DEPARTAMENTO DE QUIMICA TECNICA

UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA

APUNTES
DE
INGENIERIA BIOOUIMICA

FEDERICO DIAZ RODRIGUEZ

FRANCisco JARABO FRIEDRICH
DELIA GARCIA CRUZ
------~-------------- -- ---------------- --------------------
 PROLOGO

Estos Apuntes son el resultado de las explicaciones impartidas a los alumnos

de 5º Curso de la Especialidad "Química Industrial" durante varios años. Pretenden

dejar constancia de un trabajo que se ha desarrollado, pero al que aún le queda

mucho camino para completarse, especialmente en lo referente a problemas numé-

ricos, donde se proyecta ir elaborando la colección correspondiente para completar

cada Capítulo. Asimismo, es deseo de los autores complementar el trabajo con un

Manual de Prácticas de Laboratorio. Estos objetivos se esperan alcanzar más ade-

lante.

Queremos agradecer la colaboración de muchos miembros del Departamento,

y en especial, la extraordinaria contribución al desarrollo previo de estos Apuntes

debida al Prof. Dr. D. Fernando Camacho Rubio, Catedrático de Química Técnica

de la Uni_versidad de Granada, durante su fructífera labor al frente del Opto. de

Química Técnica de la Universidad de La Laguna ( 1970-1976).

También hemos de destacar el importante papel que han jugado las diversas

aportaciones de varias promociones de alumnos y hacer constar, en esta misma lí-

nea, que cualquier indicación o sugerencia para corregir errores y, en definitiva,

mejorar el trabajo, sería siempre bien acogida y, por supuesto, agradecida.

La Laguna, Octubre de 1985.

 INGENIERIA BIOQUIM ICA
Dt:PARTAMENTO DI: OUIMICA TitCNICA
Curso 1986/87
P'ACULTAD DE QUIMICA

UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA PROGRAMA

TENERIFE - ESPAÑA

Tema 1.- INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA INGENIERIA BIOQUIMICA

Concepto de Ingeniería Bioquímica. Procesos de fermentación. Industria alimentaria.
Tendencias futuras en el campo de la fermentación.

Tema 2.- LA ENERGIA EN LOS SISTEMAS BIOLOGICOS

Introducción. Concepto de energía libre. La constante de equi 1ibrio. Cambio de
energTa libre en las reacciones bioquímicas. Reacciones acopladas.

Tema 3.- AISLAMIENTO Y UTILIZACION DE ENZIMAS

Extracción de glándulas animales. Enzimas procedentes de vegetales. Enzimas mi-
crobianas. Purificación de enzimas.

Tema 4.- CINETICA DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

Dependencia de la velocidad de reacción con la concentración: ecuación de M ichae-
lis-Menten. Presencia de dos sustratos. Inhibición de las reacciones enzimáticas. In-
fluencia del pH y de la temperatura sobre la velocidad de reacción.

Tema 5.- REACTORES ENZIMATICOS

Tipos de reactores. Ecuaciones de diseño de reactores enzimáticos ideales. Reacto-
res enzi máticos con inhibición.

Tema 6.- ENZIMAS INMOVILIZADAS

Generalidades. Métodos de inmovilización. Efectos de la inmovilización.

Tema 7.- MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

Generalidades. Composición química. Condiciones para el desarrollo y formulación
del medio. Reproducción de los microorganismos. Variaciones en los microorganismos.

Tema 8.- CINETICA DE LA FERMENTACION

Métodos de medida del crecimiento microbiano. Cinética del crecimiento celular.
Crecimiento celular y rendimiento. El modelo de Monod. Influencia de algunas ca-
racterísticas del medio. Tipos de fermentaciones.

Tema 9.- TIPOS DE FERMENTADORES

Introducción. Fermentadores agitados. Fermentadores tubulares.

.../ ...
 DI<PARTAMitHTO DI: QUIMICA TtCHICA
FACULTAD DE OUIMICA

UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA
TI!NERIFE - ESPAÑA

... / ...
Tema 10.- DISEÑO DE REACTORES BIOLOGICOS. l.
Sistema de tanque único. Sistema de tanques en serie. Tanque único con recircula-
ción. Fermentador tubular flujo de pistón.

Tema 11.- DISEÑO DE REACTORES BIOLOGICOS. 11.

Métodos gráficos. Dinámica del quimostato. Comparación entre la fermentación con-
tinua y la fermentación por cargas.

Tema 12.- ESTERILIZACION

Métodos de esterilización. Cinética de la esterilización por calor: muerte térmica
de los microorganismos. Efecto de la temperatura sobre los constituyentes del me-
dio. Influencia del pH en la muerte térmica. Diseño en esterilización. Esterilización
por cargas. Esterilización contlnua.

Tema 13.- AIREACION Y AGITACION EN FERMENTADORES

Transferencia de materia y respiración microbiana. Velocidades metabólicas de uti-
lización de oxigeno: concentraciones criticas. Diseño de un reactor biológico aerobio.
Determinación experimental del coeficiente de transferencia de materia referido a
oxígeno.

BIBLIOGRAFIA

AlBA, S. y cols.¡ "Biochemical Engineering", 2i ed., Academic Press, New

York (1973).
ATKINSON, B.; "Biochemical Reactors", Academic Press, London (1974).
BAILEY, J.E. y OLLIS, D.F.; "Biochemical Engineering Fundamentals", Mc-
Graw Hill, New York (1977).
LEHNINGER, A.L.¡ 'Bioquímica", 2ª ed., Ediciones Omega, Barcelona (1979).
QUINTERO, R. R.¡ "Ingeniería Bioquímica", Alhambra, México (1981 ).
SIMON, P. y MEUNIER, R.; "Microbiologie lndustrielle et Genie Biochimique",
Masson, París (1970).
WANG, D.I.C. y cols.¡ "Fermentation and Enzyme· Technology", John WiJey
and Sons, New York (1979).
WEBB, F.C.¡ "Ingeniería Bioqufmica", Acribia, Zaragoza (1966).
 TEMARIO

TEMA 1.- INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA INGENIERIA BIOQUIMICA

TEMA 2.- MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

TEMA 3.- LA ENERGIA EN LOS SISTEMAS BIOLOGICOS

TEMA 4.- CINETICA DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

TEMA 5.- CINETICA DE LA FERMENTACION. MODELOS

TEMA 6.- ESTERILIZACION

TEMA 7.- TIPOS DE FERMENTADORES

TEMA 8.- DISEÑO DE REACTORES BIOLOGICOS.

TEMA 9.- DISEÑO DE REACTORES BIOLOGICOS. 11

TEMA 10.- AISLAMIENTO Y UTILIZACION DE ENZIMAS

~

TEMA 11.- ENZIMAS INMOVILIZADAS

TEMA 12.- REACTORES ENZIMATICOS

,-------~~-------
 TEMA 1
INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA INGENIERIA BIOOUIMICA
 INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA INGENIERIA BIOQUIMICA

GENERALIDADES

Se han publicado muchas definiciones de la Ingeniería Bioquímica, que ha na-

cido como consecuencia de una relación interdisciplinar entre la Bioquímica, la Mi-

crobiología y la Ingeniería Química. Según Aiba, "la Ingeniería Bioquímica es aquella

actividad que tiene como objetivo el procesamiento económico de materiales de ori-

gen biológico para lograr un fin útil. La función del ingeniero bioquímico es aplicar

a la práctica los conocimientos del microbiólogo y del bioquímico. Para ello no sólo

es necesario el conocimiento de los principios básicos de la ingeniería, sino también

conocer las ciencias biológicas".

Pormenorizando algo más, se puede decir que el objetivo de la Ingeniería

Bioquímica es la investigación, desarrollo, diseño, construcción y funcionamiento de

aquellas instalaciones que utilizan materiales biológicos o realizan procesos biológi,...

cos de transformación.

En ocasiones se han de aplicar estos conocimientos a favorecer el desarrollo

de procesos vitales y en otras, a destruirlos.

Los procesos realizados pueden suponer la existencia de transformaciones quí-

micas, como es el caso de las fermentaciones o bien, tratamientos físicos para con-

servar materiales biológicos, como ocurre en la industria alimentaria; por ello, algu:.

nos autores consideran que se podría dividir el estudio de la Ingeniería Bioquímica

en dos grandes apartados o bloques:

a) Tecnología de la fermentación

b) Tecnología de los alimentos

estando ambos muy relacionados entre sí, con un gran número de puntos comunes.
PROCESOS DE FERMENT ACION

Si bien la palabra "fermentación", que da idea de burbujeo. o ebullición, surge

para designar la primera reacción industrial de este tipo utilizada por el hombre,

la fabricación del vino, hoy día se tiende a emplear este término en su sentido más

amplio para designar los cambios químicos producidos en compuestos orgánicos o

inorgánicos (sustratos) por la acción de enzimas, tanto si éstas son producidas y uti-

lizadas por microorganismos ("in vivo"), como si son enzimas libres aisladas ("in vi-

tro"). La fermentación puede ser aerobia, si exige poner a disposición de los micro-

organismos el aire, donde el oxígeno juega el papel de aceptor de hidrógeno. En

cambio, en la otra clase, la fermentación anaerobia, el oxígeno atmosférico no in-

terviene, siendo otras sustancias (tales como el ácido pirúvico) las que actúan como

aceptores de hidrógeno.

Desde hace mucho tiempo, el hombre conoció que la carne que se dejaba

unos días después de sacrificar a un animal, era más agradable al paladar que

cuando se ingería inmediatamente después del sacrificio. También conoció que se

podían obtener bebidas "intoxicantes" de granos y de frutos. La maduración de la

carne y la manufactura de bebidas alcohólicas fueron los primeros usos que el hom-

bre hizo de la fermentación; ahora bien, les atribuía un cierto carácter místico, ya

que no conocía la existencia de los microorganismos que las producían. Más tarde,

trabaja la fermentación de la leche para obtener quesos, yogurt, etc., y la obten-

ción del pan.

En la Edad Media, el hombre aprendió a perfeccionar el sabor del vino, pan,

cerveza y queso. Todavía, después de miles de años de experiencia, no se había da-

do cuenta que en las fermentaciones estaba tratando con una forma de vida. Este

desconocimiento se prolongó hasta después de la mitad del siglo XIX.

En 1857, Pasteur probó que la fermentación alcohólica estaba producida por

levaduras, siendo éstas células vivas. Además, demostró que ciertas enfermedades

eran causadas por microorganismos, lo que marcó una pauta crucial en la historia

de la Medicina, y el nacimiento de la Microbiología.

 Los microorganismos puestos en un medio adecuado crecen y se reproducen

("producción de biomasa"), al mismo tiempo que consumen sustratos y producen

compuestos bioqufmicos más o menos complejos, resultado de su metabolismo. Por

tanto, la finalidad de un proceso de fermentación en el que intervengan microorga-

nismos puede ser una de las tres siguientes:

a) Producción de biomasa:

Aunque la mayor parte de los procesos de fermentación comercial tienen co-

mo finalidad la obtención de compuestos producidos como consecuencia del desarro-

llo celular, un ejemplo ilustrativo de la producción de biomasa es la fabricación de

la levadura de panaderfa y, en general, la biomasa producida en cualquier proceso

de fermentación debe considerarse cor:no un subproducto valioso para la alimentación

animal o humana por su contenido en protefnas.

b) Eliminación de sustratos:

Este tipo de procesos deben ser, evidentemente, menos frecuentes, si bien

el tratamiento biológico de las aguas residuales que contienen materia orgánica es

un claro ejemplo de los mismos. En este caso, el objetivo principal perseguido es

la eliminación de los compuestos orgánicos presentes en el agua, procurándose tam-

bién que la producción de biomasa (constituyente importante de los lodos residuales

que plantean un problema dificil de eliminación) sea mfnima.

e) Producción de compuestos:

Es ésta, con mucho, la finalidad más importante de los procesos de fermen-

tación, citándose a continuación algunos de los grupos de productos más importantes

que se obtienen mediante procesos fermentativos.

1) Antibióticos:

Hoy día se obtienen más de 100 antibióticos por fermentación para las

industrias farmacéutica, química y de alimentación, fundamentalmente peni-

cilina, estreptomicina y derivados, que representan el 60 % de la producción

de la industria farmacéutica de antibióticos.

2) Esteroides:

Una aplicación reciente de los pr.ocesos de fermentaci6n es la trans-

formación de esteroides: introducción de grupos oxhidrilo en determinadas po-

siciones, deshidrogenaci6n e hidr6lisis de ciertos enlaces, etc., para las cuales

los métodos quimicos no son adecuados debido ~ la fabilidad de estas molécu-

las.

3) Vitaminas y factores de crecimiento:

Algunas vitaminas del grupo B (riboflavina, B y cianocobalamina, B )

2 12
y factores de crecimiento, como la giberelina, se producen hoy dia comer-

cialmente por procesos de fermentación, y se utilizan fundamentalmente en

la industria farmacéutica y en la alimentaci6n animal.

4) Acidos organicos y disolventes:

Los §.cidos org§.nicos, como el dtrico, l§.ctico, glut§.mico, isoascórbico

y gluc6nico, se obtienen actualmente por procesos de fermentación, y si bien

en el caso de las moléculas m§.s simples como etanol, §.cido acético, aceto-

na, butanol y propanol, los procesos de fermentación han sido desplazados por

las sintesis quimicas de origen petroleoquimico, es posible que este desplaza-

miento pueda invertirse en algunos casos, dada la escasez creciente de los

productos derivados del petr6leo.

5) Enzimas:

Las enzimas libres que se utilizan en algunas aplicaciones industriales

son recuperadas de microorganismos en los que se induce su formación me-

diante estimulas fisicos o quimicos adecuados, aunque en algunas ocasiones

se separan de tejidos animales o vegetales en los que se encuentran en pro-

porción apreciable.

