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Vol.48, n. 1: págs. 1-6, enero de 2005

ISSN 1516-8913 Impreso en Brasil
ARCHIVOS BRASILEÑOS DE
BIOLOGIA Y TECNOLOGIA
ANUNCIO INTERNACIONAL L

La electroforesis en gel de campo pulsado revela diferencias

de longitud y número de cromosomas en Brasil y cepas de
Metarhizium anisopliae

Vanessa Kava-Cordeiro1 *, Mar isa Vieira de Queiroz2, Aline Aparecida Pizzirani-K leiner 3
y JoãoLúcio Azevedo3
1Laboratório de Genética de Microrganismos; Departamento de Genética; Universidade Federal do Paraná;
CP 19071; 81,531-990; Curiti ba - PR - Brasil.2 Departamento de Microbiología; Universidade Federal de Viçosa;
Viçosa - MG - Brasil.3 Departamento de Genética; Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”;
Universidade de SãoPaulo; Piracicaba- SP - Brasil

ABSTRACTO

Cariotipos electroforéticos de ocho cepas tipo wil d de Metarhizium anisopliae var. anisopliae se obtuvieron mediante
electroforesis en gel de campo pulsado. Estas cepas se aislaron de insectos de seis estados brasileños diferentes. Las
moléculas de ADN cromosómico de tres tipos se separaron en siete bandas y de cinco cepas en ocho bandas. También se
observaron polimorfismos de longitud cromosómica. El tamaño del ADN cromosómico de todas las cepas varió entre 7,7 y
0,9 Mb utilizando elAspergill nosotros nidulans cromosomas como estándares de tamaño. El tamaño total del genoma de
estas cepas se estimó en al menos 29,7 Mb. Se discutieron algunas correlaciones entre las diferencias en el cariotipo y la
ocurrencia del ciclo parasexual, así como la especificidad del anfitrión.

Palabras clave: Metarhizium anisopli ae, electroforesis en gel de campo pulsado, polimorfismos cromosómicos, parasexual
ciclo, hongo entomopatógeno

INTRODUCCIÓN cromatografía de pirólisis-gases (Messias et al.,

Metarhizium anisopli ae es un hongo hifomiceto
entomopatógeno, que ha sido reconocido como
una poderosa herramienta en el control de plagas
en la agricultura. En Brasil ,M. anisopli ae var.
anisopli ae se ha empleado principalmente para
controlar Cercopidae: Homoptera, como Mahanarva
posticata en caña de azúcar y Deois flavopicta y
Zuli a entrerianaen pastos. La naturaleza y extensión
de la variación genética en esta especie se ha
evaluado de varias formas: análisis de isoenzimas (De
Conti, et al., 1980; St. Leger et al., 1992);
1983); tasas de crecimiento (Huxam et al., 1989);
virulencia (Daoust y Roberts, 1982); producción de
enzimas extracelulares (Rosato et al., 1981); RFLP,
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
(Pipe et al., 1995) y RAPD, ADN polimórfico amplificado
aleatoriamente (Bidochka et al., 1994; Fegan et al., 1993
y Fungaro et al., 1996). Todos los datos mostraron una
gran diversidad genética entre los aislamientos
analizados. Los resultados derivados del análisis RAPD
(Fungaro et al., 1996) mostraron por primera vez que la
variabilidad genética entre los insectos aislados era
mucho menor que la variabilidad genética observada.

