HAEMOGREGARINAS SPP: HEMOPARÁSITOS PRESENTES EN PODOCNEMIS VOGLI EN HATO LA

EXPERANZA- PAZ DE ARIPORO-CASANARE.

Los reptiles representan uno de los grupos más diversos en cuanto a fauna se refiere, a febrero del
año 2018 a nivel mundial se encuentran registradas 10.711 especies, que corresponden a 86
familias, y 1199 géneros, de estas, 350 especies corresponden a tortugas y 24 a cocodrilos
(http://www.reptile-database.org/db-info/SpeciesStat.html). En Colombia, la variedad de relieves
y ambientes que se presentan, asi como su ubicación geográficas como puente entre América del
Sur y América central, propician una gran diversidad en cuanto a fauna y flora se refiere (Rangel
1991; Hernández-C. et al, 1992); para el año 2015 de acuerdo a la información del libro rojo de
reptiles de Colombia, en el territorio se distribuyen alrededor de 537 especies de reptiles, lo cual,
representa cerca del 5,2 % de la riqueza mundial, de estas, 499 especies corresponden a escamados,
32 especies a tortugas y 6 a cocodrilidos (Libro Rojo de reptiles 2015). Asi mismo, cabe resaltar que
de las 32 especies reportadas de tortugas en el territorio, 3 especies son especies endémicas y se
encuentran clasificadas en distintas categoría de amenaza Podocnemis lewyana y Mesoclemmys
dahli, clasificadas en estatus peligro crítico, y Trachemys medemi todavía no incluida en ninguna
categoría.

En cuanto su hábitat, algunas de las especies de reptiles poseen áreas de distribución restringidas,
en comparación con otros organismos como peces, mamíferos o aves, lo cual los convierte en
bioindicadores de salud ambiental, esta característica junto con las amenazas antropogénicas a las
cuales estos organismos se enfrentan como la destrucción del hábitat, su captura para el consumo
(tanto de su carne como de huevos), tenencia como mascotas, o utilización indiscriminada de sus
partes como materia prima para la producción de diversos productos, como la piel o los aceites para
la elaboración de cosméticos, generan un riesgo de extinción para los reptiles (Robinson et al. 2015,
Urbina-Cardona et al. 2015). Asi mismo, la infección por diferentes organismos como bacterias o
parásitos, pueden asociarse con afectación a su estado de salud, generando cambios en su
comportamiento, o afectaciones a si fitness, entre estos organismos, se encuentran los parásitos
sanguíneos, que han sido asociado en otros organismos como lagartos, a alteraciones eritrocitarias
o anemias leves (Telford 1984; Wozniak et al. 1994).

El phylum Apicomplexa, agrupa un sin número de especies de hemoparásitos que afectan

mamíferos, aves, anfibios y reptiles. En cuanto a su clasificación taxonómica, existen dos clases:
Aconoidasida (Carecen de conoide) que agrupa a los órdenes Haemosporidian y Piroplasmida; y
Conoidasida, grupo donde se encuentra el género Haemogregarinas, hemoparásitos más
comúnmente reportado infectando tortugas a nivel mundial, y Hepatozoon, género más común
infectando serpientes, aunque también se ha reportado infectado cocodrilos. Estos géneros se
caracterizan por poseer un ciclo de vida heteroxeno, donde el parásito necesita tanto de (1) un
hospedero invertebrado o vector en el cual se desarrolla la fase sexual, y (2) un hospedero
vertebrado donde se desarrolla la fase asexual. Las sanguijuelas, garrapatas y ácaros, han sido
reportados como vectores de estos parásitos (Telford 2009). Estas características deben tenerse en
cuenta para la descripción de especies, dado que solamente cuando se tiene la información del
desarrollo en el vector, y la información molecular y morfológica de los estadios en el hospedero
vertebrado, puede determinarse dicha clasificación taxonómica.
En este informe, se presentan los resultados obtenidos para los individuos muestreados en la región
biogeoFigura de Orinoquia, específicamente el departamento de Paz de Ariporo, Hato la Esperanza,
con el fin de contribuir a la construcción de información de base para la conservación de estas
especies, dado que en la actualidad se desconoce la biodiversidad de hemoparásitos que afectan la
mayoría de herpetos que habitan en Colombia, y por ende, la información relacionada con los
efectos que puedan generar en los organismos que infectan.

