UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA

SALUD UNIDAD LERMA

Análisis y caracterización morfológica de las comunidades bacterianas Fotoheterótrofas y

Quimioheterótrofas provenientes de desechos de un rastro de Guanajuato, México.

Alfredo Morales León 1, Citlalli Mejía Garza1, German Crispin Jaimes1, Maritza Peñaflor Ramirez1, Cristian Castillo Cruz
1,Alejandra Miranda Carrazco 2
1 Licenciatura en Biología Ambiental, UAM Lerma
2 Profesora, Departamento de Ciencias Ambientales, UAM Lerma.

P a l a b r a s c l a v e R e s u m e n

Gram-positiva
Los rastros son aquellos sitios donde se procesan los animales para la producción de carne por lo que sirven como posibles
Gran-negativa
fuentes para la proliferación de microorganismos como virus, bacterias y hongos que pueden adherirse a la carne animal
Biorreactor
durante las etapas de sacrificio y procesamiento por lo que pueden suponer riesgos para la salud humana. Es por eso que el
Identicación
objetivo de este trabajo fue aislar e identificar morfológicamente a las bacterias fotoheterótrofas y quimioheterótrofas
Inóculo provenientes de desechos de un rastro en Guanajuato, México. Para ello en el laboratorio se realizaron medios de cultivo
Morfotipo líquidos (Van Niel) y sólido (LB) con el fin de crecer distintos morfotipos, para realizar posteriormente extracción de DNA
la cual se sometió a una electroforesis. Adicionalmente se llevó a cabo la identificación de la morfología microscópica con
aumento de 100x para la determinación de las bacterias gram-positivas y gram-negativas con ayuda de la tinción de gram.
Obteniendo como resultado una igualdad en el número de bacterias gram-positivas y gram-negativas presentes en las
muestras de la etapa 1.

1. Introducion
Los microorganismos juegan un papel ecológicamente vital en una
gran diversidad de ambientes de la biosfera, prácticamente están
presentes en los ecosistemas , incluso en aquellos con
condiciones ambientales extremas y su importancia se puede
observar desde las interacciones que estos presentan en los
ecosistemas (p. ej. fijación de nitrógeno). Algunos de estos organismos
son los quimioheterótrofos (utilizan fuentes orgánicas como fuente de
energía) y los fotoheterótrofos (usan la luz como fuente de energía).
En el contexto de los rastros no puede subestimarse el papel que
realizan, debido a que son una fuente potencial de enfermedades para
el ser humano. Los rastros son instalaciones donde se procesan los
animales para el consumo de carne y sirven como posibles fuentes de
microorganismos, esto debido a que usan grandes cantidades de agua,
ya sea para el lavado de sangre de los canales, la esterilización de
equipos y la limpieza del área de trabajo, lo que genera gran cantidad
de materia orgánica en los efluentes que salen de estos lugares
(Barrera, et al, 2012)que pueden servir como fuente de energía
para los microorganismos, entre los cuales pueden abundar virus,
bacterias, arqueas y hongos, estos últimos pueden adherirse a la carne
animal durante las etapas de sacrificio yprocesamiento por lo que pu-
eden suponer riesgos para la salud humana, es por eso que su estudio
es de vital importancia para garantizar la seguridad alimentaria,
mantener los estándares de calidad y minimizar el riesgo de
enfermedades transmitidas por los alimentos.
Uno de los procesos realizados en los rastros es el de evisceración
que consiste en la salida de las vísceras abdominales y con ello varios
de los microorganismos presentes en estas áreas, incluyendo
patógenos y los antibióticos veterinarios usados para controlar las
enfermedades de los animales para mejorar la producción animal
(Barrera, et al 2012). Sin embargo, este tema de los
antibióticos usados en los animales ha tomado relevancia en los
últimos años por la resistencia que han desarrollado diversas
bacterias a estos compuestos debido a que los rastros
proporcionan un entorno en el que los microorganismos pueden
proliferar debido a la presión selectiva que ejerce el uso de
antibióticos, principalmente aquellas pertenecientes al grupo de
bacterias ESKAPE (enterococo spp., Staphylococcus aureus,
Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.) y Escherichia
coli (Savin, et al, 2020), esto también ha provocado el desarrollo
de resistencias cruzadas a los antimicrobianos que se -

