Laboratorio N°5 Biología Celular

Integrantes del grupo: Alexandra Saavedra

Victoria Nitor
Antonia Osorio

Fecha de realización laboratorio: 20.06.2023

Fecha de Entrega Informe: 27.06.2023
Introducción

Las células no son estáticas, por lo tanto, no se mantienen iguales a lo largo del
tiempo. Estas entran en estados de división celular para originar dos células hijas
provenientes de una célula progenitora. En células eucariotas es posible apreciar
diferentes etapas durante la fase de mitosis, debido a que ocurren cambios en la
disposición del material genético, como la formación de cromosomas. Esto se debe
a que el material genético se reorganiza para distribuirse y poder repartirse de tal
forma que las células hijas tengan la misma cantidad de material genético. Por
ejemplo, en el proceso de mitosis al ocurrir una replicación del DNA y luego una
división celular, las 2 células hijas poseen la misma información genética de la célula
madre.
Además esta división celular al estar formada por etapas y procesos, se requiere de
un control para no generar fallos y producir divisiones celulares defectuosas, este
control se media por proteínas que actuarán como checkpoint durante el ciclo
celular, por lo tanto, si se reconoce una falla durante el ciclo, este se detendrá y no
continuará a la siguiente etapa.

Objetivo

El objetivo general que se planteó al inicio del laboratorio en el primer experimento

consistió en identificar las diferentes etapas del ciclo celular las cuales son profase,
metafase, anafase y telofase. Mientras que para la segunda actividad el objetivo
principal era determinar la concentración de proteínas en una muestra. Esto con dos
procedimientos diferentes.
Para llevar a cabo el objetivo general del experimento (1) se tuvieron distintos
objetivos específicos:
1) La capacidad de reconocer las características que se presentan en cada
etapa de la mitosis con respecto a las condiciones en las que se encontraba
la muestra realizada.
2) Observar la disposición o estado de los cromosomas para identificar la fase
en la que se encuentran.
Mientras que el segundo experimento con el método “ensayo de la mancha” tuvo
como objetivo específico:
1) Observar el diámetro de las manchas formadas por una gota de muestras a
distintas concentraciones y compararlas con dos diámetros de muestras
desconocidas.
En el experimento Bradford como objetivo específico fue:
1) Observar la absorción de luz que tienen las diferentes muestras a distintas
concentraciones y compararlas con dos muestras desconocidas.

Metodología

Se siguió la guía de trabajos prácticos 2023.

 Experimento 1: Mitosis

Figura 1. Raicilla de ajo teñida por orceína acética al 2% en ácido clorhídrico vista
en microscopio con aumento 400x.

Después de realizar el procedimiento a las raicillas de ajo se obtuvo que en una de

las muestras se lograba ver en un sector todas las etapas de la mitosis. Para poder
diferenciar en cual de estas se encontraba cada célula se observó la posición de los
cromosomas.
En profase los cromosomas se encuentran visibles en forma de hebras.
En metafase se puede ver como estos se alinean en el ecuador de la célula.
En anafase se observan a los cromosomas dirigiéndose a los polos.
En telofase hay dos conjuntos de cromosomas, uno en cada polo.
 Experimento 2: Método de Bradford

Para determinar la concentración de proteínas se utilizaron dos métodos, en esta

parte del trabajo se desarrolló el método de Bradford. Se utilizaron diferentes
concentraciones de proteína BSA y se midió la absorbancia en cada una de las
muestras para determinar la concentración de las muestras desconocidas. Sin
embargo, para poder determinar lo último y anteriormente mencionado se tuvo que
graficar una curva de calibración.

Para medir la concentración de proteínas se hace utilidad del reactivo de Bradford.

Este es un colorante que al unirse a una proteina reacciona generando un cambio
de color azulado, este suceso se observa desde el tubo N°8 al tubo N°15 y se
concluye que estos tubos tienen una mayor concentracion de proteinas en su
solucion debido a la coloracion de la muestra (azulada) en comparacion con los
tubos con tonalidad clara (menor concentracion). Además, a partir de esto se
establece que existe una proporción directa con respecto a la concentración de
proteínas y la tonalidad o coloración que toma la muestra debido a que en mayor
concentración el color se vuelve azul. Asimismo, se observa que desde el tubo N°1
al tubo N°7 se mantienen de un color claro, por lo tanto, se deduce que estos tubos
tienen menor concentración de proteínas.