MATERIALES Y MËTODOS.

CAPTURA DE ESPECÍMENES Y OBTENCIÓN DE MUESTRA SANGUÍNEA

La captura de reptiles se realizó de forma manual y mediante la utilización de herramientas como

redes, para posterior clasificación taxonómica. La muestra sanguínea se obtuvo mediante la punción
la vena caudal. La muestra no superó el 1% del peso del individuo. Los individuos de la especie
Podocnemis vogli, fueron capturados en dos localidades: Puerto Carreño, departamento de Vichada,
y Hato la Esperanza, en Casanare.

Una parte de la muestra se,almacenó en etanol absoluto o EDTA para realizar posteriores análisis
moleculares y la otra parte se utilizó en la elaboración de extendidos sanguíneos, los cuales se
secaron al aire rápidamente para evitar deformación de los parásitos, posteriormente fijados con
metanol absoluto por 5 min y teñidos con Giemsa 4% por 45 min.

Para la recolecta y movilización del material biológico, este proyecto está amparado por el permiso
Marco de recolección de especímenes silvestres de la diversidad biológica para fines no comerciales
otorgado a la Universidad Nacional de Colombia, por parte de la autoridad nacional de licencias
ambientales (ANLA), resolución 0255 del 12 de marzo de 2014 y resolución modificatoria 1482 del
20 de noviembre de 2015. Todos los procedimientos a realizar en este proyecto han sido avalados
por el comité de ética de la universidad Unitrópico y la Universidad Nacional de Colombia.

DETERMINACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS HEMOSPORIDIOS DE REPTILES

El diagnóstico de los parásitos se realizó por medio de microscopía de luz, utilizando el objetivo de
menor y mayor aumento del microscopio Olympus, los extendidos sanguíneos positivos para
hemoparásitos se examinarán en su totalidad para toma de fotografías mediante la cámara digital
Olympus DP27, la cual, esta acoplada al microscopio y procesadas con el Software cellSens Standard.
Las medidas morfométricas de los parásitos y las células eritrocitarias se tomarán empleando el
programa ImageJ (Schneider et al., 2012). La determinación morfológica de los parásitos así como
las medidas morfométricas a tomar para cada uno de los géneros presentes en las muestras
sigueron las descripciones originales y claves diagnósticas de Telford (2009), así como la literatura
recientemente publicada sobre el tema (Cook, C., Smit, N.J., & Davies, A.J, 2010; da Costa Maia, J.
P. M., 2015; Ungari,L.P. et al 2018)

Extracción de ADN

Para las extracciones de las muestras sanguíneas de reptiles se realizó un protocolo de fenol-
cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1) estándar (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989), al cual se
realizó una modificación para obtener un aislamiento más efectivo y limpio de ADN, la cual consistió
en adicionar dos lavados posteriores a el primer y tercer paso de la extracción (fenol-cloroformo-
alcohol isoamílico y cloroformo-alcohol isoamílico) para obtener un mejor lavado en las proteínas
presentes en la muestra, logrando aislar una alta concentración de ADN. Así mismo, la digestión de
las muestras con proteinasa K y los buffers de extracción y lisis se redujo el tiempo a solo 3 horas.

Amplificación de fragmentos del gen 18S rRNA de individuos de la especie Podcnemis vogli y
análisis filogenéticos

A partir del ADN extraído se realizó la cuantificación del mismo por medio de nanodrop y gel de
agarosa al 1.5%, posterior a esto se realizaron diluciones en muestras con una concentración mayor
a 1000ng/µl con el fin de realizar el protocolo de amplificación. Para las muestras con
concentraciones muy bajas (por debajo de 70ng/µL) se realizan dos protocolos de PCR el primero
con el set de primers 4558 y 2733 (Mathew et al. 2000) con un fragmento esperado de 1100pb y
una segunda PCR con el set de primers HEP300 y HEP900 (Ujvari et al. 2004) con un fragmento
esperado de aproximadamente 600pb para obtener banda ideal de amplificación. Para las muestras
con concentraciones más altas aproximadamente 130ng/µL solo fue necesario realizar el protocolo
de PCR con el set de primers HEP300 y HEP900.