1
utilizan habitualmente en la medicina humana generando un efecto
negativo en los tratamientos para distintas patologías. Es por eso que el
objetivo de este estudio fue analizar las comunidades bacterianas
fotoheterótrofas y quimioheterótrofas del lodo provenientes de los
desechos de un rastro en Guanajuato, México para identificarlas
morfológicamente.
2.Metodologia
Para el análisis de este trabajo se utilizó la muestra de residuos (lodos)
provenientes de un rastro los cuales pasaron por un reactor alimentado
con los desechos, en este reactor se trabajó con diferentes condiciones
dando cuatro etapas de estos residuos pues tuvieron “diferentes tiempos
dentro del foto reactor, la etapa 1 de 140 días, etapa 2 de 60 días, etapa 3
de 49 días con las mismas condiciones de luz infrarroja 85- 189 w,
manteniendo un intervalo de pH entre 7,03 y 9 posteriormente ,
temperatura de 26°C 36° . Para este trabajo se centró principalmente en
la etapa 1 la cual consistió en el cultivo e identificación de baterías de los
gremios fotoautótrofos y quimioheterótrofos .
Preparación del medio de cultivos
El medio de cultivo utilizado fue “Van Niel” el cual fue modificado
(tabla 1) de acuerdo al promedio de los valores de nitrógeno, carbono y
fósforo de la tabla de valores promedio de efluentes del recator (tabla
2), esto con el fin de que las bacterias tuviera la cantidad adecuada para
un óptimo crecimiento.
Tabla 1.Composición del medio de cultivo Van Niel modificado
En la elaboración del medio de cultivo se siguieron las medidas estándar
de laboratorio; se pesaron todos los reactivos en una balanza analítica
para pasarlos posteriormente a un matraz Erlenmeyer de 1L el cual
tuvo una proporción de 0.30 L de agua destilada, con ayuda de una
probeta de 0.05L se pasaron 0.05 L del medio a 6 matraces aforados
diferentes con una capacidad de 0.25 L, se homogeneizar el medio
con la técnica de inmersión.
Se taparon todos los matraces un tapón de algodón y gorro de papel
para pasar a esterilizar al autoclave con las condiciones estándar (121°
C , 15 lb de presión, durante 15 mn). Posterior a la esterilización de los
matraces se realizó también la esterilización de la glucosa la cual se
realizó por medio de filtración, con una membrana de 0.20 µm con
ayuda de un tubo de una jeringa esteril dentro de la campana de
extracción. Al término de la esterilización de los matraces se adicionó
la glucosa a cada matraz así como 100 microlitros del inóculo en la etap-
2
a 1 con una micropipeta. De los 6 matraces se taparon 3 con papel
aluminio para evitar que la muestra tuviera contacto con la luz
asegurar el crecimiento de microorganismos únicamente
quimioheterótros los demás matraces se dejaron descubiertos para el
crecimiento de fotoheterótrofos. Este primer medio de cultivo fue
líquido para permitir el intercambio de gases y replicar
condiciones que se tenían en el reactor, también y se mantuvo en
agitación a 150 rpm en todos los matraces, así como una
iluminación con luz infrarroja de 75 watts y una temperatura de 28
°C, toda la incubadora se cubrió con tela negra para evitar
quemaduras al personal de laboratorio.
Se dejó incubar toda una semana bajo estas condiciones para después
realizar un enriquecimiento del medio, este se hizo con 45 ml de
medio fresco y 5 ml del medio inoculado, se volvió a dejar una
semana mas de incubación bajo las mismas condiciones, al término
de la semana se criogenizaron los medios inoculados en glicerol del
20% esto con el fin de proteger la membrana para evitar la salida de
los electrolitos donde permanecieron 7 semanas.
Aislado en medio sólido
Posterior a la criogenización se realizarán nuevos medios de cultivo
para empezar la selección de morfotipos de colonia para, utilizando la
misma formulación del medio Val Niel posterior y agregando 0.04 M
de agar para 200 ml de medio, suficiente para 8 cajas petri.Las
sustancias se pesaron utilizando una balanza y utilizando un tubo de
ensayo de 100 mL para medir 200 mL de agua destilada, que luego se
transfirió a un matraz de 250 mL. Las sustancias previamente pesadas