A Continuación, se midió la absorbancia en los distintos tubos y se graficó para

determinar la concentración de las dos muestras desconocidas.

ul BSA
Tubo N° 0,2 mg/mL A 595
1 0 0
2 10 0,016
3 10 0,021
4 30 0,028
5 30 0,028
6 50 0,031
7 50 0,033
8 70 0,036
9 70 0,035
10 90 0,036
11 90 0,035
12 - 0,036
13 - 0,036
 14 - 0,032
15 - 0,031

Tabla 1. Se presentan las cantidades de solución de proteínas y la absorbancia que

presenta cada una de ellas. Tomadas con espectrofotómetro.

A partir de los resultados obtenidos al medir la absorción con ayuda del

espectrofotómetro se concluye que la absorbancia aumentará mediante la
concentración de proteínas que se encuentren en los tubos, esto debido a que los
datos que resultaron del espectrómetro iban en aumento a partir del tubo 8 en
adelante.

Gráfico 1. Curva de calibración obtenida a partir de resultados promediados de los

duplicados de absorbancia a 595 nm en función de la concentración de la proteína
BSA.

Dando como resultado que aunque no se sabía la concentración de los tubos 12 al

tubo 15 si se pudo determinar la absorbancia en estos tubos, por lo que, se deduce
que el tubo 12 y 13 tienen una concentración entre 70 y 90 debido a que si se
comparan estas soluciones tiene una absorbancia similar. Mientras, que para los
tubos 14 y 15 si se sigue el mismo análisis, entonces, se determina que tiene una
concentración de 50.

Experimento 2: Ensayo de la mancha

Luego de preparar las soluciones, se dispuso dos soluciones de concentración
desconocida, estas fueron M1 Y M9. Después de esto se siguió con el
procedimiento de acuerdo a la guía. Las soluciones preparadas corresponden a la
solución A) 3 mg/ml ; B) 1 mg/ml; C) 0,5 mg/ml; D) 0,3 mg/ml; E) 0,1 mg/ml; F)
0,05mg/ml. Una vez dispuestas las soluciones preparadas y las soluciones
desconocidas se obtuvo lo siguiente en el papel filtro:

Figura 2. Resultados del experimento de la mancha duplicados.

Obtenido esto, se observa que el tamaño de la mancha depende de la

concentración, ya que la mancha dejada por la solución A) posee mayor diámetro, la
cual posee mayor concentración que las demás preparadas. Mientras que la
mancha dejada por la solución F) es la de menor diámetro, solución que posee
menor concentración, por lo que, debido a esto podemos saber si las soluciones de
concentraciones desconocidas poseen una concentración mayor o menor a las que
ya conocemos.
Figura 2. Orden por longitud de diametro dejada por las soluciones

La solución M1 posee un diámetro mayor que todas las demás manchas. Si

tenemos esto presente y recordamos que el diámetro depende de la concentración,
podemos decir que la concentración de M1 es mayor a la concentración de la
solución A). Por otro lado, el diámetro de la mancha dejada por M9, parece estar
entre las soluciones preparadas, debido a que su diámetro es menor a la solución A)
pero mayor que la de la solución F), por lo que, comparando sus diámetros con las
soluciones que están entre A y F, podemos decir que este aparenta encontrarse
entre C y D. Con esto, se concluye que
la concentración de M1 > concentración solución A
concentracion solucion C ＞ concentracion M9 > concentración solucion D.

∴ M1＞ 3 mg/ml (A) ＞ 0,5 mg/ml(C) ＞M9 ＞ 0,3 mg/ml(D)

 Preguntas respecto al laboratorio N°5

1) Explique brevemente las fases G0, G1, S, G2 y M del ciclo celular.

En la interfase ocurre
● G1 donde la célula crece de tamaño
● S: donde ocurre la síntesis de ADN, duplicando cromosomas
● G2: la célula sintetiza proteínas y se prepara para entrar a Fase M

La Fase M, corresponde a la organización de los cromosomas y su correcta

disposición en el citosol de la célula para que ocurra una correcta división celular,
para originar a las células hijas. Por lo que acá ocurre una mitosis o meiosis y luego
la citoquinesis.

2) ¿Qué entiende Ud. por “checkpoint” durante el ciclo celular?

Los checkpoint corresponden a un tipo de control del ciclo celular, actuando como
un sensor, donde una etapa no puede ocurrir si el proceso anterior no finaliza o se
realiza de manera correcta.
Es decir que estos checkpoints permiten o no, seguir a la célula en el ciclo celular,
dada las condiciones que esta presenta.