Una vez obtenidas las secuencias estas fueron editadas y alineadas en el programa MEGA7:
“Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets” (Kumar, Stecher, and
Tamura 2015). Las distancias genéticas entre las secuencias fueron calculadas con el modelo K2P,
implementado en dicho software.

Para realizar los análisis filogenéticos se determinó el modelo de mejor ajuste al grupo de secuencias
obtenidas empleando el programa JModeltest (Posada, 2008). Posterior a ello se realizaron
diferentes reconstrucciones filogenéticas por medio de inferencia bayesiana (Ronquist &
Huelsenbeck, 2003). En el análisis se incluyeron algunas secuencias tomadas del GenBank (Tabla 1.)
con el fin de tener un referente del posible género taxonómico donde se encuentran ubicados estos
parásitos.

Redes de haplotipos

Con el objeto de determinar la presencia de linajes recientemente evolucionados en coexistencia

con sus ancestros, se realizó un análisis de redes de haplotipos con el software TCS (Clement,
Posada, & Crandall, 2000) para cada una de las secuencias obtenidas tras el proceso de
amplificación.

Código GenBank Especie de parásito Autor

HQ224957.1 Dactylosoma ranarum Barta,J.R. et al 2012
KM887508.1 Haemogregarina pellegrini Dvorakova,N. et al 2015
KF257927.1 Haemogregarina stepanowi Dvorakova,N. et al 2013
KM887507.1 Haemogregarina sacaliae Dvorakova,N. et al 2013
HQ224959.1 Haemogregarina balli Barta,J.R. et al 2012
MF476205.1 Haemogregarina podocnemis Ungari,L.P. et al 2018
MF476203.1 Haemogregarina podocnemis Ungari,L.P. et al 2018
MF476204.1 Haemogregarina podocnemis Ungari,L.P. et al 2018
KF992706.1 Hemolivia mauritanica Kvicerova,J. et al 2014
 HQ224961.1 Hemolivia mariae Barta,J.R. et al 2012
KR069083.1 Hemolivia parvula Cook,C.A. et al 2015
KR069082.1 Hemolivia parvula Cook,C.A. et al 2015
KP881349.1 Hemolivia stellate Karadjian,G. et al 2015

Tabla 1. Secuencias obtenidas desde el GenBank utilizadas para las reconstrucciones filogenéticas.

RESULTADOS.

De los 54 individuos capturados en Hato la Esperanza (Salida 1 y dos), 51 individuos pertenecen a la

especie Podocnemis vogli, de estas el 100% se encontró infectada con Haemogregarinas, el único
individuo de la especie Chelonoides carbonara, no se encontró infectado y los dos muestras Caiman
cocrodilus muestreados, se encontraron infectados con Hepatozoon spp. para una prevalencia
general de 98,1%.

Proporción de organismos infectados

4%
2%

94%

Podocnemis vogli Chelonoides carbonara Caiman cocrodilus

Figura. 1. Prevalencia general de parásitos sanguíneos pertenecientes al grupo de las

Haemogregarinas, encontradas en 54 individuos muestreados en Hato la Esperanza, Paz de Ariporo-
Casanare.

Hepatozoon: Caiman crocodilus

Mediante identificación morfológica se encontró un morfotipo, que de acuerdo a la revisión

morfológica posee las características similares a la especie Hepatozoon caimani. Este morfotipo
genera hipertrofia en la célula hospedera, además, se caracteriza por un citoplasma granual, el
núcleo se encuentra ubicado de forma lateral.
Figura 2. Gamontes maduros infectado a Caiman crocodilus. Bar 10 um.