se añadieron al matraz y se agitaron sobre una rejilla con agitador
magnético a una temperatura de 540 ºC y una velocidad de 1200 rpm.
Una vez obtenida una mezcla homogénea, se cubrió con gasa y un
tapón de algodón, marcándose como E1 y se esterilizó en autoclave.Se
preparó una solución de glucosa con una concentración de 1 g/mL en
20 mL. La solución se esterilizó de nuevo por filtración. Se introdujo
en una jeringa y se pasó a través de una membrana de poro de 0,20
micras. Después de sacar el medio del autoclave, se dejó enfriar. Y se
agregaron 200 μL de la solución de glucosa esterilizada y se verificó el
pH para asegurarse de que fuera neutro. Luego, la mezcla se vertió en
placas de Petri. Una vez solidificado el medio, dos placas de petri se
dividieron en tres secciones y se marcaron en consecuencia. Las
muestras se descongelaron y cada morfotipo distinto se aisló en la
sección correspondiente en función de su gremio. Cada muestra se
etiquetó como (E1QA, E1QB, E1QC, E1F1, E1FB, E1FC). El proceso
de aislamiento se realizó cerca de un mechero Bunsen para mantener
la esterilización. Los tubos de muestra y las placas de petri se abrieron
dentro del área esterilizada de una campana agregando 10 μL de cada
solución a los lugares designados en las placas de Petri utilizando un
asa de nicromo esterilizada, que se calentó en la llama del quemador
entre cada uso para evitar la contaminación. El mismo procedimiento
se repitió para las demás muestras (anexo figura 2 y figura 3). A
continuación, las cajas de petri se incubaron durante 48 horas a una
temperatura de 26 ºC, utilizando únicamente una fuente de luz
infrarroja como fuente de energía para los fotoheterótrofos.
Las placas de Petri que contenían muestras aisladas de diluido se incubó en hielo alrededor de 8 minutos para posteriormente
quimioheterótrofos se cubrieron con papel de aluminio.Ya que se mandar a centrifugar a velocidad máxima (14000 rpm) durante 2
observaron los primeros crecimientos bacterianos, se aislaron 2 minutos para lograr precipitar las proteínas y desechar el sobrenadante.
morfotipos por cada gremio. En las cajas petri se realizó una división a
la mitad, para contener 2 aislados en cada una de las caja petri Electroforesis
tratando de solo tomar una sola colonia comparando características de
la misma para lograr tener 2 colonias diferentes se etiquetaron (E1Q1
Una vez terminado la extracción de ADN, se tomó 3 µL del buffer de
Y E1Q2 para los quimioheterotrofos y E1F1/ E1F2 para los
carga con ayuda de una micropipeta donde se colocó en una “CINTA”
fotoheterotrofos) se llevaron a incubar alrededor de 2 días en las
y de igual manera se tomó la extracción de ADN 3 µL, en esta parte se
condiciones ya antes mencionadas (anexo figura 4 y 5). Para la
mezcló con la misma micropipeta el buffer y el ADN. Para preparar el
siguiente estría se volvieron a tomar colonias que ya estaban mucho
gel de agarosa se realizó en un matraz Erlenmeyer se agregó 1 g de
más aisladas que en el inicio, en este parte ya se aislaron con ayuda del
agarosa y 99 ml de agua, esta fue colocada en el microondas en un lapso
mechero y del el asa con la cual se tomo la colonia y en cada parte de la
de 30 segundos hasta lograr una mezcla homogénea pero evitando una
estría se fue esterilizando con el mechero evitando quemar las colonias
ebullición violenta, se colocó la bandeja en el caster gel y se giró la
en cada esterilización, ya para este punto se hizo el aislado de 3
palanca de levas cerrando herméticamente donde principalmente se
morfotipos por parte de los fotoheterotrofos y 2 quimioheterótrofos, ya
trató de nivelar antes de colocar la bandeja, después se agregar con
utilizando la caja petri completa , de igual manera se cubrieron los
cuidado la mezcla de agarosa/buffer caliente evitando hacer burbujas y
quimioheterótrofos y los fotoautótrofos no,se incubaron alrededor de 4
se colocó un peine en un extremo para dejar enfriar hasta polimerizar el
días aproximadamente.
gel, en cada pozo se colocó 3 µL de las muestras de ADN con buffer de
carga.