3) ¿La participación de qué tipo(s) de enzimas (ej. ATPasa, fosfatasas, etc…)

¿Le parece a Ud. ¿Son de gran importancia durante el ciclo celular? ¿Por qué?
El ciclo celular posee un sistema de control, el cual se regula por Cdk dependiendo
de ciclina; donde estas se activan para actuar como sensor durante las diversas
partes del ciclo celular. La CDK debe ser fosforilada por una quinasa, pero esta
fosforila 2 sitios, uno de los cuales actúa como inhibidor, impidiendo la formación del
complejo Cdk- ciclina y por esto debe actuar un FOSFATASA, la cual va a
desfosforilar este sitio y dejando un solo grupo fosfato en la Cdk por lo cual se
forma el del complejo Cdk-ciclina, es decir su forma activa. Además una enzima
importante es la APC, ya que se encarga de la ubiquitinación de complejos, donde
estos al poseer esta marca, son llevadas para que sea degradadas, bajando así la
concentración de estos, indicando que se pueda iniciar la siguiente etapa.
Por la que las quinasas, fosfatasas y apc son enzimas muy importante en el ciclo
celular encargándose de la regulación, sin estas enzimas las células no podrían
entrar al ciclo, quedando un número limitado de enzimas o estar en un ciclo infinito
aumentando la probabilidad de tener daños irreparables ya que sin el SCCC la
célula seguirá su división, presentando errores, causando una proliferación de
células dañadas, porque lo que estas células generan cáncer a los individuos ya que
estas no sufrirán una apoptosis regulada.
4) ¿Por qué es necesario fijar y teñir las células de la raíz antes de hacer la
observación?
Al pasar por un proceso de tinción, se genera un mayor contraste para la
observación en el microscopio, esto debido a que por ejemplo en el caso de la
orceína acética que tiene una afinidad por el ADN y en este caso por los
cromosomas, se une a la carga negativa (grupo fosfato), logrando que a la hora de
observar se torne de una tinción más oscura, evidenciando el orden que los
cromosomas toman y por ende la etapa del ciclo celular que se encuentran. La
fijación por otro lado sirve para mantener la integridad de la raicilla con la que se
trabaja.

5) ¿Qué sabe Ud. acerca de la razón por la cual, en un mismo tejido, algunas
células entran en mitosis y otras no?
Las células para poder dividirse deben recibir señales que activan este proceso, uno
de estos son los mitógenos que estimulan la división celular que desencadenan
actividad Cdk. Estas suelen venir de células vecinas, por esta razón se encuentran
varías en proceso de mitosis en la misma zona, sin embargo existen proteínas
inhibidoras de la progresión del ciclo celular en la fase G1, quedando en un fase
estacionaria como lo es la fase G0, esta en células como de tejidos de la piel suelen
ser fases de poco tiempo, al contrario de neuronas o fibras musculares que quedan
siempre en esta fase. El que no se dividan todas al mismo tiempo favorece la
mantención de un tejido.

6) ¿Cómo es el huso mitótico en las células vegetales? ¿Qué otras diferencias

hay entre la mitosis de células animales y vegetales?
El huso mitótico el cual está formado por microtúbulos en las células eucariotas
permite la segregación de los cromosomas, este separa las cromátidas hermanas
en la etapa anafase, en donde finalmente se segregan para formar dos núcleos
hijos. La principal diferencia del huso mitótico en las células vegetales es que no
poseen un centrosoma, el cual en las células animales sí está presente. Este
complejo proteico orienta cada polo del huso, en donde el polo de un crecimiento
mayor se encuentra proyectado hacia fuera, mientras que el polo con un menor
crecimiento se encuentra proyectado hacia el centrosoma, también se encuentran
las proteínas motoras de microtúbulos y reguladores del control del ciclo celular, sin
embargo en las células vegetales las proteínas asociadas a los extremos menos
organizan y orientan los microtúbulos dentro de la célula.
Otra diferencia en el ciclo celular en la células vegetales y animales es la citocinesis,
en donde en la primera nombrada en este proceso las células se encuentra rodeada
de la pared celular, y el citoplasma se divide de dentro hacia fuera por una nueva
pared celular construida (placa celular). Para generar esta placa celular hay una
acumulación de vesículas formadas desde el aparato de Golgi hacia el centro de la
célula. Mientras que para las células animales la división en dos células hijas
depende del anillo contráctil, que separa el citoplasma desde fuera hacia dentro.
7) ¿Cuál es el sentido del tubo “blanco” en el ensayo de Bradford?
El tubo blanco sirvió para calibrar el espectrofotómetro y tener un valor estándar,
esto para que no haya un gran margen de error en las mediciones y resulte un valor
determinado y con la menor diferencia entre datos para cada solución que se realizó
en la medición de absorbancia.