Hemogregarinas: Podocnemis vogli

Mediante identificación morfológica se encontraron 3 morfotipos, teniendo en cuenta los gamontes

maduros. Para cada uno de los individuos se realizó el cálculo de la parasitemia por morfotipo (Tabla
1).

Morfotipo 1.

Se caracteriza por ubicarse de forma lateral en el eritrocito infectado. Posee forma de frijol, con un
área de 53,29 ± 9,53 µm2, largo de 12,12 ± 0,99 µm y ancho de 4,97 ± 0,65 µm. El núcleo se
encuentra ubicado en el tercer cuarto del cuerpo del parásito, con un área de 9,09 ± 2 µm2, largo de
3,77 ± 1,36 µm y ancho de 2,64 ± 0,76 µm. El citoplasma es agranular, basófilo (Figura 3). En relación
con la célula hospedera causa desplazamiento del núcleo del eritrocito infectado.

A B C D

Figura 3. (A-D) Gamontes maduros del morfotipo 1 de Haemogregarina spp., infectado a

Podocnemis vogli. Bar 10 um.
Morfotipo 2.

Caracterizado por su núcleo alargado ubicado en la periferia del parásito ocupando entre la segunda
y tercer cuarto del parásito, durante las etapas del desarrollo del parásito en ningún momento l
parásito está en contacto ni con la membrana celular, ni con el núcleo. Posee un área de 48,36 ±
12,31 µm2, largo de 11,87 ± 1,76 µm y ancho de 4,37 ± 0,71 µm. El núcleo se encuentra ubicado en
el tercer cuarto del cuerpo del parásito, con un área de 13,05 ± 10,01 µm2, largo de 6,73 ± 2 µm y
ancho de 1,98 ± 0,74 µm El citoplasma es agranular.

A B C D

Figura 4. (A-D) Gamontes maduros del morfotipo 2 de Haemogregarina spp., infectado a

Podocnemis vogli. Bar 10 um.

Morfotipo 3.

Los gamontes se caracterizan por ser de gran tamaño, en comparación con los dos morfotipos
previamente descritos, su tamaño es de área de 123 ± 17,95 µm2, largo de 18,2 ± 1,09 µm y ancho
de 7,9 ± 0,94 µm. El núcleo se encuentra ubicado en el tercer cuarto del cuerpo del parásito, con un
área de 23,5 ± 4,4 µm2, largo de 4 ± 0,5 µm y ancho de 6,2 ± 1,1 µm. Se caracteriza por un citoplasma
granular en la parte anterior del parásito. El núcleo se encuentra ubicado en el tercer cuarto del
parásito, junto con una zona la cual toma una coloración rosada posterior a la tinción Giemsa.

A B C D

Figura 5. (A-D) Gamontes maduros del morfotipo 3 de Haemogregarina spp., infectado a

Podocnemis vogli. Bar 10 um.

COINFECCIONES.

Los tres morfotipos previamente descritos, se encontraron en la mayoría de ocasiones en el mismo

individuo. Para cada uno de los individuos se realizó el análisis de parasitemia por individuo (Tabla
2; Figura 6), El morfotipo que más prevalente fue el morfotipo 2, el cual, se encontró en todos los
individuos analizados, mientras que el morfotipo 3, se encontró en menor número de individuos.
 Medias y 95,0% de Fisher LSD

35

31

27
INDIVIDUO

23

19

15

11
Morfotipo 1 Morfotipo 2 Morfotipo 3
MORFOTIPO

Figura 6: Morfotipos encontrados por individuos de la especie Podocnemis vogli.

Tabla 2. Parasitemia, para cada uno de los morfotipos encontrados infectando individuos de la
especie Podocnemis vogli.