En general, son enzimas extracelulares que atraviesan la pared celular

y pasan al medio nutriente del que se separan posteriormente, aunque en al-

gunos casos no es asi, y se requieren procedimientos mec§.nicos y quimicos

de destrucción de las membranas celulares para su aislamiento. Dadas las di-

 ficultades de su separaci6n en grado de pureza. ·adecuado y a su extraordina-

ria labilidad, las aplicaciones actuales de las enzimas libres son todavía esca-

sas y se limitan a tratamientos auxiliares para mejorar la calidad o la pre-

sentaci6n de algunos productos. La mayor parte de ellas se usan con fines

de mejoramiento de los alimentos, clarificaci6n de bebidas, tratamiento de

materiales textiles o pieles, como agentes analíticos y en la industria farma-

céutica.

Otra dificultad importante para su empleo en mayor escala consiste

en su separaci6n una vez usadas, dadas las pequeñas cantidades empleadas

y su solubilidad en agua. Solamente las amilasas, pectinasas, proteasas y ce-

lulasas se obtienen en cantidades de tonelaje; las restantes enzimas comer-

ciales suelen producirse en muy pequeñas cantidades.

INDUSTRIA ALIMENTARIA

Se incluyen bajo esta denominaci6n las instalaciones industriales que utilizan

materiales biol6gicos con vistas a la producci6n de alimentos para el hombre y los

animales. La inclusi6n de estos últimos implica considerar a las fábricas de piensos

como parte de la industria alimentaria, lo que indudablemente es conveniente, no

s6lo porque utilizan operaciones y procesos semejantes a las industrias de elabora-

ci6n de alimentos para el hombre, sino porque generalmente emplean como materias

primas subproductos de estas últimas y los piensos deben considerarse como produc-

tos intermedios con vistas a la alimentaci6n humana.

Algunas ramas de la industria alimentaria están directamente vinculadas a

la producci6n agrícola y ganadera, y tienen como finalidad la conservaci6n de los

productos perecederos de estas, para que puedan ser transportados, almacenados y

consumidos en todas partes y en cualquier época del año. Sin embargo, gran parte

de la industria alimentaria se abastece actualmente con materiales no perecederos

transportados desde lugares lejanos, siendo muchos de ellos productos intermedios

comprados a otros elaboradores, como, por ejemplo, productos panificables, jarabes,

mermeladas y jaleas, condimentos, alimentos infantiles, etc.

Si bien la industria alimentaria fue en su origen un conglomerado de indus-

trias independientes, no relacionadas, basadas en la agricultura, la ganaderla y la

pesca, actualmente en los paises desarrollados se consider~n como una industria úni-

.§ ya que tiene los mismos objetivos y problemas, las mismas técnicas, una regla-

mentaci6n común y métodos de envasado y comercializaci6n an§.logos.

La elaboraci6n de alimentos comprende, por lo general, varias fases: una vez

recibida la materia prima, se limpia, clasifica y separa de la parte no aprovechable

de la misma, se corta o muele, se mezcla con otros ingredientes alimentarios y

aditivos qulmicos, se le da la forma y el tamaño deseados y se envasa. También

'
se somete a un tratamiento térmico, de refrigeraci6n o de deshidrataci6n. En algu-

nos casos se la somete adem§.s a un proceso de fermentaci6n, ahumado, curado o

extracci6n. Hoy dla se trata de una de las industrias m§.s automatizadas, lo que

viene determinado en gran parte por la asepsia necesaria en todas las etapas de

la fabriaci6n. Por otra parte, el control de calidad de los productos fabricados re-

quiere gran atenci6n y suele estar sometido a normas legales muy exigentes.

Puesto que la producci6n de alimentos en nuestro planeta por la agricultura,

la ganaderla y la pesca, se caracteriza fundamentalmente por una distribuci6n no

homogénea en el tiempo y en el espacio, debido a las condiciones climatol6gicas

y a las diferencias en el desarrollo tecnol6gico de las diversas regiones, es evidente

que la lucha contra el hambre en el mundo implica la puesta a punto de mejores

métodos para la conservaci6n y distribuci6n de los alimentos, de ahl el gran interés

de la industria alimentaria para el desarrollo y el progreso de la Humanidad.

Debido a la extraordinaria extensi6n de las materias comentadas, tradicional-

mente los cursos y textos de Ingenierla Bioqulmica se han preocupado fundamental-

mente de la Tecnologla de la fermentaci6n y en este sentido se desarrollará aqul,

independizándose del campo de la Tecnologla de los Alimentos.

TENDENCIAS FUTURAS EN EL CAMPO DE LA FERMENT ACION

En el campo de las aplicaciones de la fermentación, es evidente que la cre-

ciente escasez del petróleo y su cont!nuo aumento de precio, determinará un cre-

ciente interés por estos procesos, cuyas materias primas son generalmente recursos

renovables.

Está claro que en el campo de la producción de biomasa, se tenderá a la

producción de proteinas y de alimentos en general, para satisfacer las necesidades

provocadas por el aumento de la población mundial y eliminar el hambre del mun-

do. El hecho de que los microorganismos puedan crecer unas 500 veces más rápida-

mente que la hierba y unas 10.000 veces más rápidamente que el ganado, indica

el importante potencial de la fermentación en este campo.

El tratamiento de las aguas residuales se tenderá a generalizar, para evitar

la contaminación y mejorar el aprovechamiento de los recursos hidricos. Las posibi-

lidades en este campo del tratamiento biológico son evidentes, sobre todo si se en-

cuentran aplicaciones para los lodos.

En cuanto a la producción de compuestos por fermentación, se irá haciendo

competitiva con la sintesis petroleoquimica para moléculas cada vez más simples,

por las razones apuntadas antes. En particular, puede ser interesante el desarrollo

de la fermentación alcohólica de residuos agricolas y vegetales con vistas a la ob-

tención de combustibles liquides.

En el campo de la tecnologia, conviene destacar que los requerimientos de

oxigeno de los microorganismos aerobios son de 1O a 100 veces superiores que los

de la mayoria de las células de los organismos superiores; por esta razón, la trans-

ferencia de oxigeno (aireación y agitación) debe ser prioritariamente tenida en

cuenta en el diseño del fermentador y el desarrollo de nuevos sistemas que aumen-

ten la velocidad de esta transferencia, puede incrementar considerablemente la pro-

ductividad de los fermentadores.

Conviene señalar también la tendencia a un mejor control de la fermenta-

ción, que implica la necesidad de esterilizar los medios de cultivos y el aire, para
inocular a continuaci6n con el microorganismo seleccionado. En este sentido es

también de g.ran importancia el desarrollo de la tecnologia de la esterilización de

medios de cultivo y de aire.

Finalmente, en el campo de los ~icroorganismos, la Ingenierra Genética ofre-

ce posibilidades insospechadas en el desarrollo de nuevas cepas particularmente idó-

neas para un fin determinado.

BIBLIOGRAFIA

AlBA, S. y cols.; "Biochemical Engineering", 2il ed., Academic Press, New

York ( 1973).

CAMACHO RUBIO, F.; "Ingenieria Bioguimica", pendiente de publicaci6n.

 TEMA 2
MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL
 MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSTRIAL

GENERALIDADES

Los microorganismos son químicamente muy similares a las células de los

animales y plantas superiores, y presentan análogas relaciones bioquímicas. General-

mente existen como células simples o a veces en colonias multicelulares sin espe-

cialización ni capacidad para controlar la temperatura celular. Mientras las células

de mamíferos necesitan en su dieta sustancias como vitaminas del grupo B y ami-

noácidos, muchos microorganismos pueden satisfacer sus requerimientos de creci-

miento con sólo sales inorgánicas que, a veces, hay que suplementar con una simple

hexosa.

Desde el punto de vista de la Ingeniería Bioquímica, se pueden dividir los

microorganismos en cuatro grupos fundamentales:

1) Bacterias

2) Virus

3) Hongos (incluyendo Levaduras y Mohos)

4) Protozoos y Algas

1) Bacterias

Se pueden considerar las bacterias como la forma más simple de ser vegetal,

si bien la mayor parte de ellas no poseen clorofila; tienen pared celular y son cé-

lulas aisladas capaces de desarrollarse fuera de tejidos vivos. Según su forma pue-

den clasificarse básicamente en "cocos", (redondos, de 0,5 a 4 micras; según su aso-

ciación existen diplococos, tetracocos, estreptococos y estafilococos), "bacilos" (for-

ma de bastón alargado, de 0,5 a 20 micras de longitud) y "espirilos" (forma espiral

más o menos acusada y de unas 1O micras de largo). Las bacterias son los organis-

mos que más abundan en la Naturaleza, encontrándose en cualquier lugar, tierra,

agua o aire. Algunas son aerobias, otras anaerobias, e incluso facultativas (aerobias

o no, según el medio).

 Se distinguen, según sus exigencias nutritivas, bacterias aut6trofas, que re-

quieren s6lo compuestos inorgilnicos para su desarrollo, y heter6trofas, si necesitan

'
gran variedad de tipos de alimentos. Existe un enorme rango de capacidad degrada-

tiva para las distintas especies, desde las que pueden utilizar proteínas naturales,

hasta las que no pueden degradar moléculas complejas y requieren, por tanto, el

suministro de aminoácidos y hexosas. Debido a estas propiedades, las bacterias se

han usado industrialmente para obtener tanto los intermediarios como los productos

finales de su metabolismo. También pueden ser una fuente de enzimas sintéticas

y degradativas, pero este campo está actualmente en desarrollo.

Por la tinci6n Gram, las bacterias se pueden diviair en dos grupos: las que

se tiñen de color violeta (Gram +) y las que se tiñen de rojo (Gram -).

2) Virus

Los virus son los microorganismos más pequeños, cuyo diámetro puede variar

de 1O a 300 milimicras. Son parásitos intracelulares obligados de animales, plantas

o bacterias. No contienen agua ni poseen actividad metab6lica. Su desarrollo y mul-

tiplicaci6n s6lo se puede efectuar en el interior de una célula viva donde el virus

obliga a la célula huésped a sintetizar un nuevo virus, lo que frecuentemente con-

duce a la destrucci6n y muerte de dicha célula.

La partícula viral infecciosa está constituída por ácido ribonucléico (RNA)

o por ácido desoxirribonucléico (DNA) como material genético, rodeado de una cáp-

sula protéica o "capsida". Los virus parásitos de las bacterias se denominan "bacte-

ri6fagos", o simplemente, "fagos", poseyendo generalmente una cabeza hexagonal y

una cola ramificada. Los fagos son altamente específicos para la clase de bacteria

que pueden atacar. La absorci6n del fago sobre la bacteria tiene lugar por interac-

ci6n entre la proteína de la cola y los receptores de la pared bacteriana, y enton-

ces el ácido nucléico del fago (RNA o DNA) es inyectado en la bacteria, pudiendo

dirigir el metabolismo de ésta hasta la formaci6n de nuevo material del fago. Las

nuevas partículas del fago son liberadas después de la lisis o muerte de la bacteria.
 Los fagos son industrialmente importantes como posibles contaminantes de

fermentaciones bacterianas, especialmente sobre cultivos de estreptococos usados

en la fermentaci6n de queso y de "Clostridium" para la producci6n de acetona-buta-

no!.

El cultivo de virus animales para ensayar drogas antiviricas y para la produc-

ci6n de vacunas es también una actividad importante, aunque a escala relativamente

pequeña.

3) Hongos

Los hongos son muy abundantes en la Naturaleza y son esencialmente aero-

bios, formando largos filamentos de células con núcleo, denominados "hifas". El con-

junto de hifas constituye el "micelio". Las células que constituyen las hifas pueden

o no presentar membrana de separaci6n ("septum").

Muchas especies de hongos tienen ciclos vitales complejos, en los que se pue-

den formar esporas sexuadas o asexuadas. Los hongos son organismos heter6trofos,

generalmente saprofitos, pero unos pocos pueden ser parásitos de animales y muchos

son pat6genos para las plantas y animales. También existen hongos simbi6ticos.

Algunas variedades tienen propiedades degradativas y sintéticas, por lo que

se han usado ampliamente en la industria para producir ácidos orgánicos (cítrico,

gluc6nico y giberélico), antibi6ticos (penicilina) y enzimas (celulasa, proteasas y

amilasa).

Una clase importante de hongos son las "levaduras", que suelen presentar for-

ma elíptica, a veces casi esférica. Sin embargo, las levaduras difieren de la mayor

parte de los hongos en que su reproducci6n se verifica por gemaci6n, siendo capa-

ces de crecimiento tanto aer6bico como anaer6bico. Su importancia industrial es

considerable para la producci6n de líquidos alcoh6licos, pan y ciertos alimentos pro-

teínicos.

Los "mohos" son un grupo de organismos, denominados a veces "bacterias

fungáceas", por sus propiedades intermedias entre las bacterias y los verdaderos
hongos. Industrialmente son muy importantes como fuente de poderosos antibioticos

para el control de infecciones del hombre, plantas y animales.

4). Protozoos y Algas

Los protozoos estén ampliamente distribu!dos en aguas dulces, saladas, en el

suelo y en los animales, siendo microorganismos generalmente no fotosintéticos, pa-

reciendo animales primitivos. Los protozoos pueden ser unicelulares y· pluricelulares,

presentando amplia variedad de formas. Algunos no se mueven, otros lo hacen con

flagelos, otros con cilios y algunos son ameboides. Los hay parásitos y simbi6ticos.

La clase Ciliados es la más importante desde el punto de vista del trata-

miento de aguas residuales. Los cilios les permiten en muchos casos un rápido mo-

vimiento en el seno del l!quido y metabolizan la materia orgánica tan rápidamente

como les llega. Este rápido movimiento consume mucha energra, lo que explica su

gran voracidad. Los géneros Vorticella y Paramecio son ciliados trpicos.

Al progresar en complejidad, de estos animales primitivos se puede destacar

a los RotHeros, que no suelen ser clasificados como Protozoos, ya que son plurice-

lulares, si bien muy sencillos. Su nombre viene del movimiento de rotaci6n de los

cilios de su cabeza, que tiene la doble finalidad de permitir el movimiento y de

capturar el aiimento, que está formado principalmente por bacterias y partrculas

de materia orgánica. Son organismos aerobios estrictos, exigiendo por lo menos va-

rios mg/1 de oxigeno disuelto. Debido a sus requerimientos metab6licos, solamente

se encuentran en aguas con bajo contenido en materia orgánica, lo que les hace

buenos indicadores de aguas poco contaminadas.