8) ¿Se necesita una muestra “blanco” en el ensayo de mancha?; explique sus

razones. Si lo considera necesario, ¿cómo la prepararía?
Probablemente se necesite una muestra blanco para el ensayo de la mancha puesto
que al realizar el experimento se debe calibrar la pipeta para que esta tenga la
cantidad precisa de solución que se necesite para llevar a cabo el experimento
debido a que si las pipetas que se utilizan no están calibradas pueden provocar un
margen de error en los resultados obtenidos, por lo que, si se realiza una muestra
blanco se puede evitar lo mencionado. En su preparación, tendría en un vaso
precipitado una cantidad de agua destilada o alguna sustancia que permita la
calibración de la pipeta, para así poder absorber el líquido y en otro vaso vería si la
cantidad de líquido que se absorbió y expulsó de la pipeta es el mismo.

9) Averigüe sobre otros métodos para determinar concentración de proteínas

y compare sus ventajas y desventajas con los que Ud. usó en este trabajo
práctico.
Existen diferentes métodos de cuantificación de proteínas presentes en una
muestra, la primera es el método de Bradford que consiste en la unión de la proteína
con la tinción logrando que esta se vuelva de un color azul, cuya intensidad
dependerá de la concentración de las proteínas. Su ventaja es ser un método fácil y
compatible con agentes reductores que ayudan a estabilizar a las proteínas en la
solución pero su desventaja resulta en ser incompatible con detergentes y no logra
detectar a todas las proteínas. La segunda es el ensayo de Lowry, su ventaja es ser
un método preciso, por lo tanto, se relaciona con que es un mecanismo sensible a la
cuantificación de proteínas, mientras que tiene como desventaja ser incompatible
con algunos reactivos químicos como los carbohidratos y el DDT. El tercer método
es el de ácido bicinconínico su ventaja es que reacciona en proteínas que tengan >
5% de detergentes o de agentes desnaturalizantes, pero tiene la desventaja de que
se necesita ser cuidado al momento de analizar los datos de absorción debido a que
el color no se mantiene en el tiempo. El cuarto método es el de Biuret el cual se
caracteriza por reaccionar eficientemente, su ventaja es ser un método rápido y
simple. Sin embargo, es poco sensible. Por último, el método de absorción
ultravioleta es un método rápido pero no se considera tan sensible, además, de que
no es un método que solamente se caracteriza por trabajar con las proteínas, es
incompatible con la extracción de proteínas de agentes desnaturalizantes. Sin
embargo, a pesar de que los métodos para la cuantificación de proteínas sean
diferentes y tengan sus defectos/ desventajas, al poder trabajar con el método de
bradford se reconocieron características similares que se encuentran entre los
distintos métodos investigados, algunos de estos eran que tienen la misma forma de
evaluar los resultados que se obtienen para determinar la concentración de
proteínas en las soluciones a través de la absorbancia, pero a pesar de ello no
todos los métodos son efectivos debido a que cada uno tiene cualidades necesarias
para determinados experimentos.

Discusión de resultados

En el primer experimento sobre la Mitosis se observa que los cromosomas teñidos

se encuentran diferenciados en cada etapa del ciclo celular, cambiando sus
disposiciones dentro de la célula, no solo se denota un cambio dentro de la célula,
sino que se observó que si hay una célula que entra en mitosis alrededor se
encuentran otras también en diferentes etapas de división, lo cual infiere una directa
relación en donde si una célula comienza a dividirse induce a otras a entrar en
mitosis, lo cual confirma la información teórica consultada en donde una señal
extracelular estimuladoras (mitógenos) genera que las células vecinas reciben esta
señal induciendo también el ciclo celular.

En el segundo experimento se utilizó el método de Bradford para la cuantificación de

proteínas, con los resultados obtenidos se logró identificar que concentraciones de
proteínas pueden tener las dos muestras desconocidas. Sin embargo, para ellos fue
de gran utilidad el uso de la curva de calibración debido a que se observa con mejor
capacidad el aumento en las absorbancias de las soluciones y que esta es
proporcional a la concentración que tienen los diferentes tubos. Por lo que, se
entiende que si hay una menor concentración de proteínas en la muestra, entonces,
la absorbancia tendrá un valor menor, además, de la tonalidad clara de la solución,
en cambio si el tubo está compuesto por una concentración de proteínas mayor
tendrá una tonalidad azul y su absorbancia resultará en un valor mayor, por lo tanto
la curvatura de calibración deberá ir en aumento.