% DE PARASITEMIA POR MORFOTIPO DE Haemogregarinas

INDIVIDUO MORFOTIPO 1 MORFOTIPO 2 MORFOTIPO 3

4,3 0,37 0,82 0,02
3,2 0,12 0,67 0,04
5,1 0,06 0,22 0,01
8,1 0,15 0,48 0,03
9,1 0,07 0,2 0
10,1 0,14 0,35 0
11,1 0,04 0,17 0,01
17 0,07 0,18 0
18 0 0,08 0
19 0,12 0,37 0,01
20 0,22 0,43 0,08
21 0,07 0,09 0
22 0,02 0,08 0
 24 0 0,01 0
25 0,08 0,13 0
26 0,06 0,09 0
27 0,05 0,06 0
28 0,02 0,3 0
29 0,02 0,09 0,04
30 0,17 0,41 0,01
31 0,03 0,05 0
32 0,03 0,18 0
33 0,04 0,07 0
34 0,03 0,07 0
35 0,08 0,14 0,02
36 0,17 0,21 0,01
37 0,02 0 0
40 0,04 0,07 0
41 0,08 0,16 0,09
42 0,01 0,05 0
43 0,2 0,27 0,03
44 0,01 0,07 0,04
45 0,05 0,19 0,02
46 0,11 0,16 0
47 0,04 0,06 0
48 0,06 0,03 0
49 0,04 0,04 0,05
50 0 0 0
51 0,02 0,01 0
52 0,01 0,03 0
53 0,02 0,05 0,01
54 0,05 0,01 0
56 0,17 0,01 0
58 0,03 0,29 0
60 0,03 0,04 0
62 0 0,03 0

Para cada uno de los morfotipos se realizó el cálculo de la media de parasitemias, obteniendo que
el morfotipo 2, es el más representativo en los individuos evaluados (Tabla 3; Figura 7), seguido por
el morfotipo 1.
Tabla 3. Porcentaje de parasitemia por morfotipo identificado en los individuos Podocnemis vogli.

MORFOTIPO 1 MORFOTIPO 2 MORFOTIPO 3

PARÁMETRO

N 42 44 16
MEDIA 0,069 0,23 0,01
DE 0,072 0,55 0,020

Medias y 95,0% de Fisher LSD

0,34

0,24
PARASITEMIA

0,14

0,04

-0,06
Morfotipo 1 Morfotipo 2 Morfotipo 3
MORFOTIPO

Figura 7. Parasitemia por morfotipo encontrado en individuos Podocnemis vogli.

ANÁLISIS MOLECULAR.

Amplificación de fragmentos del gen 18S rRNA de individuos de la especie Podcnemis vogli y
análisis filogenéticos

Se extrajeron en total 58 muestras provenientes de la región de Paz de Ariporo, Casanare,

pertenecientes a individuos de la especie Podocnemis vogli de estas, a la fecha 44 han dado como
resultado positivas para hemoparásitos del grupo de las Hemogregarinas (Tabla 3), obteniendo un
fragmento de amplificación de 584 pb del gen 18S rRNA.
Tabla 3. Individuos con resultado positivo mediante herramientas moleculares para hemoparásitos
de las Hemogregarinas.

Paz de Ariporo Casanare Puerto Carreño Vichada

3 19 33 1
4 20 34 53 2
5 21 35 3
9 22 40 4
10 24 42 54 5
11 25 43 6
Individuos 12 26 44 7
13 27 45 57 8
14 28 46 9
15 29 47 10
16 30 49 11
60
17 31 51 12
18 32 52 13

En la reconstrucción filogenética basada en las secuencias previamente mencionadas se observa

que la mayoría de las secuencias fueron agrupadas con buen soporte (1.0) dentro del clado de las
Haemogregarinas, mientras que ninguna de las secuencias obtenidas agrupo con las secuencias de
Hepatozoon (figura 8.)
Figura 8. Reconstrucción filogenética basada en un alineamiento de fragmentos de
aproximadamente 600bp del gen 18S rRNA de Hemogregarinas, utilizando el método de inferencia
bayesiana y un modelo evolutivo GTR+I+G.