Las algas pueden ser uni- o pluricelulares y están ampliamente repartidas en

aguas dulces, saladas y en el suelo. Algunas especies tienen complejos ciclos vita-

les; todas tienen pigmentos fotosintéticos (por lo que parecen plantas primitivas)

asociados con otros muchos, tales como carotenoides, xantofilas y ficocianinas, que
les dan diferentes colores y juegan un papel bioqutmico importante. Las algas ver-

de-azules son capaces de fijar nitr6geno gaseoso.

 A pesar del interés económico de las "Chlorellas", algas verdes unicelulares

cultivadas para suplemento proteínico a escala semiindustrial en el Japón después

de la Segunda Guerra Mundial, las algas marinas no se han cultivado' todavía a es-

cala industrial.

COMPOSICION QUIMICA

Existe evidencia de que cualquier componente encontrado en un microorganis-

mo depende de la composición del medio de crecimiento, de la edad del cultivo y

de su velocidad de crecimiento. Todos los microorganismos, excepto los virus, con-

tienen aproximadamente un 80 % de agua. Bacterias, levaduras y algas unicelulares

son muy similares en contenido proteínico (aproximadamente el 50 % del peso se-

co), formado principalmente por enzimas.

Al ser los organismos estructuralmente més complejos, como los hongos y las

algas marinas, contienen menos proteínas metabólicamente activas y écidos nucléi-

cos, mientras que los polisacéridos coñstituyen una mayor proporción del peso total;

estos polisacáridos son componentes de la pared celular.

Los lípidos son componentes esenciales de todos los organismos, excepto para

algunos virus y, aunque son vitales para la estructura de membranas semipermeables

y paredes celulares, no son generalmente el componente principal del peso seco. El

contenido en ácidos grasos de los lípidos es variable, siendo los principales el pal-

mítico (C ), el esteárico (C ) y el oléico (C ).

16 18 18
De lo dicho hasta ahora se. deduce que los principales componentes de la cé-

lula seca son polímeros: lípidos, polisacáridos (celulosa, almidón, etc.), ácidos ·nucléi-

cos (RNA y DNA) y proteínas; y para comprender las funciones celulares y diseñar

los aparatos que utilizan microorganismos es necesario conocer las propiedades fisi-

coquímicas de los mencionados polímeros.

Los biopolímeros repetitivos estén formados por una sola clase de monómeros

y las diferencias entre los distintos tipos de polímeros se deben fundamentalmente

a diferencias en el peso molecular y en el grado de ramificación de las cadenas,

así como de la naturaleza del monómero. La principal misión de los polímeros repe-

titivos es la de formar estructuras con adecuada resistencia mec§nica, poca reacti-

vidad química y permeabilidad. También constituyen una reserva nutriente con aho-

rro de concentración. Así, por ejemplo, una disolución 1 M de glucosa se puede al-

macenar como glucógeno con una reducción en la molaridad de unas 10.000 veces,

o m§s. Se debe tener en cuenta que la célula necesita almacenar estos nutrientes

sin notoria alteración en la fuerza iónica intracelular.

Los polímeros no repetitivos pueden contener desde unos pocos mon6meros

hasta unos 20; en cada uno de estos biopolímeros se verifica la unión de unos mo-

n6meros a otros en una secuencia que está genéticamente determinada.

Para el caso de la especie bacteriana "E. coli", que es bastante representati-

va, los polímeros se construyen en base a la composición elemental que se indica

en la Tabla l. Los elementos que intervienen en mayor proporción son H, O, N y

e, que est§n comprendidos entre los m§s ligeros de la tabla periódica.

Tabla 1

Composición de "E.coli"

Elementos % en peso de
célula seca

e 50
o 20
N 14
H 8
p 3
S 1
K 1
Na
Ca 0,5
Mg 0,5
Cl 0,5
Fe 0,2
otros 0,3
 Los elementos mencionados pueden formar gran variedad de sustancias muy

estables, que reaccionan lentamente con el agua o con otros compuestos celulares.

Las reacciones est§.n catalizadas por enzimas (generc:ilmente proteínas) y, en conse-

cuencia, controlando el número y tipo de enzimas, la célula regula tanto el tipo

como la velocidad de las reacciones que se producen en su seno.

·Como se sabe, el disolvente dentro del cual vive la célula es el agua, que

es un importante reactivo que participa en muchas reacciones catalizadas por enzi-

mas. El agua, a pesar de su abundancia, tiene propiedades muy especiales: alto ca-

lor de vaporización, alta constante dieléctrica, ionización como ácido o como base

y facilidad de formación de enlaces por puentes de hidrógeno.

CONDICIONES PARA EL DESARROLLO Y FORMULACION DEL MEDIO

Es de destacar que un medio de cultivo que favorece el crecimiento de un

microorganismo determinado, dando un mayor rendimiento en masa celular, no es

necesariamente aquél que asegurará el más alto rendimiento en producto metaboli-

zado. Así, los factores que influyen en el desarrollo de un microorganismo son, bá-

sicamente, los siguientes:

a) Temperatura

La temperatura óptima para el cultivo varía con las especies, pero para los

organismos que existen de forma nat:ural en el suelo, aire o agua, el intervalo en

el que es mayor. su crecimiento es de 25 - 30 ºC, mientras que los que se aislan

de animales crecen mejor a 37 ºC. Algunos microorganismos de importancia indus-

trial exigen temperaturas m§.s altas (termófilos).

A veces es necesario someter el microorganismo a dos temperaturas diferen-

tes para obtener un rendimiento óptimo. Por ejemplo, para la producción de penici-

lina, la primera fase de la operación, el desarrollo del micelio, se verifica a una

temperatura más baja que la segunda fase, la formación del antibiótico. En conse-

cuencia, se deberá disponer de instalaciones en las que se pueda regular la tempe-

ratura de manera muy precisa.

b) .E!:!
Para muchos microorganismos, el mejor pH para su crecimiento es próximo

a 7; es útil conocer los pHs extremos que un organismo puede tolerar, ya que las

fermentaciones sometidas a estos !'imites pueden mantener el cultivo en desarrollo

relativamente libre de contaminaci6n por otros microorganismos. El pH óptimo para

la formaci6n de masa celular puede ser diferente del requerido para la formaci6n

de producto, por lo que el pH siempre se deber§ poder variar a diferentes niveles,

según convenga.

Como en la mayorra de las fermentaciones industriales la formación de C0 2

y de §cidos org§nicos acidifica progresivamente el medio, impidiendo el desarrollo

del microorganismo, se puede verificar una correcci6n, bien por medio de tampones

de fosfato (si bien su coste limita su empleo industrial), o por medio del co ca,
3
muy usado en las industrias de fermentación. Estos productos se suelen usar en ex-

ceso, incorporados al medio al comienzo de la fermentación.

También se puede controlar el pH por medio de agentes neutralizantes poco

costosos, como ClH, NaOH o NH (este último puede servir, además, de alimento
3
nitrogenado para microorganismos capaces de utilizarlo), que se ai'\aden en disolución

durante la fermentaci6n, muchas veces con ayuda de controladores autom§ticos de

pH.

e) Requerimientos de oxigeno

Se puede decir que los microorganismos son muy variables en cuanto a su

requerimiento de oxigeno, pudiéndose clasificar en aerobios estrictos (hongos, algas

y unas pocas bacterias), facultativos (levaduras y muchas bacterias) y anaerobios

estrictos (pocas bacterias). Un organismo facultativo produce mucho mayor rendí-

. miento en células cuando metaboliza un sustrato en condiciones aerobias, que cuan-

do actúa sobre el mismo peso de sustrato anaer6bicamente. Por ello, cuando se re-
quiere un producto del metabolismo anaeróbico, es preferible desarrollar una densa

población en condiciones anaerobias, y entonces obligar a metabolizar el resto del

sustrato anaeróbicamente. Esto beneficia al rendimiento global del producto, habién-

dose explotado con éxito en la producción de etanol por levaduras.

Las fermentaciones aerobias requieren instalaciones de producción mucho más

complicadas (esterilización del aire, cálculo de la aireación) que las anaerobias,

donde se puede verificar el cultivo en tanques muy grandes, provistos de la mezcla

adecuada de nutrientes.

d) Requerimientos de C0
2
Los microorganismos heterótrofos fijan el C0 durante su desarrollo, siendo
2
el contenido del aire suficiente para este objeto. Los organismos autótrofos depen-

den del co 2 como principal fuente de carbono, y para estos casos es muy adecuado

el uso de una atmósfera enriquecida en co 2•

Una vez estudiadas las condiciones para el desarrollo de los microorganismos,

se estudiarán los requerimientos básicos para la formulación del medio, que son los

siguientes:

1) Fuentes de energía

El desarrollo del cultivo de microorganismos es endergónico (absorbe energfa),

y la energfa necesaria puede provenir, bien de la oxidación de los compuestos del

medio, o bien de la luz. El ATP es el compuesto más importante para la transfor-

mación de la energ!a en las células; en el curso de una reacción termodinámica-

mente desfavorable, el ATP permite que se efectúe a una velocidad conveniente.

Las bacterias autótrofas fotosintéticas y las algas pueden utilizar la energ!a

luminosa para sintetizar el ATP; las bacterias autótrofas quimiosintéticas pueden

generar ATP a partir de compuestos inorgánicos. Pero las bacterias heter6trofas y

los hongos (incluyendo las levaduras) sólo pueden producir ATP por oxidación de
compuestos org§nicos.

Actualmente, en las industrias de fermentación, las fuentes de energía m§s

utilizadas son el almidón, y las melazas, pero el desarrollo de la población mundial

y el incremento del precio de los productos agrícolas aumenta el interés por los

microorganismos autótrofos, o aquéllos capaces de oxidar sustratos de hidrocarburos

tales como alcanos, para la producción de energía, lo que representa un porvenir

industrial interesante.

2) Fuentes de carbono

Frecuentemente, el carbono necesario para la célula se suministra junto con

la fuente de energía, pero las bacterias autótrofas (quimiosintéticas y fotosintéti-

cas) utilizan eo • El proceso por el cual los seres heterótrofos metabolizan un sus-
2
trato carbonado es importante para la determinación de la cantidad de carbono

convertida en material celular. Se ha encontrado que los organismos facultativos

incorporan aproximadamente el 10 % del carbono del sustrato al material celular

cuando actúan anaeróbicamente, pero cuando metabolizan aeróbicamente, el 50 - 55

% del carbono del sustrato se convierte en material celular.

Puesto que el 50 % del peso seco de células es carbono, es posible determi-

nar teóricamente la cantidad de un compuesto org§nico carbonado necesaria para

obtener un peso determinado de microorganismos. Por ejemplo, si se desean obtener

40 g de masa seca de células por litro, y el metabolismo es aerobio, el carbono

requerido en el medio ser§:

50 (g e)
. 40 (g células/l) = 20 (g e/l)
100 (g células)

Pero como un 50 % del carbono del sustrato se convierte en material celular:

100
20 (g e) • (50) = 40 (g e sustrato/!)

Si el carbono se suministra como hexosa, e H o (p.m.: 180):

6 12 6
40 (g e sustrato/1) . --=-;;..;;....,:.¡;(g;¡_;,;h~ex::..:.;o::...;:s:..=a.:....)- = 100 (g hexosa/1)
18 0

72 (g e sustrato)
 3) Fuentes de nitrógeno

Para la mayor parte de los microorganismos industriales importantes se puede

.
suministrar el nitrógeno en forma de NH o de sales amónicas, aunque la velocidad
3
del desarrollo se puede aumentar usando nitrógeno orgánico. Estos requerimientos

varían desde simples aminoácidos a sustancias más complejas: purinas, pirimidinas

y vitaminas. Sin embargo, es imposible satisfacer las necesidades de los virus en

sistemas libres de células.

Los compuestos nitrogenados apropiados para el medio de cultivo son relati-

vamente caros. Las formas más baratas son: harina de soja, de cacahuete, de pes-

cado, de carne, extracto de malta, de- levadura, extractos enzimáticos y caseína.

Los subproductos de la fabricación de melazas y del almidón de maíz aportan,

aparte del nitrógeno orgánico, pequeñas cantidades de factores de crecimiento nece-

sarios para el desarrollo rápido de los microorganismos.

El nitrógeno constituye, aproximadamente, el 10 % del peso seco de la ma-

yor parte de los organismos, por lo que el mínimo de nitrógeno contenido en el

medio se puede calcular para el rendimiento deseado en células, pero la forma en

la cual debe ser suministrado dependerá del organismo, del coste y del objeto de

la fermentación.

4) Minerales

El fósforo y el magnesio son importantes constituyentes del medio, puesto

que con ellos están relacionadas todas las reacciones de transferencia energética

que involucran ATP. Calcio, potasio, sodio y azufre existen en cantidades significa-

tivas en la mayor parte de las células, y deben suministrarse al medio. Los metales

trazas (hierro, cobalto, cobre· y zinc) son esenciales, pero existen normalmente como

impurezas en otros ingredientes del medio.

REPRODUCCION DE LOS MICROORGANISMOS

Los distintos microorganismos se reproducen de diferentes maneras, .y es im-

portante conocer cómo se verifica ésto para comprender la variabilidad de las fer-

mentaciones, mantener un "stock de cultivos" sin alteración y criar cepas para de-

terminados fines.

a) Bacterias

Las bacterias generalmente se reproducen por simple fisión. La célula va in-

crementando su masa de manera cont!nua, las membranas celulares se estiran y el

protoplasma aumenta. En un momento determinado, las membranas comienzan a

crecer hacia el interior hasta que se encuentran en el centro. Al mismo tiempo,

el material nuclear se estira y se divide en dos partes. El citoplasma y el material

nuclear se reparten por igual entre las dos células sin indicación de cu§l es la cé-

lula madre ni cu§l es la hija. A pesar de lo indicado, se han encontrado algunos

casos de bacterias que presentan una primitiva reproducción sexual.

b) Virus

Al hablar de los virus, ya se ha visto el ciclo l!tico de reproducción de los

fagos. Otro tipo de reproducción lo constituye el ciclo lisogénico, en el que el DNA

viral se combina con el de la bacteria, formando un DNA mixto, que se divide con

la célula huésped durante un cierto tiempo.