Para los resultados del experimentos de la mancha, al ser un experimento

cualitativo es más probable cometer errores, ya que las gotas que se dispusieron en
el papel filtro eran de 2 micrólitros, debido al pequeño volumen de estas resultaba
más difícil la manipulación de la pipeta, al ser de tan pequeño tamaño las gotas a
veces se quedaban en la boquilla de esta, lo cual inducía a un error del volumen
requerido, haciendo que cambie el radio de la mancha dejada por la solución. Sin
embargo, se trató de realizar lo mejor posible el experimento para no tener errores
graves que llevan a resultados poco exactos a la hora de comparar, por lo que, al
realizar dos veces el experimento se llegó a un resultado más preciso, ya que se
observan de un tamaño similar las manchas de una misma solución.
Cuando se compararon las manchas dejadas por las soluciones que sabiamos su
concentración nos indico claramente que el diametro tiene una relación directa con
la concentración de esta, y al usar las muestras de concentracion desconocida y
analizar si poseian una mayor o menor concentracion que las soluciones preparadas
se observo que M1＞ 3 mg/ml (A) ＞ 0,5 mg/ml(C) ＞M9 ＞ 0,3 mg/ml(D). Sin
embargo, quizás puede haber una forma de relacionar las concentraciones
matemáticamente mediante una curva de calibración donde se compare la
concentración con el diámetro, para poder hacer un interpolación o extrapolación de
los resultados para así obtener una concentración exacta de las muestras de
concentración desconocida.
Conclusión

Tenemos que recordar que las proteínas son numerosas y variadas en los seres
vivos y que existen muchos métodos que nos permiten una cuantificación de
proteínas, pero a pesar de ello se trabajó con el método de Bradford y dotbot
agregando distintas concentraciones de soluciones para determinar con mayor
facilidad nuestro objetivo y poder identificar las concentraciones desconocidas.

En el experimento de Bradford se usa un colorante (ácido) en las proteínas

causando la unión y formación de un complejo proteína- colorante. Además, debido
a que no es un experimento que dañe a la proteína nos permitió una observación y
análisis simple para llegar a una conclusión. Para el experimento fue posible
descubrir la concentración de las proteínas desconocidas en una solución,
basándonos en la absorbancia de cada solución. Los colorantes utilizados en el
método de Bradford reaccionan principalmente con residuos de arginina y, en menor
medida, con residuos de histidina, lisina, tirosina, triptófano y fenilalanina.
Claramente, la prueba es menos precisa para proteínas básicas o ácidas, por lo
que, nos indica un punto débil en este tipo de cuantificación.

Para el Ensayo de la mancha permite realizar detección de proteína en

micromuestras acuosas (gotas), así como en muestras disueltas directamente en
tampón. Además, el método del ensayo de la mancha solo nos indica de manera
cualitativa la concentración de proteínas, ya que mediante observación podemos
decir donde hay mayor o menor concentración de proteínas, por lo que, no tenemos
un respaldo cuantitativo de este experimento. Entonces, con estos experimentos fue
posible descubrir la concentración de las proteínas desconocidas en una solución.

Se concluye que ambos experimentos poseen limitaciones debido a que por uno
solo se indica para pequeños volúmenes, mientras que el otro no puede usarse con
todas las proteínas, y como existen muchas proteínas con diferentes propiedades
existen métodos específicos dependiendo del propósito que se necesite. Por otro
lado, en el experimento de la mitosis se concluye que la utilización de una tinción y
procedimiento óptimo antes de observar la célula es esencial para la observación de
este, ya que si existe un error en un paso del proceso de preparación, se dificulta la
observación. También, se logra ver de manera experimental que la células cuando
se encuentran en mitosis sus cromosomas se posicionan de diferente manera y que
si se encuentra una célula en división es probable que alrededor se encuentren más
células en este ciclo.
 Referencias

„ ”. (n.d.). „ ” - Wiktionary. Retrieved June 26, 2023, from

https://docs.google.com/document/d/11nO1OEMZtWiOD8nV1sMd0gciA_NObiq9ioZ

7ISUveRs/edit

Alberts. A, Jhonson. A, Lewis.J, Morgan. D, Raff. M, Roberts.K, Walter.P. 6a

edición (6 Octubre 2016) “Biología molecular de la célula”.(capítulo 17 “ciclo celular”)
Ediciones omega.

Abyntek. ( 2 de enero de 2023). 5 métodos para cuantificar proteínas. 5 métodos

para cuantificar proteínas - Abyntek Biopharma