Así mismo, se realizó otro análisis utilizando varias secuencias de Hemogregarinas reportadas
infectando tortugas de otras regiones de Colombia (Figura 9). Las secuencias en naranja pertenecen
a individuos de la especie Podocnemis vogli muestreadas en la región de Puerto Carreño, Vichada,
y los individuos incluidos en este informe (Hato la Esperanza, Paz de Ariporo, Casanare), localidades
ubicadas en la región de la Orinoquía, colombiana.

A pesar, que las secuencias obtenidas continúan agrupándose como Haemogregarinas, se

presentan dos grupos hermanos (Figura 9), en el primero de estos se presenta una politomia, lo
cual indica que las secuencias obtenidas presentan estrecha similitud, asi mismo, en este grupo se
encuentran las secuencias reportadas en el GenBank para algunas hemogregarinas de Brasil incluida
una nueva especie descrita recientemente Haemogregarina podocnemis (Úngari L. P. et al 2018). En
este análisis filogenético, además se incluyeron secuencias previamente obtenidas en el grupo de
investigación para cuatro individuos de la especie Rhinoclemmys melanosterna muestreadas en la
región de Yondó, Antioquia (Azul), sin embargo, tres de estas secuencias, que se agrupan en
politomia, se ubican cerca de las secuencias de Haemogregarinas reportadas en el viejo mundo
(amarillo). En color morado, se encuentran secuencias descargadas de otro género del grupo de
Haemogregarinas, conocido como Hemolivia, y el cual ha sido reportado más comúnmente en el
viejo mundo. Para América el único reportado asociado a este parásito se encuentra en Nicaragua.
Como grupo externo se utilizó la secuencia 18S rRNA de Dactylosoma ranarum.
Figura 9. Reconstrucción filogenética basada en un alineamiento de fragmentos de
aproximadamente 600bp del gen 18S rRNA de Hemogregarinas, utilizando el método de inferencia
bayesiana y un modelo evolutivo GTR+I+G.

Red de Haplotipos

Dado la politomia obtenida para las secuencias de los individuos de Paz de Ariporo, Casanare y
Puerto Carreño, Vichada (cuadro narange Figura ura 2), se realizó la red de haplotipos (Figura ura
10), en la cual, el color verde representa las secuencias correspondientes a Paz de Ariporo y el
rosado a Puerto Carreño-Vichada. El color azul corresponde a las secuencias obtenidas para cuatro
individuos de Puerto Carreño, Vichada y quince secuencias de Paz de Ariporo (Figura 3). El color
amarrillo, se encuentran las secuencias, que agrupan aparte de la politomia. El color rojo, agrupa
solamente a dos secuencias correspondientes a los individuos 40 y 54 de Paz de Ariporo y el color
morado, se agrupan tres secuencias: Individuos 4, 46 y 53 también Paz de Ariporo. Cada uno de los
puntos negro corresponde a un paso mutacional entre un linaje y otro.
Figura 10. Análisis filogenético mediante red de haplotipos, de las secuencias obtenidas en este
informe.

Discusión.

En este informe se presentan los resultados parciales, del análisis de hemoparásitos encontrados en
las tortugas que habitan en Hato la Esperanza Paz de Ariporo, Casanare y 13 muestras de la misma
especie capturadas en Puerto Carreño-Vichada. Importante resaltar la tortuga terrestre Chelonoidis
carbonaria no se encuentra infectada con Hemogregarinas. Esta situación, puede asociarse a la falta
de contacto del hospedero vertebrado (en este caso Chelonoidis carbonaria), con el vector asociado
a la transmisión de estos parásitos, las sanguijuelas.