*
Autor para correspondencia

Archivos Brasileños de Biología y Tecnología

2 Kava-Cordeiro, V. et al.
entre los suelos solados, lo que sugiere que este hongo se
desarrolló con un cierto grado de especificidad del
hospedador. Se utilizó una técnica eficaz denominada
electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) para separar
moléculas de ADN del tamaño de un cromosoma de METRO.
anisopli ae (Shimizu et al., 1992 y Valadares-Inglis y Peberdy,
1998). Sin embargo, hasta ahora solo se han probado unos
pocos aislamientos con esta técnica y la mayoría de ellos
derivan de un hospedador de una sola especie. El presente
trabajo se realizó en un intento por mejorar las condiciones
utilizadas en la separación cromosómica de este hongo;
Estudiar las posibles diferencias de moléculas de ADN del
tamaño de un cromosoma en número y tamaño de ocho
aislamientos deM. anisopli ae
var. anisopli ae de diferentes insectos hospedadores y
regiones y encuentran alguna correlación entre la
ocurrencia del ciclo parasexual descrito por otros
autores y el cariotipo encontrado en el presente trabajo
utilizando las mismas cepas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Son
Cepas de M. anisopli ae utilizados en este trabajo
se obtuvieron del “Laboratório de Genética de
Microrganismos” (ESALQ / Universidad de São
Paulo, Brasil). Las ocho cepas de tipo salvaje se
aislaron de insectos de seis estados diferentes de
Brasil y se designaron de la siguiente manera: E6 y
E9 (del estado de Espirito Santo), M5
(Pernambuco), MT (Mato Grosso), RJ (Rio de
Janeiro ) y AL (Alagoas), todos deDeois flavopicta.
Las cepas A4 y A19 se aislaron del estado de Bahía,
deMahanarva posticata y Deois schach,
respectivamente. La cepa MSE de
Aspergill nosotros nidulanos se utilizó como fuente de estándar
de tamaño de ADN cromosómico.
Preparación de ADN cromosómico intacto
Tapones de agarosa que contienen A. nidulans Se
prepararon ADN de cromosomas intactos como
describen Brody y Carbon (1989). Los protoplastos
delM. anisopli ae Las cepas se obtuvieron según lo
descrito por Silveira y Azevedo (1987) en un
Tampón fosfato de KCl 0,7 M como estabilizador osmótico. El
ADN del tamaño de un cromosoma se preparó según los
procedimientos que se utilizan actualmente paraA. nidulans, con
modificaciones. Las suspensiones de protoplastos fueron
centrifugado durante 10 minutos a 4000 rpm y
Archivos Brasileños de Biología y Tecnología
los protoplastos se resuspendieron en tampón GMB (EDTA
0,125 M pH 7,5, sorbitol 0,9 M) y se centrifugaron de nuevo
durante cinco minutos en las mismas condiciones. Este
procedimiento se repitió dos veces para eliminar las
enzimas líticas utilizadas en la producción de protoplastos.
A continuación, los protoplastos se resuspendieron en
tampón GMB, para obtener una concentración final de 109
células por mL. Luego, la suspensión se colocó en 42o C y se
añadió un volumen igual de agarosa al 1,4% (LGT-Low Gelli
ng Temperature) a la misma temperatura. La mezcla se
homogeneizó suavemente, se colocó en un molde de tapón
(Bio-Rad) y se mantuvo en un baño de hielo durante diez
minutos. A continuación, se retiraron los tapones y se
incubaron en tampón NDS (EDTA 0,5 M, pH 8,0; Tris-HCl 10
mM, pH
9,5; 1% (p / v) de N-lauroilsarcosinato de sodio) que
contiene proteinasa K (1 mg / ml) a 50oC durante la
noche. El NDS más proteinasa K se reemplazó por
EDTA 50 mM (pH 8,0) más N-lauroilsarcosinato de
sodio al 1% (p / v) y se incubó a 50ºC.o
C durante 30 minutos. Finalmente, los tapones se
lavaron tres veces en EDTA 50 mM (pH 8,0) a 50ºC.o C
con un intervalo de una hora entre cada lavado con
remolinos ocasionales. Los tapones se almacenaron
en EDTA 50 mM (pH 8,0) a 4ºC.oC.
Condiciones de electroforesis en gel de campo pulsado
La electroforesis se realizó en un sistema CHEF-DRII
(Bio-Rad). Se prepararon geles de agarosa de grado
cromosómico (Sigma) al 0,6% y 0,8% (p / v) y se
procesaron en tampón TBE 0,5x (Tris 44,5 mM,
Ácido bórico 44,5 mM, EDTA 1 mM). Los tapones se
insertaron en los pocillos del gel y se sellaron con el
mismo agar utilizado para preparar el gel. Las
condiciones de electroforesis (intervalos de pulso y
duraciones) fueron: A) 50 min, 45 min y 37 min, durante
73 h, 18 hy 73 h, respectivamente, con un voltaje de 46
V; B) 90 y 60 min durante 72h cada uno con un voltaje de
40V (Shimizu et al., 1992). Durante la corrida, la
temperatura se mantuvo a 12o C. Los geles se tiñeron en
bromuro de etidio (0,5 mg / ml) durante 20 min, se
destiñeron en agua destilada durante 20 min y se
fotografiaron bajo iluminación ultravioleta con
transiluminación usando película Ilford 50.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El método utilizado en este trabajo para preparar moléculas
de ADN del tamaño de un cromosoma de ocho cepas.
 Electroforesis en gel de campo pulsado que revela diferencias de longitud y número de cromosomas 3

