultracentrífuga y usa compuestos químicos tóxicos. (Komski, 2014)

9. Intercambio Aniónico para la Extracción de ADN del Lisado Celular: La

cromatografía en fase sólida de intercambio aniónico se basa en la interacción que se

establece entre los grupos fosfatos cargados negativamente del ADN y la matriz

molecular con que se compacta la columna. Esta interacción hace que las moléculas

de ADN queden retenidas en la fase estacionaria de la columna y puedan separarse de

las proteínas y demás metabolitos presentes. Luego añadiendo una alta concentración

de sales a la fase móvil se logra eludir el ADN, que si es necesario es precipitado con

alcohol para futuras aplicaciones, si no puede utilizarse directamente disuelto en el

buffer con sales en el que se elude. Este método tiene la ventaja de evitar el uso de

disolventes orgánicos tóxicos y es más simple que los que requieren precipitación de

otros componentes para su separación del ADN. (Komski, 2014)

10. Uso de Matrices Celulósicas para la Extracción del ADN de muestras Biológicas:

Un método usado en investigaciones forenses consiste en impregnar una matriz de

celulosa con productos químicos que permitan la lisis celular y posterior conservación

del ADN. Para esto se unen tampones, agentes quelatantes, sales, detergentes y
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moléculas con gran absorbancia en el UV para proteger las muestras de los radicales

libres que pueden formarse por exposición a la luz solar. Siguiendo este

procedimiento las muestras pueden ser conservadas por un largo período de tiempo, lo

cual es muy útil para la resolución de casos forenses y también tiene utilidad para la

determinación de especies en un fluido corporal como puede ser un virus o una

bacteria. (Komski, 2014)

11. Uso de resinas de intercambio iónico: Para la extracción del ADN también se han

diseñado resinas que son capaces de formar complejos con el ADN. El uso de resinas

hidrocarbonadas con estructuras rígidas en tres dimensiones permite que la superficie

se encuentre cargada con alguna sustancia como el dietilaminoetilo que puede

protonarse en medio ácido y quedar cargado positivamente por lo que interacciona

con los grupos fosfatos del ADN. Esto es un método directo, que puede realizarse en

un solo tubo y relativamente rápido, pero tiene como inconveniente que se aíslan

cadenas sencillas de ADN, y este no puede ser utilizado por ejemplo para el análisis

de la variación de polimorfismos en fragmentos de restricción (RFLP). (Komski,

2014).