El ciclo lisogénico se puede transformar en Irtico cuando el DNA del fago

se separa del bacteriano y dirige el metabolismo hacia la formación de partrculas

de fago. Algunas veces, el DNA del fago arrastra consigo un fragmento de DNA

bacteriano. Si tal fago entra en otra bacteria y llega a ser lisogénico, el DNA de

la primera bacteria se incorpora al de la segunda para adquirir nuevos caracteres

(transducción). Se observa que este fenómeno adecuadamente controlado podr!a con-

ducir a obtener cepas con caracteres deseables para un determinado tipo de fer-
mentación.
 e) Hongos

Los hongos filamentosos se reproducen por desarrollo de las hifas y por divi-
.
si6n asexual del núcleo. Otros hongos se reproducen por esporas asexuadas, que apa-

recen en los extremos de las hifas y poseen uno o varios núcleos, mientras que las

esporas sexuadas se producen por conjugaci6n de dos núcleos haploides.

Las levaduras se desarrollan por gemaci6n a partir de una célula madre, o

por fisi6n. Durante la formaci6n de la yema, el citoplasma de la misma es contínuo

con el de la célula madre, y se separa por una membrana y una pared celular es-

peciales. El núcleo madre se alarga y migra en la direcci6n del brote; la membrana

nuclear estrangula al Ifúcleo de tal manera, que una mitad queda en el brote y la

otra en la célula madre. La membrana celular se completa y se cierra alrededor

de cada núcleo, apareciendo así dos levaduras similares, con la diferencia de que

en la célula madre aparece una cicatriz en el lugar donde se produjo el brote.

VARIACIONES EN LOS MICROORGANISMOS

No siempre es posible predecir el comportamiento del material biol6gico, ya

que sus reacciones están asociadas con cambios genéticos y a los efectos del me-

dio, que necesariamente hay que tener en cuenta y se estudiarán a continuaci6n.

a) Cambios debidos a alteraci6n genética

El núcleo de todas las células contiene ácido nucléico, que consiste en dos

cadenas pentosa-fosfato unidas entre sí por pares de bases. La adenina y la guanina

(purinas) y la citosina y la timina (pirimidinas) son las bases para el DNA, mientras

que el uracilo reemplaza a la timina en el RNA.

En el· DNA, la estructura es tal que la adenina siempre va unida a la timina

y la guanina a la citosina. La uni6n entre las bases se verifica a través de enlaces

de hidr6geno. Si se designa por (P) el fosfato y por (DOR) la desoxirribosa, se pue-

de representar una molécula de DNA de la forma que se muestra en la Figura l.

El número total de pares de bases y el orden en que van colocadas en la

macromolécula (que es una doble hélice, según el modelo de Watson-Crick) es ca-

racter!stico de cada especie. Se cree que cada gen, responsable de una propiedad

particular, corresponde a una porción del polinucleótido, y que la diferencia entre

genes es debida a diferencias en la secuencia de las bases en el polinucleótido.

\)
DOR
1
1
1
------ A-----r----- T ----
~ DOR

~ ~
1

1
1
DOR ---- C----r---- G ---- DOR

~ ~
1

1
DOR
---- T
---+--- A ----- DOR

~ ~
1

1
1
polinucle~tido polinucleC5tido
1

figura 1

Cuando el núcleo se divide, los puentes de hidrógeno que unen las purinas

y pirimidinas se rompen y las dos mitades de la molécula de ácido nucléico pueden

servir como modelos, sobre los cuáles se puede formar la mitad complementaria con

los compuestos del citoplasma. Si ahora se produce una alteración en la constitución

de la mitad de la molécula, se obtendría un nuevo DNA, y se habría creado un nú-

cleo con una información genética alterada. Si esta alteración es importante, la cé-

lula no puede vivir.

6
Se ha observado estadísticamente, que en 10 duplicaciones puede producirse

una alteración que da lugar a una célula diferente, es decir, un "mutante". Así por
 9
ejemplo, en un tanque de fermentaci6n de 1.000 litros, que contiene 10· bacterias/

ml, contendrá un número de bacterias:

9
10 • 10 6 (ml) =
nº bacterias =- -
(mi)

en que aparecerán los mutantes:

1 (mutante) • 10 15 (b actenas
. ) = 10 9
nº mutantes = 6
10 (bacterias)

muchos de los cuáles no vivirán, pero muchos otros sí, pudiendo modificarse nota-

blemente el cultivo.

Puesto que se requiere un cierto tiempo para que la mutaci6n sea aprecia-

'-' ble, en el caso de fermentaci6n en tanques por cargas, el rendimiento no será ne-

cesariamente afectado, siempre que el 'contenido al final no se utilice como in6culo

para otro tanque, lo que se traduciría en una perpetuaci6n de mutantes. El in6culo

para cada fermentaci6n se debe tomar de cultivos "stock" que se conservan liofili-

zados, donde mantienen sus características y potencial intactos. Se comprende que

en el caso de fermentaciones contínuas, la aparici6n de mutantes presenta un serio

problema pues, te6ricamente, ofrece infinito tiempo para elevar extraordinariamente

la concentraci6n en mutantes.

Aparte de las posibles mutaciones en la reproducci6n asexual, también pueden

aparecer alteraciones genéticas importantes en el curso de la reproducci6n sexual.

Durante este proceso, los cromosomas o polímeros de DNA que contienen los genes

de los padres, se duplican apareciendo cuatro conjuntos de material genético que

se pueden recombinar entre ellos ("crossing-over"), pudiéndose formar núcleos ha-

ploides con caracteres diferentes de los de cada uno de los padres (recombinantes).

La Figura 2 muestra esquemáticamente c6mo dos diferentes cepas de un organismo,

teniendo un cromosoma por núcleo, se pueden conjugar y producir descendencia con

material genético diferente de cada uno de los padres.

Las mutaciones naturales indicadas, que se producen con una frecuencia de

1110 6, pueden dar lugar a individuos que, desde el punto de vista práctico pueden

presentar cualidades más interesantes que las de sus padres (mayor velocidad de
crecimiento, mejor resistencia a condiciones adversas, mayor capacidad de produc-

ci6n). Por ello es a veces interesante provocar mutaciones para seleccionar los des-

cendientes mejorados. Con este fin se han utilizado "agentes mut§genos" físicos y

químicos. Entre los primeros se encuentran los rayos ultravioleta, X y gamma, y

haces de neutrones o electrones. Entre los métodos químicos, gas mostaza nitroge-

nado y otros agentes alquilantes, vapor de alcanfor, alcaloides, derivados de la puri-

na y pirimidina, §cido nitroso, etc.

Padre A Padre B

®
/t
(jj ([)
Re combinan tes

Figura 2

b) Cambios debidos a alteraciones en el medio

Valores extremos de pH, temperatura, presi6n osm6tica o la presencia a con-

centraciones subletales de sustancias inhibidoras, pueden causar una aberraci6n mor-

fológica, alteración metabólica y lentas velocidades de· crecimiento. Por tanto, con

el fin de obtener un diseño adecuado, se deben evitar tales cambios, por lo que ha-

brtí que controlar adecuadamente las condiciones para lograr la mejor conversión
de nutrientes en productos.

Aunque el núcleo celular de un organismo puede contener información genéti-

ca para producir una amplia variedad de enzimas, solamente algunas se producen

en todos los casos independientemente del tipo de sustrato presente (enzimas cons-

titutivas). Sin embargo, la concentración de otras enzimas esté fuertemente influen-

ciada por el tipo de sustrato presente (enzimas adaptativas o inducibles). Cuando

el sustrato inductor está ausente, el sistema que sintetiza estas enzimas es inhibi-

do.
Por otro lado, el producto final de una reacción enzimtítica o los productos

intermedios, pueden influir sobre la producción de enzimas, como muestra el esque-

ma de la Figura 3.

Represi6n (feed-back)
Sistema
enzim!tico

Sustrato Prod.fina
1--_.....-~ V
I

Inhibici6n

figura 3
 Un microorganismo con un sistema enzim§tico que, en presencia del sustrato

produce las enzimas E , E , E y E , y cada una de estas enzimas es capaz de

1 2 3 4
formar especHicamente los productos intermedios II, III, IV, y el producto final de

la reacción, V. Si el producto final V se forma a mayor velocidad de las necesida-

des del organismo, su concentración se eleva y ésto inhibe la acción de la primera

enzima, E • Este efecto es inmediato, y hace decrecer la formación del producto

1
final. Adem§s, el producto final V también actúa sobre el sistema enzim§tico (re-

presión) y hace que el microorganismo actúe sobre él, produciendo una menor canti-

dad de las enzimas E , E , E y E • Este efecto ser§ de acción m§s lenta que el
1 2 3 4
anterior, puesto que las enzimas existentes permanecen en la célula hasta que sean

convenientemente diluidas por división celular o destruidas.

Estos procesos permiten a la célula regular su contenido enzim§tico en direc-

ta respuesta a la composición del medio, lo que permite un uso m§s económico de

nutrientes. Los estudios genéticos han demostrado que el mecanismo regulador actúa

bajo control genético. Si una mutación aparece con pérdida de la capacidad regula-

dora de los genes, los mutantes pueden ser útiles industrialmente para lograr obte-

ner grandes cantidades de algún compuesto, que de otra forma sólo apareceria en

pequeña proporción. Por otra parte, la eliminación del medio del producto final o

intermedios, a medida que se forman, obliga al microorganismo a formar m§s, lo

que permite mejorar la producción de enzimas.

BIBLIOGRAFIA

AlBA, S. y cols.; "Biochemical Engineering", 251 ed., Academic Press, New

York ( 1973).

BAILEY, j.E. y OLLIS, D.F.; "Biochemical Engineering Fundamentals", Me

Graw Hill, New York ( 1977).

PRESCOTT, S.C. y DUNN, C.G. (eds.); "Industrial Microbiology", 4ª ed., Ge-

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SIMON, P. y MEUNIER, R.; "Microbiologie Industrielle et Genie Biochimigue",

Masson, Paris (1970).
 TEMA 3
LA ENERGIA EN LOS SISTEMAS BIOLOGICOS
 1

j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
-.~j
j
j
j
j
j
j
j
j
w~j
j
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j
j
j
j
j
j
j
j
J
 LA ENERGIA EN LOS SISTEMAS BIOLOGICOS

FLUJO DE ENERGIA EN LA BIOSFERA

La energía, o capacidad de producir trabajo de un sistema, puede presentarse

de diversas formas, y en el curso de una transformación ffsica o química aquéllas

son mutuamente interconvertibles. Entre el trabajo y los diversos tipos de energía

existen relaciones perfectamente determinadas, pudiendo haber interconversión. Sin

embargo, si bien las dem§.s formas de energía se pueden convertir totalmente en

calor, existe una limitación termodin§.mica para el caso inverso, que depende de la

relación de temperaturas de los sistemas considerados.

Todas las formas de energía y trabajo se pueden presentar como productos

de un "factor potencial" o magnitud intensiva, y un "factor de capacidad", o magni-

tud extensiva. Ordinariamente conviene considerar a todas las formas de la energía

como pertenecientes a una de las clases que se indican en la Tabla l.

Tabla 1

Clases de energía

forma de energía factor QOtencial factor de ca~acidad

Mecánica (P.v) Presión Volumen

Eléctrica (V.q) Potencial eléctrico Carga
Superficial (o.A) Tensión superficial Are a
Calorífica (T.S) Temperatura Entropía
Química (l..J.m) Potencial químico Masa

Es conveniente observar que todos los factores consignados son susceptibles

de medida directa con instrumentos convenientes, excepto el potencial químico y

la entropía, que sólo se pueden medir indirectamente.

Los organismos fotosintéticos capturan la energía solar, convirtiéndola en

energía química en forma de glucosa u otros productos orgánicos. Los organismos

heterótrofos utilizan estos productos como precursores de sus biornoléculas estructu-

rales y como combustibles ricos en energía para realizar sus actividades. Por tanto,

la energía solar es la fuente primaria de energía para casi todos los organismos,
'
sean autótrofos o heterótrofos, como muestra el esquema de la figura l.

ENERGIA SOLAR

ENERGIA QUIMICA
(ATP, NADPH, glucosa)

CONTRACCION TRANSPORTE BIOSINTESIS

ENERGIA DISIPADA
(calor, entropía)

figura 1

Es importante observar que, a diferencia del carbono o del nitrógeno, que

siguen un ciclo, la energía sólo fluye en una dirección·. Como se ve en la Figura

1, el flujo comienza en la captación de la energía solar por las células fotosintéti-

cas que luego se convierte en energía qulmica en forma de productos que luego

utilizan los seres heterótrofos para desempeñar diversas funciones de trabajo celu-

lar. En el curso de estos procesos, la energfa química se degrada a otras formas

como el calor que se disipa hacia el entorno.

El flujo energético en la biosfera es de enormes proporciones, empleándose

 19
anualmente unas 10 kcal de energra solar para convertir el co 2 en biomasa por

medio de los organismos fotosintéticos de la biosfera, siendo esta cifra unas 20 ve-

ces mayor que la energra que utilizan todas las m§quinas (construfdas por el hom-

bre) en el mismo tiempo.

PRINCIPIOS DE LA TERMODINAMICA

La Termodin§mica estudia los cambios de energra en cualquier proceso frsico

o qufmico, que se manifiestan, bien por la absorción o liberación de calor, o por

la realización de trabajo. Ahora bien, la Termodin§mica sólo tiene en cuenta el es-

tado inicial y final del sistema, pero no tiene en cuenta la velocidad con que se

produce el cambio, lo que corresponde, en el caso de las reacciones qufmicas, a la

Cinética Qufmica.

Aunque la Termodin§mica ha contribuido a la comprensión de los procesos

a escala molecular, se ha desarrollado a partir de leyes deducidas directamente de

estudios experimentales sobre el comportamiento macroscópico de la materia.