Tinción Gram-Positiva Y Gram-Negativas) 3.Resultados

Para la tinción fue necesario que el medio en el que se haría la misma
fuera lo más esteril posible, entonces fue necesaria la presencia de el Se lograron aislar adecuadamente 4 morfotipos, de los cuales 2 eran
mechero de Bunsen,en un portaobjetos fue colocada con ayuda de un heterótrofos y 2 quimioautótrofos, identificados con los siguientes
asa esterilizada una cantidad de 4 gotas de agua destilada parámetros: forma, tamaño, borde, elevación, superficie, color, luz
aproximadamente, después con la misma asa previamente esterilizada reflejada y luz transmitida, los cuales nos permiten describir a la colonia
con el mechero se hizo la toma de muestra de una colonia para poder (Tabla 2)
ser diluida sobre el agua colocada en el portaobjetos en el cual se
colocaron 2 muestras con un precia división a la mitad
((E1Q1,E1Q2,E1F1,E1F2 y E1F3), posteriormente se dejaron secar.Una
vez secas las muestras se les colocó cristal violeta y se dejó
aproximadamente 1 minuto, pasado este tiempo el exceso fue retirado,
a continuación se agregó lugol durante 1 minuto para después colocar
durante 10 segundos acetona, una vez terminado se colocó el colorante
de contraste, safranina, esperar 1 minuto y finalmente lavar con un
chorro de agua destilada el portaobjetos dejando secar.

Extracción de DNA

Para este punto de la extracción se seleccionaron los morfotipos de

bacterias para realizar la extracción de ADN donde se utilizó The
Wizard® Genomic DNA Purification Kit, las cuales ya estaban en
cultivos puros.(E1Q2, E1F2 Y E1F3)
Posteriormente de la selección, con ayuda de un asa de nicromo se
tomó un porcentaje de la colonia, esta masa fue colocada en cada uno
de los microtubos que contenían 480 µL de EDTA donde la masa se
Posteriormente la identificación por medio de la tinción de Gram, con
diluyó en forma de inmersión, ya disuelto se agregó 30 µL de la ayuda de los frotis observados en el microscopio óptico, permitió
solución lisis para poder romper los enlaces peptidoglicanos de las visualizar a las bacterias gram positivas (color azul-morado) y gram
bacterias,ya mezclado se realizó un Baño seco en el cual se mantuvo negativas (color rosa), además de otros parámetros como la forma y el
una temperatura de 37 °C durante 45 minutos en este lapso de tiempo arreglo (Tabla 3). Además, esta observación permitió identificar que
se tenía que hacer una mezcla por inmersión, después los microtubos varias bacterias habían desarrollado endosporas como mecanismos de
se centrifugaron en un lapso de 2 minutos aproximadamente, gracias a supervivencia, ocasionado por cuestiones de estrés ambiental como la
falta de nutrientes, agua o cambios de temperatura (anexo figura 10, 11,
esto el pellet fuera hacia abajo donde se desechó todo el sobrenadante
12, 13, 14, 15, 16 y 17).
quedando únicamente el precipitado en el cual se agregó 200µL de
solución de precipitación de proteínas y con ayuda en el vortex se
diluyó aproximadamente durante un minuto, ya perfectamente .