Por otra parte, en relación con los hemoparásitos encontrados infectando a los individuos de la
especie Podocnemis vogli, nosotros consideramos la presencia de coinfecciones, teniendo en cuenta
que se encontraron tres morfotipos mediante microscopía y diferentes linajes, mediante
herramientas moleculares. Nuestros resultados, fueron comparados con los obtenidos por Úngari
et al., 2018, quienes reportan una nueva especie Haemogregarina podocnemis (Incluida en
nuestros análisis filogenético). Los autores encuentran morfotipos similares a los obtenidos en este
informe, como por ejemplo, la presencia de gamontes de gran tamaño, que cuentan con una zona
rosada en la parte posterior del parásito, y un citoplasma granular en la parte anterior, o la presencia
de gamontes, con el núcleo circular ubicado en la tercer parte del cuerpo del parásito, infectando
tortugas de la especie Podocnemis unifilis, no obstante, todos los morfotipos observados fueron
agrupados, como diferentes estadios de la especie descrita, donde el morfotipo 1 y 3, reportados
en este estudio fueron denominados como macro gamontes (Tabla 4). En relación con los resultados
moleculares, ninguna de las secuencias obtenidas en este informe, se agrupan con las secuencias
depositadas en GenBank para la especie H. podocnemis, lo cual puede sugerir un proceso de
especiación criptica.
Tabla 4. Diferencias morfométricas de la especie reportada en Brasil, Haemogregarina podocnemis
y el morfotipo 3, encontrado en este informe.

Características Este estudio H. podocnemis P

Gametocito
Largo 18,2 ± 1,09 20,5 ± 0,82 <<0,05
Ancho 7,9 ± 0,94 8,1 ± 0,76 0,53
Area 123 ± 17,95 44,6 ± 6,01 <<0,05
No Pigment granules SI SI
Núcleo
Largo 4,0 ± 0,5 4,3 ± 0,0 <<0,05
Ancho 6,2 ± 1,1 7,9 ± 0,8 <<0,05
Area 23,5 ± 4,4 24,6 ± 0,9 0,19

Partiendo de la premisa anterior, el análisis de red de haplotipos, muestra la relación entre las
diferentes secuencias obtenidas, algunas de los cuales se comparten entre las localidades de Puerto
Carreño y Paz de Ariporo. De acuerdo al análisis filogenético, se obtuvieron cuatro grupos
principales, que agrupan la mayoría de las secuencias; el color azul, representa 19 haplotipos, el
color morado 2, el naranja agrupa 3 y el color rojo a dos, generando una red de haplotipos mixta,
donde se encuentran varios haplotipos representados en pequeñas cantidades. El último haplotipo
(rojo) es el que mayor cantidad de pasos mutacionales presentan y además se encuentra ubicado
en un clado aparte en el árbol filogenético, lo cual podría deberse a dos posibles situaciones: (1) que
las secuencias que agrupan allí, pertenecen a un morfotipo específico, teniendo en cuenta que de
acuerdo al análisis microscópico de estos dos individuos (40 y 54), solo se encuentran el morfotipo
1 y 2, o, (2) a ser los haplotipos mas nuevos en la población. Teniendo en cuenta que en el 99% de
los individuos analizados a la fecha, mediante herramientas morfológicas se evidencio
coinfecciones, es necesario asociar una infección simple a algunos de los clados obtenidos en el
árbol filogenético, partiendo de la dificultad que para (1) el haplotipo mas ancestral (Azul), (2) el
identificado de color morado, (los cuales en el árbol filogenético generan la mayor de las politomias)
y (3) el identificado de color naranja, las parasitemias obtenidas por microscopia muestran un mayor
porcentaje de hemoparásitos pertenecientes al morfotipo 2, lo cual, no obstante, no asegura que
sea la secuencia perteneciente al mismo, la amplificada en todos los casos, por lo que asociar un
morfotipo específico a alguna secuencia es apresurado en este momento.

Asi mismo, el que se compartan haplotipos entre individuos muestreados en lugares