Primer Principio

El Primer Principio de la Termodin§mica no es otra cosa que la generalización

del principio de la conservación de la energra para el caso en que intervienen fenó-

menos térmicos. Matem§ticamente se puede formular:

~u =Q - w [1]

donde:

tu: variación de energra interna, siendo U una función de estado

Q: calor absorbido por el sistema

W: trabajo realizado por el sistema

Se puede demostrar que, si se verifica una transformación a volumen cons-

tante, la expresión anterior queda de la forma:

Q =~u [2]
V
ya que:

W = J p.dV = O [3]

mientras que si el cambio es a presión constante:

Q
p
= LlH [4]

siendo H una nueva función de estado, la entalpfa, definida de la forma:

H = U + p.V [5]

Obsérvese que si llH es negativo, la reacción es exotérmica, mientras que si es po-

sitivo, es endotérmica.

El hecho de que tanto la energfa interna como la entalpfa sean funciones de 'ftlltiJII

estado comprueba la Ley de Hess, de especial aplicación para los procesos qufmi-

cos: "El calor de reacción de un proceso qufmico a volumen o presión constante só-

lo depende de los estados inicial y final, sienda- independiente de que la reacción

_se verifique en una o en varias etapas".

Cabe destacar, finalmente, que la variación del calor de reacción con la

temperatura viene dada por las fórmulas de Kirchhoff:

LlU
2
= LlU
1
+ JT26Cv.dT (V = cte.) [6]
T
l

ll~ = llHl + r2
Tl
~cP. dT (P = cte.) [7]

Segundo Principio

El Segundo Principio viene a establecer ciertas restricciones al primero: se

sabe que existen procesos que, de una manera espont§nea, sólo se producen en un

determinado sentido y nunca en el opuesto. Por ejemplo, la expansión de un gas que

estaba sometido a una presión superior a la del medio que le rodea, la igualación

de temperaturas, de concentraciones, etc.

Asr, hay que distinguir entre lo que se denomina "proceso reversible" y "pro-
ceso irreversible". Un proceso reversible es aquél que se verifica de tal manera,

que basta una modificación infinitesimal en las condiciones exteriores para que la

transformación cambie de sentido (viene a ser una sucesión de estados de equili-

brío). Se comprende que una transformación reversible se verifica con una lentitud

infinita y, puesto que en la pr§ctica sólo son posibles cambios a velocidad finita,

los procesos reales ser§n siempre irreversibles. Sin embargo, es posible acercarse

a las condiciones de reversibilidad tanto como se quiera y razonando bajo estas

condiciones ideales, se puede llegar a conclusiones de gran interés teórico y prácti-

co.

Así como el Primer Principio viene a ser la generalización del principio de

la conservación de la energ'ía para el caso en que intervengan fenómenos térmicos,

el Segundo Principio considera el comportamiento de la función de estado denomi-

nada "entrop'ía", S. La expresión matemática de este Segundo Principio para cual-

quier transformación reversible viene dada por:

2
D.S = I
cq.ev.
1 T
[8]

Para un proceso irreversible, esta expresión se convierte en:

2
D.S > J1CQirrev.
T
[9]

Obsérvese que, si el proceso es isotermo:

Q Q.
D.S = re;. y D.S > trrev.
T
[10]

mientras que si es adiaM.tico:

D.S =O (reversible) y D.S >O (irreversible) [ 11]

Así pues, se puede establecer el enunciado formal del Segundo Principio de

la siguiente forma: "En un proceso reversible, la entropía del Universo (sistema tér-

micamente aislado) es constante; en un proceso irreversible (real), la entropía del

Universo aumenta".

Este Segundo Principio lleva a hacer las siguientes consideraciones:

~ La entropta, a escala molecular, se puede considerar como una medida del

grado de desorden de los §tomos y moléculas. Asr, en un s6lido, donde los

.
§tomos y moléculas est§n muy ordenados, la entropta es pequeña ("en el cero

absoluto, la entropta de una sustancia pura cristalizada es igual a cero", Ter-

cer Principio), mientras que para un gas, donde existe un libre desplazamien-

to molecular, la entropta es m§s elevada.

Desde el punto de vista qutmico, una molécula que tiene estructura alif§-

tica saturada, donde los §tomos pueden rotar en torno a los enlaces, posee

mayor entropta que una molécula similar con un doble enlace. También las

estructuras que impiden estéricamente las rotaciones implican una disminuci6n

de entropta •

.!?) Cuando se trata de aplicar el Segundo Principio a los seres vivos, hay que
tener en cuenta que el ser vivo no es un sistema aislado y, por tanto, el

principio de incremento de entropta se cumplir§ siempre que se considere el

ser vivo junto con un entorno. Asr, Ponz concluye que el conjunto "ser vivo

+ Universo" aumenta su entropta siguiendo el Segundo Principio; ahora bien,

la entropta aumenta unilateralmente en la parte no viviente y los cambios

energéticos son dirigidos de tal manera que el ser vivo gana orden (entropta

negativa) en forma de alimentos, y el medio sufre una evoluci6n hacia un

mayor desorden. Asimismo, el ser vivo condiciona las leyes frsicas asombro-

samente en beneficio de su propia existencia•

..5:_) Las reacciones catab6licas (productoras de energta) significan el paso de

compuestos complejos de pequeña entropta a compuestos m§s simples de en-

tropta m§s elevada, tales como urea, co 2. o agua. Asr, por ejemplo, es re-
presentativa la reacci6n:
oxidaci6n.-+-
Cfi\2o6 + 6 o 2 6 m 2 + 6 ~o [ 12]
fotostntesis
o, an§logamente, la degradaci6n de protefnas. Resulta, por tanto, que el

mundo vegetal, donde se produce el proceso inverso (disminuci6n de entropia)

 mediante la fotosíntesis, aparece como fase y condición previa del animal,

por lo que se ha dado en denominar a este hecho "esclavitud verde".

CONCEPTO DE ENERGIA LIBRE

Las condiciones para los procesos reversibles e irreversibles en sistemas ais-

lados son las expresadas por las ecuaciones [ 11]. Aunque estas relaciones permiten

juzgar si un proceso que se proyecta será posible o no, no son siempre de empleo

muy conveniente. En particular, el cambio de entropía aludido es del sistema y de

su medio. Si el criterio de espontaneidad fuera expresado en función de las propie-

dades del sistema solo, sería más fácil de emplear.

Considérese, pues, un sistema a presión y temperatura constantes, condiciones

más comunes en los procesos químicos y bioquímicos. En estas condiciones se ten-

drá:

q, = llH [13]

Proceso reversible Proceso irreversible

[ 14]

llH - TllS =O Llli - TllS < O [ 15]

(H- TS) - (H- TS) =O (H-TS) - (H-TS) <0 [ 16]

2 1 2 1

Estas expresiones inducen a definir una magnitud cuya disminución exprese

un cambio espontáneo que se produce en el sistema. Esta nueva función de estado

es la "energía libre de Gibbs", G, definida de la forma:

G=H-TS [ 17]

Las expresiones [ 16] quedarán así de la forma:

~G= O (reversible) y te < O ( ir rever si b 1e) [ 18]

 Para juzgar si un proceso dado ser§ espont§neo cuando se efectúe a presión.

y temperatura constantes, sólo hay que calcular ~G del sistema aislado. Si es nega-

· tivo, el proceso es espont§neo, mientras que si es positivo, es necesario aportar

energía al sistema para que se produzca el proceso. Si es cero, el sistema est§ en

equilibrio.
Obsérvese que en un proceso a presión y temperatura constantes:

tJ:j = ~H - T~S = ~U + P~ V - T~S [ 19]

y como:

~u =~o
"Tev.
- wrev. [20]

~S = [21]

se tendrá que:

bG =- (W
rev.
- P~V) [22]

El producto P.~ V es el trabajo realizado por el sistema contra la presión ex-

terna; si en un recipiente abierto se realiza un experimento, representará el trabajo

realizado contra la atmósfera terrestre, resultante de los cambios de volumen que

experimenta el sistema. Este trabajo, naturalmente, no es de utilidad pr§ctica y por

ello se puede deducir que la ecuación [22] representa el trabajo útil que se puede

obtener cuando un sistema experimenta un cambio reversible a presión y temperatu-

ra constantes.

Es importante tener en cuenta que un valor negativo elevado de ~G no signi-

fica que necesariamente la reacción ocurra a velocidad suficientemente r§pida para

ser medida. Este hecho ·es consecuencia de la naturaleza de los datos termodinámi-

cos, que sólo informan de la diferencia de energía entre los estados inicial y final,

pero no proporcionan datos acerca de la velocidad con que ocurren. En muchos ca-

sos, estas reacciones pueden ser tan lentas que no se producen, salvo en presencia

de un catalizador apropiado. Si ~G es positivo, la reacción no se producirá en un

 sistema aislado, aunque se utilice el catalizador más idóneo. Para que tales reac-

cienes se produzcan, hay que comunicar energía al sistema.

LA CONSTANTE DE EQUILIBRIO

Se puede demostrar que para una reacción del tipo:

aA+bB _ __ r R + s S [23]

la variación de energía libre viene dada por la expresión:

r s
aR. aS
b. G = b. G0 + Rf l n ~--=---= [24]
a b
aA • aB

" donde:
0
b.G : variación de energía libre standard ( 1 atm y 298 K)

a: actividad de cada uno de los compuestos

Si el sistema está en equilibrio, b. G = O, con lo que:

0
b.G = - Rf ln[ ~a'A •' a! ]
a8
=- RT ln K [25]
eq.
El término entre corchetes se denomina "constante de equilibrio" del sistema,

y la expresión [25] permite su cálculo conociendo el cambio de energía libre stan-

dard para dicho sistema.

Teniendo en cuenta que:

[26]

la expresión [25] se puede p::mer de la forma:

[27]

que indica que K está determinada por el producto de dos factores: uno que depen-

de de la variación de la entalpía standard y otro de la variación de entropía stan-

0
dard de la reacción. Si una reacción desprende gran cantidad de calor, b.H tendrá

un gran valor negativo y la primera exponencial hará que la constante tienda a

ser grande, lo que representa una fuerte tendencia de la reacción a transcurrir ha-
cia la derecha. Esta condición explica el hecho de que las reacciones exotérmicas

con frecuencia se produzcan espont§.neamente.

Sin embargo, la ecuación anterior presenta también la influencia de una se-

gunda exponencial, donde interviene la entropía, siendo este factor entrópico, en

ocasiones, m§.s importante que el ent§.lpico para determinar la espontaneidad de una

reacción química (reacciones endotérmicas espont§.neas).

La influencia de la temperatura en la constante de equilibrio viene dada por

la ecuación de Van' t Hoff:

d ( 1n K) Mf
=-2 [28]
dT
Rf
0
y su integración (considerando b.H aproximadamente constante):

ln K =- Mf
RT + cte. [29]

permite calcular el calor standard de reacción midiendo la constante de equilibrio

a distintas temperaturas y representando gr§.ficamente los valores obtenidos.

VARIACION DE ENERGIA LIBRE STANDARD EN LAS REACCIONES BIOQUIMICAS

La variación de energía libre standard se puede obtener por alguno de los

tres métodos que a continuación se detallan.

a) Determinación experimental de la constante de equilibrio

Para calcular los cambios de energía libre por los datos de la constante de

equilibrio es preciso conocer los coeficientes de actividad de las sustancias que par-

ticipan en las reacciones reversibles. Estos coeficientes se pueden determinar. mi-

diendo propiedades coligativas o por otros métodos. Sin embargo, se desconocen mu-

chos coeficientes de actividad de sustancias de interés bioquímico, postul§.ndose fre-

cuentemente que son iguales a la unidad. Sin se emplean concentraciones en lugar

de actividades, la constante de equilibrio aparente, K', ser§. diferente a la constan-

te de equilibrio termodin§.mica. Adem§.s, los bioquímicos suelen utilizar la concen-

tración del agua como la unidad, cuando realmente, utilizando concentraciones mo-
 lares, tiene un valor aproximado de 55,6. Obsérvese, sin embargo, que ésto no alte-

ra los valores relativos de las constantes si se calculan todas ellas sobre la misma

base.

Como ejemplo se estudia a continuación la desnaturalización reversible de

la tripsina. Entre la tripsina nativa, enzim§ticamente activa (T n) y la tripsina des-

naturalizada, enzim§ticamente inactiva, (T d)' existe el equilibrio:

K
, _[1] [30]
- ~]
K' est§ en función de concentraciones, por lo que no es una verdadera cons-

tante de equilibrio termodin§mica, pero se puede considerar que aproximadamente

se cumple:

[31]

Por aplicación de la fórmula [31] se han obtenido los valores de !J. G0 que se

indican en la Tabla 2.

Tabla 2

Desactivación de la tri psi na

T (K) Inactivación (%) K' In K' !J.Go (cal/mol)

-., 315' 1 32,8 0,488 -0,717 449

31 7' 1 50,0 1,000 0,000 o
318' 1 57,4 1,347 0,298 - 18 9
3 2 1' 1 80,4 4' 100 1 ' 4 11 -900

Con los datos de la Tabla 2 y mediante la ecuación de Van' t Hoff, se encon-

tró gr§ficamente que en el intervalo de temperaturas estudiado:

M-f = 67. 600 ca 1/rm 1 [32]

En la Tabla 2 se observa asimismo que a 317,1 K (44 ºC) la variación de

energia libre standard es nula, con lo que:

 [33]

y, por tanto:
AcO
~
= t.I-fT = 67.600
317,1 =
213
ca
1/(
mo
l) (K)
• [34]

Este gran aumento de la entropia (la mayor parte de las reacciones quimicas

van acompañadas de cambios mucho m§s pequeños, entre O y 60 cal/mol.K) con-

cuerda con la hipótesis de que la desnatiralización de una proteina destruye o alte-

ra muy acusadamente la compleja estructura de la misma en estado natural, rom-

piéndose enlaces que mantienen unidas las cadenas de péptidos en la estructura ori-

ginal.

b) Determinación de las variaciones de entalpia y entropia standard por medi-

das térmicas
Aunque el calor de reacción se puede obtener mediante la ecuación de Van't

Hoff a partir de medidas de la constante de equilibrio, conviene comprobar estos

valores por medidas calorimétricas. Esto se realiza mediante el conocimiento de los

calores normales de reacción. Para entropias, el problema es m§s complicado, lle-

g§ndose muchas veces al limite de suponer que el cambio entrópico tiende a cero,

a falta de valores de esta función de estado.

e) Medida de fuerzas electromotrices

Como se sabe, una pila galvánica es un dispositivo capaz de transformar di-

rectamente energia quimica en energia eléctrica; consta de un par de electrodos,

uno de los cuales actúa de generador de electrones, y el otro, de aceptar de los

mismos, sumergidos en sendas disoluciones de iones. La diferencia de potencial que

se produce entre ambos electrodos en circuito abierto, se denomina "fuerza electro-

motriz", f.e.m., de la pila, y se representa por e:, valor que es caracteristico para

cada pila.