3
Tabla 3. Identificación de la morfología microscópica con ayuda de la
tinción de Gram en un microscopio óptico con el aumento 100x.Todos
los frotis fueron aislados de medios de cultivo Van Niel excepto por las
que presenta “*” son del medio LB.
Finalmente las muestras de DNA que se colocaron en el
fotodocumentador (color amarillo muestras de la etapa 1) en general
no corrieron mucho a traves del gel de agarosa debido a que se
introdujo todo el DNA de los microorganismos, siendo aun más pares
de bases “pesando” mas y dificultando su desplazamiento atravez del
gel. Sin embargo, para los pocillos en los que colocamos las muestras
de la etapa 1 (el dos E1Q1, el seis E1F2 y el diez E1F3) todos avanzaron
correctamente exceptuando el pocillo seis (E1F2) el cual podría haber
contenido muy poco DNA o no se colocó correctamente en el gel de
agar.
Figura 1. Visualización de DNA por electroforesis en gel de
agarosa al 1%
4
4.Discusión
Los resultados obtenidos en la morfología microscópica demostraron
que la mayoría de bacterias habían desarrollado endosporas porque las
células mostraban una apertura en la parte central o lateral, debido a que
los microorganismos son capaces de producirlas para resistir las
condiciones ambientales adversas. Estas condiciones pudieron surgir a
raíz del periodo prolongado de tiempo que se dejó desde la elaboración
de los frotis hasta su observación a microscopio, por lo que hubo
cambios en las condiciones del ambiente, por ejemplo; temperatura o
disponibilidad de nutrientes causando algún estrés sobre las bacterias.
Además, las bacterias aisladas mostraron una igualdad en el número de
Gram positivas y Gram negativas, en comparación a los resultados
obtenidos en la etapa cero donde la mayoría eran gram positivas
(comunicación personal), lo que nos puede indicar que hay más
bacterias resistentes a los antibióticos debido a que las condiciones de las
que provienen estos microorganismos, suelen estar en contacto directo
con estos compuestos porque son suministrados constantemente a los
animales de ganado con la finalidad de contrarrestar enfermedades y así
aumentar la productividad. Además, diversos artículos relacionados con
este tema mencionan que en muestras de rastro suelen encontrarse
organismos como; Escherichia coli verotoxigénica, bacteria gram
negativa productora de verotoxina, que provoca diarrea con sangre o
Salmonella spp, otra bacteria gram negativa que forma parte de
patógenos para personas y animales, ambas presentan alta resistencia a
estreptomicina, amoxicilina, amoxicilina-ácido clavulánico que son
antibióticos (Nwankwo et al 2022). Es por eso que la información
obtenida puede ser importante para un análisis de resistencia a los
antibióticos, lo que ayudaría a solucionar las problemáticas en el sector
salud a las cuales nos enfrentaremos en un futuro, para llevar a cabo
estrategias donde se busque reducir los efectos negativos que tendrán a
largo plazo estos microorganismos.
5.Conclusiones
Las comunidades bacterianas encontradas en las
muestras provenientes de lodos fueron iguales en proporción
encontrando el mismo número de bacterias gram negativas
y positivas, principalmente: Bacilos, encontrando 4 de cada
una de ellas. Es importante mencionar que este análisis
nos permitió identificar un actinobacteria el cual sale de lo
común de las bacterias ya que este forma filamentos
ramificados semejantes a los hongos, esto con la finalidad de
captar más nutrientes en un ambiente natural. Este es importante
ya que lo podríamos utilizar como productor de
compuestos bioactivos como antibióticos para su posterior uso
en ámbitos alimenticios, farmacéuticos o ambiental, en este
último por ejemplo en biorremediación, el cual es un tema
de especial interés en la licenciatura de Biología Ambiental.
 Bibliografía

Barrera, M., Mehrvar, M., Gilbride, K. A., McCarthy, L. H., Laursen, A.

E., Bostan, V., & Pushchak, R. (2012). Photolytic treatment of organic
constituents and bacterial pathogens in secondary effluent of synthetic
slaughterhouse wastewater. Chemical Engineering Research and
Design, 90(9), 1335-1350

Savin M, Bierbaum G, Hammerl JA, Heinemann C, Parcina M, Sib E,

Voigt A, Kreyenschmidt J. Antibiotic-resistant bacteria and
antimicrobial residues in wastewater and process water from German
pig slaughterhouses and their receiving municipal wastewater
treatment plants. Sci Total Environ. 2020 Jul 20;727:138788. doi:
10.1016/j.scitotenv.2020.138788. Epub 2020 Apr 19. PMID: 32498197.

Nwankwo, C. & Uzoigwe, Nnenna & Okpomor, Endurance &

Mbachiantim, James & Carew, Irene & Dereje, Belay & Teshome,
Abebe. (2023). Bacteriological quality of beef and antimicrobial
susceptibility profile of isolates from two regional slaughter houses in
Nigeria. 23. 2022.

Mata-De-la-Vega, J. F., Akizuki, S., Sakai, H. D., & Cuevas-Rodríguez,

G. (2022). Slaughterhouse wastewater treatment using purple
phototrophic bacteria: A comparison between photoheterotrophic and
chemoheterotrophic conditions. Biochemical Engineering Journal, 179,
108273.