de M. anisopli ae var. anisopli ae resultó ser eficiente
considerando que se obtuvieron buenas bandas de
resolución para todas las cepas analizadas. Utilizando
los parámetros descritos por Shimuzi et al. (1992) no
pudimos resolver los ADN cromosómicos en siete
bandas como lo describen estos autores. Tres cepas
deM. anisopli ae aislados en Japón fueron del suelo y
dos de insectos (Bombyx mori y
Anomala cuprea). Cada una de estas cepas mostró un
perfil de bandas único. Valadares-Inglis y Peberdy
(1998) utilizando cuatro cepas deM. anisopli ae,
aislado de Deois sp. en Brasil, pudieron resolver el
ADN cromosómico en ocho bandas para una cepa y
siete bandas para otras. Utilizaron longitudes de
pulso inicial y final con rampa lineal de 3000 y 1300,
respectivamente, durante 167 horas. Entre tres
grupos deM. anisopli ae ADN cromosómico, el Grupo
I mostró de dos a tres bandas
correspondiente a moléculas entre 0,9
2,8 Mb; El Grupo II tenía tres bandas correspondientes a
moléculas entre 3,6 y 4,9 Mb y el Grupo III tenía de dos a
tres bandas correspondientes a moléculas entre 6,0 y
7,7 Mb (Tabla 1 y Fig. 1). Tres bandas en el Grupo III se
resolvieron únicamente usando condiciones de
electroforesis B (Shimizu et al., 1992) (datos no
mostrados). Estos parámetros fueron útiles para
mostrar que algunas bandas simples mostradas en el
Grupo III con la condición A eran dobletes. En el Grupo I
y Grupo III se observaron polimorfismos en la longitud y
en el número de ADN cromosómico mientras que en el
Grupo II solo se detectaron polimorfismos de longitud.
El tamaño total del genoma de estas cepas se estimó en
al menos 29,4 Mb. Los tamaños moleculares de los ADN
cromosómicos se estimaron con referencia a los
estándares de tamaño, utilizando el software Kodak 1D
ImagingAnalysis.
y

tabla 1 - Tamaño estimado (Mb) y número de M. anisopli ae ADN cromosómico según lo determinado por CHEF
análisis.
Grupo y Cepa
Nº de banda E6 E9 RJ A4 A19 M5 MONTE Alabama

III 3 7,6 7,6 7,6 7,6 7.2 7.7 7.7 7,6

III 2 6,7 - 6,8 6,9 6.6 6,7 6,9 7.3
III 1 6.1 6.2 - - 6.1 - 6.0 7.0
II 3 4,7 4.5 4.6 4,7 4.5 4,7 4.5 4.9
II 2 4.3 3.8 4.2 4.3 3.8 4.4 3.8 4.3
II 1 3.8 3.6 3.6 3.6 3,7 3.6 3,7 3.6
Yo 3 2.5 2.3 2.5 2.0 2.4 1,5 2.4 2.8
Yo 2 1,5 1.4 1.4 1,5 1.4 1.4 1.4 1.4
Yo 1 - - 0,9 - - - - -
Total 37,2 (8) 29,4 (7) 31,6 (8) 30,6 (7) 35,7 (8) 30,0 (7) 36,4 (8) 38,9 (8)

Las diferencias en el número y la longitud de los cromosomas polimorfismo en F. oxysporum y concentraciones de

son comunes no solo en Metarhizium anisopli ae
(Shimizu et al., 1992, Valadares-Inglis y Peberdy,
1998) sino también en otros hongos como
Cladosporium fulvum (Talbot y col. 1991),
Neurospora crassa (Orbach et al., 1988),
Coll etotrichum gloeosporioides (Masel y col.,
1990), Hace Ustil hordei (McCluskey y Mill s,
1990), Fusarium solani (Bruschi y Nazareth,
1994; Suga y col. 2002) yFusarium oxysporum
(Davière et al., 2001). Estas diferencias se
atribuyeron principalmente a translocaciones
(Orbach et al., 1988 y Talbot et al. 1991) y otros
reordenamientos cromosómicos (Masel et al.,
1990). Davière y col. (2001) observaron una
correlación entre el alto nivel de cromosomas
elementos transponibles (TE), pero estos elementos
no fueron detectados en M. anisopli ae. EnM. anisopli
ae, los recombinantes se obtuvieron por
parasexualidad (Bagagli et al., 1991; Messias y
Azevedo, 1980; Valadares-Inglis y Azevedo,
1997) pero, en algunos casos, fue extremadamente
difícil producir heterocariones y recombinantes estables
entre algunas cepas. Silveira y Azevedo (1987)
obtuvieron recombinantes entre E6 y RJ solo por fusión
de protoplastos e incluso entonces, los productos de
fusión eran muy inestables pero producían sectores más
estables que demostraron ser cepas recombinantes.
Estos resultados concuerdan con las diferencias
encontradas entre los cariotipos monogelectroforéticos
de las cepas E6 yRJ en este estudio.