La cantidad de electricidad correspondiente a 1 mol de electrones se denomi-

 na "faraday", 1, y equivale a 96.500 C/mol, aproximadamente. Así, la carga total

transferida al establecer una diferencia de potencial E cuando ha transcurrido la

reacción de la pila será n.'f; en consecuencia, el trabajo eléctrico realizado por la

pila sobre los alrededores será:

weléctrico = n.'f.E: [35]

El trabajo reversible total (trabajo máximo) realizado por la pila en estas

condiciones será la suma del trabajo eléctrico más el realizado contra la presión

atmosférica, Pil V, puesto que las pilas operan generalmente a presión constante; es

decir:

Wrev. = We ¡..:cctrico
. + PilV [36]

Por tanto:

W
eléctrico
= Wrev. - PilV [37]

o sea,

n.'f.E=W -Pt.V [38]

rev.

Si se recuerda que:

ilG =- (W
rev.
- PilV) [39]

'-' se llega a la importante relación:

t.G = - nJ. E [40]

donde ilG es la variación de energía libre que acompaña a la reacción de la pila.

Durante las oxidaciones celulares, los protones y electrones pasan generalmen-

te del sustrato a través de un sistema de enzimas (cuyos miembros individuales son

reducidos y re-oxidados sucesivamente) hasta alguna sustancia que actúe como

aceptar final de electrones. El orden de las reacciones está determinado por su po-

tencial redox, E~, basado en el par H2/2H+ a pH = 7, que tiene un potencial de

- 0,41 V. Como se sabe, la relación entre el potencial y el cambio de energía libre

de la reacción viene dado por la expresión [40], que puesta en condiciones standard
queda: ..

[41]

siendo e: el potencial redox del sistema. Poniendo el faraday en calorías por voltio
0

equivalente ( '1 = 23,063 cal/Y eq.) y considerando que en las reacciones bioquímicas

el número de electrones intercambiados es 2, se puede poner:

~ G0 , =- 46,126 e:' [42]

o
siendo en este caso ~G 0, la variación de energía libre standard en las condiciones

bioquímicas, es decir, pH = 7 y 1 atm. La expresión [42] permitirti la determinación

de variaciones de energía libre por medidas de potenciales redox.

REACCIONES ACOPLADAS

En los sistemas bioquímicos reales, las reacciones enzimtiticas no ocurren nor-

malmente aisladas; con frecuencia una reacción endergónica que no puede verificar-

se por sí sola, puede tener lugar cuando se acopla con una reacción exergónica. Pa-

ra que ésto suceda, debe haber algún producto intermedio que sea común a ambas

reacciones. Considérese el caso siguiente:

l)A+ B+.=~C+D ~Go > o (poco positiva)
1
2) D + L M+ N ~Go < o (rruy negativa)
2

3) A+B+L C-+M+-N ~Go < o (poco negativa)

3

El compuesto D que se ha formado en la .reacción 1) es un reactivo para la

reacción 2) y la reacción total es la 3) con:

(43]

Por tanto, el compuesto C se formará a partir de A y B con el concurso de la se-

gunda reacción acoplada aunque, en principio, la primera reacción no fuese espontá-

nea.

Esto puede considerarse como un ejemplo del principio de Le Chatelier, según

 el cual, una reacción se verifica totalmente en una dirección al eliminar uno de

los productos resultantes. En este caso, desaparece O al estar acoplado con la se-

gunda reacción.

Entre las reacciones acopladas, son de particular importancia para los seres

vivos aquéllas en las que intervienen los llamados "enlaces de alta energía". Estos

compuestos contienen azufre o fósforo en configuraciones como las que se muestran

en la Figura 2 (los enlaces representados por rv liberan una gran cantidad de energía

por hidrólisis.

o o
~
11
-C -OrvP -OH _J -C _Jrv~ -OH
~ dH ~ bH
1

o o o
- ~ -0 rv ~ -0 rv ~ -0 H -crvs
¿H ¿H ¿H ~

Figura 2

El ATP (trifosfato de adenosina) es uno de los compuestos de "alta energía"

más importantes en el metabolismo de una célula, pues el ATP formado durante

las oxidaciones se puede acoplar a reacciones endergónicas, que en otro caso no se

producirían. Esta molécula tiene la estructura mostrada en la Figura 3.

Cuando los grupos fosfato terminales se hidrolizan, se liberan 12.000 calorías

por cada grupo fosfato. Sin emabrgo, la hidrólisis del AMP libera solamente 1.500

calorías (se entiende la hidrólisis en condiciones fisiológicas, pues la energía libera-

da depende de las condiciones de pH y de la concentración de los reactivos). Aun-

que el ATP contiene dos enlaces fosfato de alta energía, generalmente es el grupo

terminal el que va implicado en las reacciones, es decir, la conversión de ATP en

ADP, y viceversa.·

1
1 1
lo 1 o 1
o
CH
2
-o-J-o lJ_Q
1
1 1 1
1 11
tP-OH
1
l
1 1 1
OH loH 1 OH ,.
1

OH 1 1 1
OH

------=---_j
1
1 1

1 1
-- - -- -- - - - - _j
ATP _j
----------------

Figura 3

BIBLIOGRAFIA

AlBA, S. y cols.; "Biochemical Engineering", 2ª ed., Academic Press, New

York (1973).

BAILEY, j.E. y OLLIS, D.F.; "Biochemical Engineering Fundamentals", Me

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KLOTZ, I.M. y ROSENBERG, R.M.; "Termodinámica Química", Ed. A.C., Ma-

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LEHNINGER, A.L.; "Bioquímica", 2ª ed., Ediciones Omega, Barcelona ( 1979).

SIMON, P. y MEUNIER, R.; "Microbiologie Industrielle et Genie Biochimique",

Masson, Paris (1970 ).

 TEMA 4
CINETICA DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS
 1

j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
...-¡
j
j
j
j
j
j
j
j
j
....,j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
J
 CINETICA DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

INTRODUCCION

Las reacciones biol6gicas siguen las leyes generales de la Cinética y de la

Termodinámica qutmicas. Sin embargo, su estudio se ha iniciado sistematizadamente

hace relativamente poco tiempo, Jo que se debe a su complejidad.

El conocimiento de la cinética de los procesos fermentativos industriales ha

permitido optimizar muchos aspectos, asr como posibilitar el diseño de fermentado-

res conttnuos de mucha mayor productividad.

La mayor parte de las reacciones biol6gicas se verifica en presencia de enzi-

mas, que son catalizadores especfficos de estructura generalmente muy compleja,

siendo efectiva cada enzima s6lo para un número muy reducido de reacciones. Algu-

nas enzimas son absolutamente específicas. Además de la importancia que tiene el

conocimiento de la velocidad, de acuerdo con lo dicho, también se utiliza ésta para

caracterizar la actividad y la pureza de las enzimas. Una unidad de actividad enzi-

mática empleada frecuentemente es la "cantidad de enzima pura que descompone

micromol de sustrato por minuto a 25 ºC".

Químicamente una enzima es una proteína, que puede asociarse con sustancias

no protéicas (llamadas "coenzimas" o "grupos protéticos") que son esenciales para

la actuaci6n de la enzima. Una gran variedad de experimentos han puesto de mani-

fiesto que la actividad catalítica de las enzimas se debe a la existencia de una re-

gi6n relativamente pequeña de la molécula proteínica que se denomina "centro acti-

vo" (c.a.).

Se deben resaltar, finalmente, los efectos de la concentraci6n, el .P.!:! y la

temperatura sobre las velocidades de las reacciones enzimáticas.

DEPENDENCIA DE LA VELOCIDAD DE REACCION CON LA CONCENTRACION.

ECUACION DE MICHAELIS-MENTEN

Se encuentra generalmente, que las velocidades de las reacciones catalizadas

por enzimas son proporcionales a la primera potencia de la concentración de enzima

y, con respecto a la concentración de sustrato, la velocidad varía linealmente con

la concentración del mismo a concentraciones bajas (cinética de primer orden con

respecto al sustrato) y se hace independiente de la concentración de sustrato (ciné-

tica de orden cero) a concentraciones elevadas, todo lo cual se observa en la figura

1 (considerando pH y temperatura constantes).

r
m
orden O

figura

Michaelis y Menten fueron los primeros que idearon un mecanismo que expli-

caba satisfactoriamente la acción enzimática: suponían que se formaba un complejo

enzima-sustrato y, a valores bajos de la concentración de sustrato, S, sólo una par-

te de los c.a. del enzima quedaban cubiertos y estaban en equilibrio con la enzima

y el sustrato. Al aumentar S, aumenta el número de c.a. cubiertos proporcionalmen-

te y con él, la velocidad de reacción. Para un valor S , la enzima se satura y a

S

partir de entonces, la velocidad permanece constante; por tanto, debe ocurrir que:
 kl
E + S E-S [1]
k2
k3
E-S + p + E [2]

donde E es la enzima que reacciona con el sustrato, S, y P es el producto o pro-

duetos de la reacción; E-S es el complejo enzima-sustrato que, en algunas reaccio-

nes se ha podido poner de manifiesto por técnicas espectroscópicas. Se ve claramen-

te que la enzima no se consume en la reacción.

El desarrollo inicial de Henri y Michaelis-Menten supone que, para la ecuación

[ 1] se alcanza instantáneamente el equilibrio, con lo cual:

K =~ = (E-S) [3]
k E.S
2
Considerando asimismo que la etapa [2] es irreversible:
dP
r = - = k (E-S) [ 4]
dt 3

La concentración total de enzima en el sistema, E , será constante e igual

o
a la suma de la concentración de enzima libre más la del complejo, es decir:

E
o
=E + (E-S)

o bien:
E = Eo - (E-S) [5]

valor que, sustitutdo en [3] permite obtener la concentración de complejo:

KE S
(E-S) = - -0 - [6]
1+ K S
Llevando la expresión [6] a [4]:
k KE S k E S
3 o 3 o
r = =
1 + KS 1/K + S

= Km (constante de Michaelis), la ecuación ante-

rior se transforma en:

rm S Ecuación de
r = [7]
K
m+S Michaelis- Menten

A esta ecuación se podrfa llegar también para el mismo mecanismo represen-

tado por las ecuaciones [ 1] y [2], bien haciendo la hipótesis de estado estacionario,

o bien, a partir de la teorfa de Langmuir de la adsorción.

La ecuación de M-M justifica la forma de la curva experimental mostrada

en la Figura 1:
Cuando S es muy pequeña, es decir, S << Km, entonces:
rm
r = KS = cte. S [8]
m
de modo que la cinética es de primer orden con respecto a la concentración de sus-

trato.
Por el contrario, cuando S >> K , se tiene:
m
r = rm [9] ..,J

y la cinética ser§. de orden cero.

El significado ffsico de la constante de Michaelis se obtiene haciendo r =

r /2 en la ecuación [7], con lo que se obtiene:
m
[ 10]

Es decir, la constante de Michaelis es igual a la concentración de sustrato a la

cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad de reacción m§.xima; este

valor se puede obtener de la Figura 1 de la forma indicada en la misma.

Se puede observar que el valor de Km varia en sentido contrario a la afini-

dad qufmica de la enzima por el sustrato ya que, al aumentar el valor de Km, dis- ...r1
2
minuye la velocidad de reacción. Generalmente. sus valores oscilan entre 10- y
10-S M.

Una ecuación del tipo [7] se dice que sigue una cinética de M-M y describe

muy aceptablemente muchas reacciones catalizadas por enzimas; sin embargo, esta

ecuación no es v§.lida en todos los casos, como se ver§ a continuación.

EXTENSIONES Y MODIFICACIONES DE LA ECUACION DE MICHAELIS-MENTEN

Briggs y Haldane obtienen una ecuación del tipo M-M, pero con un tratamien-

to matem§tico más general: plantean el mismo mecanismo, representado por las

 ecuaciones [ 1] y [2], de donde obtienen las ecuaciones cinéticas:

dS [ 11]
r =-- =
dt

[ 12]

· Usando también la ecuación [5], se puede eliminar E en las expresiones [11]

y [ 12], con lo que aparece un sistema de dos ecuaciones diferenciales ordinarias que

hay que resolver para las variables S y (E-S) con las condiciones iniciales S = So
y (E-S) = O para t = O.

El sistema no se puede resolver analíticamente, pero sí aplicando un método

..... numérico con el auxilio de un ordenador. Así, se obtienen las concentraciones S,

(E-S), E y P como funciones del tiempo, según se muestra en la Figura 2.

[sustratol

[Producto]

[ES]
í

Tiempo

figura 2

Por otro lado, como se ve en la figura 2, es evidente que la suposición de

estado estacionario, expresada por la ecuación:

d(E-S) _ O [ 13]
dt -

sólo es adecuada después de un breve período inicial. Esta suposición será válida
siempre que se cumpliese que la relaci6n E /S sea muy pequeña, es decir, que si
o o
la concentraci6n inicial de sustrato no es grande comparada con la concentraci6n

total de la enzima, la suposici6n de estado estacionario no seria correcta. Sin em-

bargo, en la mayor parte de los casos E /S es muy pequeña y la expresi6n [13] es

o o
una adecuada aproximaci6n una vez pasados los instantes iniciales.