geográficamente apartados, puede asociarse a las zonas de distribución de la especie muestreada,
teniendo en cuenta que Podocnemis vogli, se restringe a las sabanas de la Orinoquia de Colombia y
Venezuela (Rueda-Almonacid et al., 2007), al norte y occidente de la Cordillera Oriental, llegando a
los ríos Orinoco, Guayabero y Guaviare (Castaño-Mora, 2002), entre otras subcuencas como lo son
los ríos Meta, Bita, Guainía, Inírida y Arauca; afluentes hídricos que se distribuyen entre los dos
departamentos analizados, esto, permitiría la distribución de parásitos entre estas zonas, al haber
desplazamientos de los hospederos vertebrados entre las dos localidades analizadas (Puerto
Carreño y Hato la esperanza).
Por último, la prevalencia general (100%) es superior a la reportada en estudios realizados en países
aledaños a nuestro territorio, en otras especies del mismo género. Pineda-Catalan et al., (2013),
reportan una prevalencia de 12,5% (27/96) para P. expansa y 9,5% (13/136) para P. unifiis; Picelli
et al., (2015) reportaron una prevalencia de 66% (50/75), en P.expansa analizadas en Brasil, donde
el morfotipo reportado es diferente al encontrado en este estudio, y Soares et al., (2014) quienes
muestrearon esta misma especie en Brasil encontrado el 98 % (n = 71), de los individuos infectados,
demostrando que las hemogregarinas son comunes en estos individuos, teniendo en cuenta, que
algunos autores han reportado que el efecto patógeno de estos hemoparásitos es mínimo en las
tortugas (Brown et al., 1994 , Knotkova et al., 2005)

En relación con el morfotipo encontrado en Caiman crocodilus, de acuerdo a descripciones

morfológicas se cree que la especie H. caimani es la única especie que se ha reportado en diferentes
especies de Caiman latirostris (Smith 1996) y Caiman crocodilus (Laison 1977; Laison et al., 2003) en
América del Sur, reportándose que su vector natural son los mosquitos del género Culex (Viana et
al., 2010 ), siendo la forma de transmisión la ingesta de otros hospederos vertebrados como anuros.
En la región Amazónica, diferentes autores han reportado la presencia de ese hemoparásitos
infectando la misma especie de nuestro estudio con una prevalencia de 76,7% (Laisson 1977). En
relación con los efectos patológicos que puede causar esta especie, en hospederos naturales no se
han reportado efectos negativos, sin embargo, es otros individuos como serpientes en condiciones
de estrés, se han reportado cuadros neurológicos y anemia hemolítica. (MoCo 2008).

Con base en estos resultados, debe considerarse la inclusión de este tipo de líneas de investigación
encaminadas a la conservación de especies, teniendo en cuenta que diferentes estadísticas
publicadas, muestran que en términos generales, Sin embargo, es necesario la realización de
estudios con un fragmento de mayor tamaño de este marcador, como la utilización de otros
marcadores para obtener una mejor resolución en los análisis.

Para los órdenes Testudines y Crocodylia, el porcentaje de especies amenazadas, corresponden al

58% y 44%, respectivamente de sus especies (Grigg y Kirshner 2015), asi mismo, aproximadamente
el 20% de las especies de reptiles se encuentran amenazadas de extinción y para otro 20% no se
cuenta todavía con la información necesaria para asignar una categoría de amenaza, a nivel mundial
(Tomović et al. 2015). En Colombia, la situación es similar teniendo en cuenta que a pesar que a
nivel mundial ocupamos el tercer lugar en cuanto a biodiversidad se refiere, también, poseemos
estadísticas elevadas de degradación de hábitat y crecimiento poblacional (Hoekstra et al. 2010), lo
cual crea la necesidad de fortalecer los programas de conservación y reubicación de fauna silvestre.
A la fecha desconocemos que acontece con la salud de las tortugas y los cocodrilos infectados. Se
planea incluir análisis de histopatología de al menos 4 ejemplares, y proponer estudios de
seguimiento para determinación del agente vectorial del parásito, también como alteraciones ya
sea en comportamiento o hábitos de las tortugas o cocodrilos infectados.

Actividades por realizar:

- Inclusión de los individuos muestreados en la tercer salida a Paz de Ariporo Casanare.

- Comparación de las secuencias obtenidas vs los morfotipos encontrados mediante
morfología, con el fin de asociar linajes único a morfotip o encontrado. (todas las salidas)
- Revisión de la morfología de las secuencias obtenidas para Puerto Carreño Vichada.
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