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4 Kava-Cordeiro, V. et al.

Aparte de las translocaciones, otros factores
pueden explicar el grado de incompatibilidad
entre las cepas RJ y E6. Pamphile (1992) no pudo
producir recombinantes entre diferentes cepas
como E6 y MT, las cuales mostraron un cariotipo
muy similar.
Las similitudes y diferencias encontradas en los
cariotipos moleculares de las cepas estudiadas en el
presente trabajo, parcialmente de acuerdo con los
resultados de otros autores. DeConti y col. (1980),
utilizando el análisis del perfil de esterasa, distinguieron
tres grupos de cepas, el primero que incluía las cepas E6
y E9, un segundo que comprendía la cepa A19 y un
tercero que incluía la cepa A4. En el presente trabajo, no
fue posible comparar E9 con otros, pero E6, A4 y A19
mostraron cariotipos diferentes.

megabyte Un. E6 E9 RJ A4 A19 M5 MT AL

III
5,0
4.5
4.2 II

2.9

Figura 1 - Separación de Metarhizium anisopli ae ADN cromosómico intacto en un gel CHEF.

Se sometió a electroforesis gel (0,6% p / v) en condición A. Grupo I) dos a tres bandas
correspondientes a moléculas entre 0,9 y 2,8 Mb; Grupo II) tres bandas
correspondientes a moléculas entre 3.6 y 4.9 Mb y, Grupo III) con estos parámetros
presenta dos bandas correspondientes a moléculas entre 6.0 y 7.7 Mb.
Un muestra el Aspergill nosotros nidulanos estándares de tamaño de cromosomas.

El análisis RAPD entre las cepas E6, E9 M5, AL y RJ
mostró un perfil distinto para cada cepa, excepto
para E6 y E9 que mostraron el mismo perfil. Los
datos del dendrograma UPGMA mostraron que E6 /
E9 y M5 eran los más similares a AL en el mismo
grupo y la cepa RJ era la menos similar (Fungaro et al.,
1996). En el presente trabajo, se encontraron distintos
cariotipos electroforéticos a partir de estas cepas,
derivadas del mismo hospedador,D. flavopicta, y RJ fue
la única cepa que mostró una pequeña banda
cromosómica (0,9 Mb).
Estos resultados fueron en parte de acuerdo con
el trabajo de Fungaro et al. (1996). La cepa A19
aislada de otra especie deDeois (D. schach)
mostraron casi el mismo cariotipo electroforético
de MT y E6. Estas cepas se aislaron de diferentes
regiones muy alejadas entre sí. Con base en los
datos actuales, no es posible hacer alguna
correlación entre el cariotipo electroforético
de cada cepa y sus huéspedes o la localización
geográfica. Utilizando datos derivados de AFLP,
polimorfismo de longitud de fragmento
amplificado, Muro et al. (2003) no pudieron hacer
alguna correlación entre 50 aislamientos del
hongo entomopatógenoBeauveria bassiana y
anfitriones u orígenes geográficos.
Los datos aquí mostrados indicaron que esta especie
presentaba una amplia diversidad genética. El genero
Metarhizium podría dividirse básicamente en tres
especies: M. anisopli ae, M. flavoviride y M. albus,
con algunas variedades descritas dentro de estas
especies. Se debe realizar un estudio más
detallado que incluya el cariotipo electroforético, y
puede resultar valioso para una mejor definición
de laMetarhiziumtaxonomía de género.

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 Electroforesis en gel de campo pulsado que revela diferencias de longitud y número de cromosomas
EXPRESIONES DE GRATITUD
El presente trabajo fue apoyado por Capes
(beca a VKC) y CNPq.
RESUMO
Cariótipos de oito linhagens selvagens do fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopli ae var.
anisopli ae foram obtidos em gel, por eletroforese
em campo pulsado. As linhagens foram isoladas de
insetos provenientes de seis estados brasileiros.
Como moléculas de ADN cromosómico de três
linhagens foram separadas em sete bandas e, de
cinco linhagens, em oito bandas. Polimorfismo de
tamanho cromossômico também foi observado. O
tamanho do DNA cromossômico de todas as
linhagens variou de 7,7 a 0,9 Mb, utili zando-se DNA
cromossômico deAspergill nosotros nidulanos como
padrão. O tamanho dogenoma total foi estimado em
pelo menos 29,7 Mb. Algumas correlações entre
semelhanças e diferenças no cariótipo eletroforético
ea ocorrência do ciclo parassexual como também a
especificidade com insetos hospedeiros foram
discutidas.
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Recibido: junio de 2006 de 2003;

Revisado: 30 de enero de 2004;
Aceptado: 07 de julio de 2004.

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