Por lo tanto, las expresiones de la velocidad para reacciones enzimáticas se

obtienen generalmente utilizando la aproximaci6n del estado estacionario de Boden-

stein para los complejos intermedios enzima-sustrato. Se trata de una suposici6n

apropiada cuando la concentraci6n en sustrato es muy superior a la de enzima (si-

tuaci6n frecuente en el laboratorio) o cuando existe un continuo suministro de reac-

tivos y una continua separaci6n de productos (como es usual en la célula).

A continuaci6n se acomete el desarrollo de la suposici6n de estado estaciona-

rio, que parte de las ecuaciones [ 11] y [ 12], con ayuda de las [5] y [ 13]. Asf, de

[11] y [5] se obtiene:

[ 14]

Aplicándole a [ 12] la expresi6n [ 13], se llega a:

k S E
1 0
(E-S) = --=--=----- [ 15]
k1S + (k + k )
2 3

valor que llevado a [14] permite obtener, después de realizar las simplificaciones 'fiiiiiiJ
convenientes:

o, lo que es lo mismo:

[ 16]
+ S
Si en esta ecuaci6n se hace r
m y Km = (k + k )/k se obtiene la
2 3 1
ya conocida ecuaci6n de M-M:
r S
r = m
[7]
Km+ S
EVALUACION DE LOS PARAMETROS DE LA ECUACION DE MICHAELIS-MENTEN

El método gr§.fico indicado en la Figura 1, tiene el inconveniente de la im::-

perfección para obtener r , por lo cual, Lineweaver y Burk propusieron transformar

m
la ecuación de M-M, [7], de la forma:.
1 Km 1 1
-=--+- [ 17]
r r S r
m m
por lo que, al representar las magnitudes tal como se muestra en la Figura 3, se

obtiene una recta de la que se pueden calcular la pendiente, la ordenada en el ori-

gen y la abscisa en el origen.

1/r

\ K /
----'-~ rrn

-1/Km 1/S

Figura 3

Una alternativa a la representación de Lineweaver-Burk es la de Eadie-Hofs-

tee que, en ciertos casos (especialmente cuando hay inhibición, que se estudiará más

adelante), puede ser m§.s apropiada, por distribuir mejor los puntos. Téngase en

cuenta que para valores de r próximos a r m los puntos en la representación L-B

tienden a reunirse en las proximidades del origen, mientras que los valores de r me-

didos con menos exactitud estarán lejos del origen y tienen más importancia para

obtener la pendiente K /r .
m m
La representación de Eadie-Hofstee transforma la ecuación de M-M, [71, en:
 [ 18]

que, dividiendo por S y reagrupando se transforma en:

r
r = rm -K m -S [ 19]

Al representar r frente a r/S, debe obtenerse una recta de pendiente negati-

va, según se muestra en la figura 4, de la cual se pueden calcular los par§metros

de la ecuación de M-M.

-K m

r/S

figura 4

Si, por otro lado, se tiene en cuenta que la ecuación de M-M se puede poner

de la forma:

dS - rm S
[20]
dt = K + S
m
separando variables:
K + S
m [21]
dS = r
S mdt
e integrando:
S S t
- J Km dS
S
-
Jsds dt
= rm Jo [22]
S
o o
siendo S la concentración inicial de sustrato y S la concentración a tiempo t. La
o
expresión [22) queda, pues, de la forma:
so
Km In~) + (S o - S) = rmt [23]

Multiplicando ambos miembros por l/K t y reajustando:

m
S r (S - S)
1 1 t___Q) ;¡¡ -...,;o:;--_ [24]
tn'S=K m Kmt
Esta ecuación es de uso m§s práctico que la original de M-M, puesto que

permite obtener los parámetros cinéticos Km y r m a partir de datos t-S (que son

los que se obtienen directamente en el laboratorio), que representados gráficamente

según la ecuación f24) dan una recta como la que se muestra en la figura 5.

-1/Km
J.1 __ _

figura 5

En el supuesto de conocer Km y r m' la expresión [24) vale para calcular e!

tiempo necesario para la obtención de una determinada concentración de sustrato,

o viceversa, si bien este segundo caso es de resolución más difícil.

La constante de Michaelis, K , de una enzima es un dato importante, no so-

m
lamente para el desarrollo matemático de la cinética enzimática, sino también para

la determinación de la actividad enzimática d.e los tejidos.

Por otra parte, investigaciones médicas recientes indican que ciertos tipos de
leucemia (forma de c§ncer caracterizada porque el número de leucocitos en la san-

gre aumenta anormalmente) puede corregirse inyectando en la sangre la enzima as-

paraginasa, que cataliza la reacción de hidrólisis:

asparagina + H 0 ~!~-+ aspartato + NH~
2

lo que llevó a la conclusión de que la asparagina era muy importante para el creci-

miento de los leucocitos malignos, cosa que no ocurrra con el aspartato. Durante

la búsqueda de fuentes de asparaginasa animales, vegetales o bacterianas se observó

que no todas eran igualmente efectivas para el tratamiento de la enfermedad. Lo

que ocurrra era que unas y otras difertan muy notablemente en el valor de K , de-
m
pendiendo la efectividad de que el valor de K estuviese por debajo de cierto va-
m
lor, lo cual le da a este par§metro cinético un importante papel en este campo.

PRESENCIA DE DOS SUSTRATOS

La gran mayorra de las reacciones catalizadas por enzimas implican la exis-

tencia de dos o m§s sustratos. Sin embargo, en muchos casos uno de los sustratos

es el agua, cuya concentración es pr§cticamente constante con una valor de unas

1.000 veces (o más) superior que la de las otras sustancias. En estos casos, el estu-

dio se hace como se ha visto hasta ahora, considerando sólo la presencia de un sus-

trato, S.

En muchas reacciones bisustrato ocurre que el complejo ternario se puede

formar con ambos sustratos unidos a la enzima. A continuación se indica la posible

secuencia de etapas de este tipo de reacciones (dándose las respectivas constantes

de equilibrio de disociación):

E + st E-S 1 Kl
E + 52 E-S K2
2
E-S + 52 E-S -S Kl2
1 1 .2
E-s 2 + s E-S 1-s K21
1 2
k
E-S -S ------.+ p + E
1 2
 La velocidad de formación de producto será:

[25]

Suponiendo que las cuatro primeras etapas son equilibrios y . que la quinta es

la 'etapa controlante, se puede obtener:

[26]

para lo cual se ha utilizado la expresión:

[27]

La deducción se puede hacer asimismo bajo la suposición de estado estaciona-

río, pero se obtiene una ecuación con demasiados parámetros para ser de uso prác-

tico, por lo que se ha hecho de forma similar a la deducción primera de la ecua-

ción de M-M.

INHIBICION DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

Además de las concentraciones de sustrato y de enzima, otro factor que in-

fluencia acusadamente la velocidad de una reacción enzimática es la presencia de

un ínhibidor, sustancia que reduce la velocidad de la reacción enzimática. El caso

más dramático se encuentra en los organismos vivos, cuando. la inhibición de una

enzima particular, que está implicada en una secuencia metabólica fundamental,

puede conducir a la muerte del organismo. En contrapartida, existen inhibidores be-

neficiosos tal como los usados en el tratamiento de ciertas enfermedades.

Del estudio de los inhibidores enzimáticos se ha obtenido valiosa información

sobre la especificidad hacia el sustrato, sobre la naturaleza de los grupos funciona-

les de un centro activo, sobre el mecanismo de acción enzimática, etc. Por otra

parte, la inhibición de algunas enzimas por determinados compuestos celulares cons-

tituye un elemento de control de las reacciones enzimáticas en la célula.

La inhibición de las enzimas se clasifica, en principio, en dos tipos, reversible

e irreversible. La última implica generalmente la destrucción o modificación de uno

o más grupos funcionales de la enzima. La inhibición reversible se puede tratar

cuantitativamente mediante el empleo de la ecuación de M-M, estudiándose a conti-

nuación los tipos más comunes de inhibición reversible.

a) Inhibición campe ti ti va

En este caso, tanto el sustrato como el inhibidor son general-

mente moléculas de tipo similar, que compiten por el mismo c.a.; como muestra el

esquema de la Figura 6.

Figura 6

Si se denomina I al inhibidor, el mecanismo de este tipo de inhibición se pue-

de representar de la siguiente forma:

E-S

E-l (forma inactiva)

+ E

Al ser la tercera etapa la controlante, la velocidad se podrá poner de la for-

m a:
rp = k 5(E-S) [281

Para obtener esta velocidad, habrá que calcular la concentración de complejo

(E-S) en función de magnitudes conocidas (E , S, 1) y sustituirla en [281. Así, por

o
un lado, un balance de enzima en cualquier instante da:

E
o
=E + (E-S) + (E-1) [291

o bien:

E = E0 - (E-S) - (E-l) [301

 Por otro lado, aplicando la hipótesis de estado estacionario:

[31]

r
E-1
= k3I[E o - (E-S) - (E-1)] - k (E-1)
4
=O [32]

Dividiendo ambase ecuaciones, se obtiene el valor de (E-1):

k (k + k ) 1 (E-S)
3 2 5
(E-1) = k k S [33]
1· 4
Este valor de (E-1) se lleva a [31] y se despeja (E-S):
EOS
(E-S) = ---:---:'-----:-- [34]
k2 + ks k3
S + (1 +k 1)
k1 4
LLevando este valor a la ecuación [28] se obtiene:
k E S
5 0
r = -----:-__;;..~----- [35]
p k2 + ks 1
S + k ( 1 + k /k
1 4 3
Haciendo:

[36]

se tendrá:
r S
r m
---=;...._--:--- [37]
p
=
S + Km(l + i )
1

'-' o bien:
r S
r =-....;.:.;..
m __ [38]
p S + K'
m
donde se ha hecho:

K'
m
= K m( 1 + 1/K.)
1
[39]

con los que se observa que el efecto de la inhibición competitiva es incrementar

la constante de Michaelis a un valor K' > K •

m m
 b) Inhibición acompetitiva o incompetitiva

Se presenta cuando el inhibidor desactiva el complejo E-S, es decir, el inhibí-

dor se une al complejo E-S para formar un nuevo complejo 1-E-S que restringe la

ruptura del complejo E-S para formar el producto deseado, tal como muestra la Fi-

gura 7.

1.1.~
....~>-.
VG):::
..... ·.·.·
·.··~

Figura 7

Los pasos típicos de esta reacción de inhibición son los siguientes:

k¡
E + S E-S
k
2
k
E-S + a +l-E-S (forma inactiva)
k4
k5
E-S ------+ p + E

Mecanismo, que lleva a la siguiente ecuación cinética:

rmS
r = __ _..;;.;~----=-¡-
[40]
Km + S(l +K )
1

e) Inhibición no competitiva

Aparece con enzimas que contienen al menos dos tipos diferentes de c.a.,

atacando el inhibidor uno de ellos y el sustrato solo, al otro, tal como muestra la
Figura 8.

Figura 8
 Consecuentemente, la formación del complejo I-E-S se puede producir a tra-

vés de dos etapas reversibles:

1) Después de que una molécula de S ataca a la molécula de E en cada c.a.

del sustrato, la molécula de I ataca a la de E en el c.a. correspondiente al

inhibidor.

2) Después de que la molécula de I ataca a la molécula de E en el c.a. del

inhibidor, la molécula de S ataca a la de E en el c.a. correspondiente al sus-

trato.

Estas etapas, junto a la formación del producto, P, se muestran en el esque-

ma de la figura 9.

p + E

figura 9

Secuencias que se pueden poner de la forma:

k¡
E+ S+ E-S
k2
k3
E + I+ E-l
k4
ks
E-S + I I-E-S
k6
k7
E-1 + S I-E-S
ks
kp
E-S ------~ P + E
y que dan una ecuación cinética:
r S
r =
m
----..:.:~~~-- [411
(S + Km) (1 + K. )
1

Comparación de las ecuaciones cinéticas de inhibición

La representación gr§.fica de la figura 10 compara los distintos tipos de inhi-

bición, basados en la ecüación de Lineweaver-Burk.

Figura 10

Se observan las siguientes características:

1) La inhibición competitiva presenta una pendiente que aumenta con la con-

centración de inhibidor, mientras que la ordenada en el origen permanece fija.

2) En la inhibición acompetitiva, la ordenada en el origen aumenta al aumen-

tar la concentración de inhibidor, mientras la pendiente permanece fija.

3) Para la inhibición no competitiva, la pendiente y la ordenada en el origen

aumentan al aumentar la concentración de inhibidor.

INHIBICION POR SUSTRATO

A veces, un exceso de sustrato puede interferir en los c. a. de la enzima y,.

en consecuenci~, producir una disminución de la velocidad de reacción, tal como

muestra la Figura 11.

S (mol/1)

Figura 11

El modelÓ más sencillo que explica un mecanismo de este tipo viene repre-

sentado por las siguientes ecuaciones:

E-S + S ~ S-E-S
k4

ks
E-S ------+ P + E

La velocidad de reacción vendrá dada por:

[42)

Un balance de enzima permite obtener:

 E =E + (E-S) + (S-E-S) [43]
o
o bien:

E = Eo - (E-S) - (S-E-S) [44]

Por otro lado, aplicando la hipótesis de estado estacionario:

r S-E-S = k (E-S)S - k (S-E-S) = O [46]

3 4

De donde se obtiene el valor de (S-E-S):

k3
(S-E-S) =k (E-S)S [47]
4
Este valor de (S-E-S) se lleva a [45] y se despeja (E-S):

[48]

Levando este valor a [42]

[49]

Haciendo:

[50]

se tendrá, finalmente:
r S
m [51]
r
p = s2
S +- + K
K. m
1

INFLUENCIA DEL pH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE RE-

ACCION

Se ha comprobado para numerosas enzimas, que las constantes de la ecuación

de M-M están afectadas por el pH, de forma que a pHs bajos, r m aumenta con el

pH, mientras que a pHs altos, r m decrece al incrementarse el pH. En consecuencia,

r m presentar§. un óptimo (valor m§.ximo de r m) en un intervalo intermedio de pHs,

tal como muestra la figura 12.

(pH)6pt. pH

Figura 12

Con respecto a la temperatura, la influencia sobre las constantes cinéticas

de la ecuación de M-M es la que se produce generalmente sobre cualquier tipo de

reacción, y que obedece a la ley de Arrhenius:

k =k e-E/RT [52]
o

donde k es la frecuencia de colisión de las moléculas y E su energía de activa-

o
ción, de tal manera que al representar gráficamente In K frente a 1/T debe obte-

nerse una recta de pendiente negativa. Sin embargo, se obtiene una gráfica como

la que muestra la Figura 13.

Ello es debido a que la ecuación de Arrhenius tiene validez sólo dentro de

un estrecho intervalo de temperaturas. Cuando la temperatura es superior a un cier-

to valor crítico (generalmente alrededor de los 50 ºC), el valor de la constante ci-

nética cae, debido a que se produce la desnaturalización de la enzima.

 ln k

1/T

figura 13

BIBLIOGRAFIA

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WANG, D.I.C. y cols.; "fermentation and Enzyme Technology", john Wiley and

Sons, New York ( 1979).

 TEMA 5
CINETICA DE LA FERMENTACION. MODELOS

...
 CINETICA DE LA FERMENTACION. MODELOS

INTRODUCCION

Si un determinado número de microorganismos vivos: bacterias, levaduras,

etc. ("in6culo") se suministra a una disolución que contiene nutrientes (medio) y

mantiene unas condiciones físico-químicas determinadas (pH, temperatura, concen-

traci6n de 0 , etc.), los microorganismos se desarrollarán. No se debe olvidar tam-

2
poco la posible influencia que sobre el crecimiento puede tener un inhibidor que,

en ocasiones, viene a ser un predador.

La concentraci6n se suele expresar de dos maneras:

X: masa celular por unidad de volumen (generalmente g/l)

N: número de células por unidad de volumen

En la mayoría de los casos se suele expresar el crecimiento referido a la

masa (X), debido a su mayor ventaja para establecer balances, por lo que se usará

también preferentemente en este estudio.

En general, la velocidad de crecimiento vendrá dada por:

dX
dt = f (X,S,I)

donde S representa la concentraci6n de nutriente o sustrato limitante (g/l) e I la

concentraci6n de inhibidor. Puesto que las tres variables citadas suelen estar rela-

cíonadas entre sí, la expresi6n de la velocidad de crecimiento distará, en el caso

más general, bastante de ser lineal.

La velocidad específica de crecimiento, w, se define por:

, _ _! dX [ 1]
~-X dt

siendo sus dimensiones las de una inversa de tiempo. Si w es constante, se trabaja

en condiciones de crecimiento exponencial, donde tiene una especial significaci6n

el tiempo de duplicaci6n, td, o tiempo necesario para duplicar la masa celular (o

el número de células, si se utiliza N). Integrando la expresi6n [ 1]:

se obtiene:
rdX-
X
o
X - u r dt
o
[2)

X
In -
X = ~ t [3)
o
o, lo que es lo mismo:

X= X Jlt [4)
o

La ecuación [4) justifica la denominación de crecimiento exponencial. Si en

[3) se hace X = 2X0 :

2X
o
In x:-
o
= ~ td [5)

de donde se obtiene el valor para el tiempo de duplicación:

t = 1!:!.._1 = 0,693 [6)

d ~ ~

El valor de ~ se puede obtener de la pendiente de la recta que se obtiene

al representar In (X/X ) frente a t (ecuación [3)), o bien de la ecuación [5) se se

o
conoce el tiempo de duplicación de la masa celular, td.

Como se sabe, las bacterias, levaduras, mohos y virus son los cuatro grupos

m§.s importantes de microorganismos bajo el punto de vista industrial, presentando

ciertas peculiaridades en su crecimiento.

Las bacterias generalmente se dividen como indica el esquema de la figura

l. Previamente a la fisión, la célula duplica su masa y luego se transforma en dos

bacterias idénticas. El tiempo para que ésto ocurra suele estar comprendido entre

45 y 60 minutos, aunque en algunos casos especialmente favorables, puede descender

hasta 15-20 minutos.

o
o o
figura
 Las levaduras se reproducen generalmente por gemación, tal como muestra la

Figura 2. A diferencia de las bacterias, aquí sí es posible distinguir físicamente en-

'
tre madre e hija por la aparición en aquélla de una cicatriz en el lugar donde se

produjo la segregación. Los tiempos medios de división para las levaduras est§.n

comprendidos entre 90 y 120 minutos, pero en casos especiales pueden llegar a 45

minutos.

~"'" c:J-8 < Q célula hija

~ e::> célula madre

Figura 2

Los mohos son un tipo de hongos que crecen por elongación y ramificación,

formando cadenas características o hifas, que constituyen el micelio (Figura 3).

Cuando se desarrollan en cultivos sumergidos, el micelio puede ser difuso o formar

pastillas (agregados o "pellets") con diámetros comprendidos entre O, 1 y 10 mm;

cuando lo hacen sobre superficies, el micelio llega a formar un grueso lecho. Aquí

es muy difícil seguir el crecimiento por el número de células, puesto que no se se-

paran. Por ello se utiliza como indicativo el incremento de masa. En estos casos,

'-' la distribución de edad y la morfología tienen influencia en la cinética de fermenta-

ci6n, puesto que en algunas circunstancias sólo las célula~ más viejas sintetizan el

producto deseado, y en otras, sólo las m§.s jóvenes.

Los mohos suelen doblar la masa en tiempos comprendidos entre 4 y 8 horas

aunque, en ciertos casos, pueden hacerlo en tiempos de 60 a 90 minutos.

l ) J
elongación

Figura 3
 Como también se sabe, lo virus no siguen ninguno de los esquemas reproduc-

tivos anteriores, ya que para reproducirse deben penetrar en la célula viva, a la que

obligan a sintetizar su propio material. La célula se puede duplicar de 50 a 300 ve-

ces antes de romperse para liberar los nuevos virus, por lo que su crecimiento es

exponencial, pero el exponente es mucho mayor que 2.

METODOS DE MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Existen muchos métodos aplicables a casos determinados, pero no existe nin-

guno aplicable a todas las situaciones. A veces los métodos son muy complejos y,

en fermentaciones industriales, se utilizan medidas indirectas de la masa celular.

Medida del número de células

Se puede hacer un recuento microsc6pico usando, por ejemplo, un hemocit6-

metro. Para distinguir entre células muertas y vivas, es necesario teñir con coloran-

tes especiales (por ejemplo, el azul de metileno s6lo tiñe células muertas). El re-

cuento de mohos y levaduras por esta técnica es complicado porque no forman célu-

las discretas.

Existen métodos sofisticados, como el contador "Coulter", donde la muestra

de cultivo se coloca en un recipiente que contiene un electrolito y unos electrodos,

haciendo el vacío en un sector pr6ximo a un electrodo, separado del resto por un

pequeño orificio; cuando las células pasan, generan impulsos que se pueden contar.

El número total de células o partículas se puede establecer por nefelometría,

donde un fototubo mide la luz dispersada, que se puede relacionar con el número
de partículas.

Medida de la masa celular

a) ·Métodos directos

El método más corriente es obtener el peso seco de células: el caldo de cul-

tivo se centrifuga, se lava con tampones adecuados o con agua y se seca a 80 ºC

durante 24 horas (6 11 O ºC durante 8 horas). Esta técnica es generalmente aplicable

para el crecimiento en un medio sin s6lidos, pero no ló es cuando existen s6lidos

no celulares como carbonato c§lcico, celulosa, etc.

Otro método consiste en medir la turbidez o densidad 6ptica del cultivo, que

es proporcional a la masa celular. Como se sabe:

[7]

donde:

1: intensidad de luz

1: longitud recorrida

e:: coeficiente de extinci6n molar

C: concentraci6n

Por integraci6n se obtiene:

ln ~ = - e: e 1 [8]
o

Si se representa ln (I/1 ) frente a la concentraci6n, se obtiene una línea recta

0

de pendiente -e: l. Se trata de un método simple, r§pido y barato para obtener la

masa celular en ensayos de rutina. Sin embargo, no es útil si existen cantidades

apreciables de s6lidos no celulares.

b) Métodos indirectos

Como es 16gicq, la naturaleza del organismo y la de los componentes del me-

dio afectar~ a la facilidad con que la masa celular se pueda medir. Para el caso

de los mohos y otros microorganismos que forman micelio, la mayor parte de los

métodos descritos no son aplicables y hay que recurrir a métodos indirectos para

estimar el crecimiento. La interpretaci6n de los métodos indirectos con este fin se

hace teniendo en cuenta la esteguiometrra global del crecimiento y la formaci6n de

productos:

Fuente de C + Fuente de N + Fosfato + 0

2
------+
 -------+ MASA CELULAR + C0
2
+ H 0 + Productos + Calor
2

Por tanto, cualquier método que sirva para obtener el consumo de nutrientes o la

formaci6n de productos, se podr§. relacionar con el crecimiento microbiano.

También con este fin se ha utilizado la medida de componentes macromolecu-

lares de la célula: prote!nas, RNA, DNA, principalmente. Sin embargo, como la pro-

porci6n de estos componentes suele cambiar con el tiempo, se ha de tener cuidado

al interpretar los resultados. El contenido en prote!nas y en DNA suelen ser los m§s

constantes; el DNA no existe generalmente en el material añadido como nutriente,

por lo que es muy apropiado, si bien su an§lisis es muy laborioso.

Los métodos m§s corrientes para medir prote!nas son: la reacci6n de Biuret,

la de J olin, nitr6geno Kjeldahl y an§lisis total de amino§.cidos. Cada método da un

valor diferente, consider§.ndose que la reacci6n de Biuret es de los m§s útiles, pues

mide los enlaces pept!dicos y tiene pocas interferencias debidas a otros compuestos

nitrogenados.

El ATP se caracteriza porque es t!pico de las células y su concentraci6n por

unidad de masa celular es aproximadamente constante para un organismo dado, por

lo que su detecci6n se puede relacionar cuantitativamente con la masa celular.

También se puede emplear el an§lisis elemental de C,H,O y N; previamente

se deben separar las células de los otros componentes del medio.

El consumo de nutrientes es otra alternativa, debiéndose utilizar aquéllos que

no se usen en la srntesis de productos metab6licos: fosfato, sulfato o magnesio pue-

den ser apropiados.

Entre los productos se puede considerar el co 2, susceptible de medida por

espectrofotometrra IR de gases y se puede relacionar estequiométricamente al creci-
miento.

También el aumento en la concentraci6n de ion H+: si se utiliza NH~ como

fuente de nitr6geno, por cada mol de amonio consumido se libera un ion H+ y habr§

que añadir una cantidad de §lcali para mantener el pH. La cantidad de §lcali añadi-
da ser~ proporcional al crecimiento.

Se puede relacionar asimismo la evolución del calor con el crecimiento y la

formación de productos.

En plantas industriales se suele medir el volumen de células que se obtiene

por centrifugación del cultivo en un tubo graduado en condiciones standard de rota-

ción y tiempo.

La viscosidad de un caldo de cultivo es otra variable que se ha podido reta-

cionar con el crecimiento en fermentaciones industriales. La Figura 4 presenta el

cambio en la viscosidad como función de la concentración para una especie de leva-

dura ("Hansenula polymorpha") que se desarrolla con metano!- como nutriente limi-

tan te.

e
10 o
"P'' "P''
en 'tl 1,2
e cu
Cl) S
en,...¡
::S Cl)
en ro
'tl 'tl
ra ra
re 'tl l1
"P'' "P''
en en
o o
tl tl
en cn
"P'' "P''
>>

4 6 8 Conc.
o 2 d!lulas (g/1)

Figura 4

CINETICA DEL CRECIMIENTO CELULAR

El crecimiento celular est~ caracterizado por un incremento en la masa celu-

lar y/o el número de células y se verifica sólo cuando se satisfacen ciertas condi-

cienes fisiológicas y físico-químicas: temperatura adecuada, pH y requerimientos de

nutrientes.
Una curva tfpica para el crecimiento de microorganismos de la misma especie

en un sistema por cargas viene representada por la figura 5.

log X
lag log estacionaria
(a)
(e)
(b)
/
/
'...... , ___ / /

tiempo

Figura 5

Se pueden distiguir tres etapas distintas:

a) Etapa de latencia ("lag")

Es la que sigue a la inoculaci6n en el medio nutriente, siendo un período de

adaptaci6n; cuando un cultivo microbiano se lleva de un medio a otro es necesario 'lfllll

reorganizar sus constituyentes, especialmente en lo que se refiere a sus sistemas

enzim§ticos. Según las circunstancias, esta fase puede ser corta o relativamente lar-

ga y durante la misma, la masa celular puede cambiar sin cambiar el número de

células. También puede darse una fase de seudolatencia, cuando el in6culo es peque-

ño o tiene baja viabilidad, pues el crecimiento s6lo se detecta por encima del nivel
5
de sensibilidad del método de an§lisis. Por ejemplo, si la poblaci6n inicial es de 10

células/mi y se usa un método de turbidez para su medida, no hay posibilidad de

7
discernir hasta que la poblaci6n haya pasado a un orden de 1O células/mi en el que

la turbidez se hace detectable.

 b) Etapa exponencial ("log")

Se caracteriza porque presenta una l!nea recta en un gr§fico de log X (siendo

'
X la concentraci6n en masa celular) frente al tiempo. Se trata de un per!odo en

el que la velocidad especifica de crecimiento, l1 , es constante, ya que, según la

ecuaci6n [3]:
X
In - = 11 t
Xo
A lo largo de la fermentación, la composición qu!mica va cambiando, pues

los nutrientes se van consumiendo y van apareciendo productos metabólicos, por lo

que se puede decir que, para un intervalo de concentración de nutrientes, el crecí-

miento es independiente de dicha concentración.

e) Etapa estacionaria

LLega un momento en que la velocidad de crecimiento comienza a decrecer

debido a la falta de algún nutriente esencial o a la acumulaci6n de productos inhi-

bidores.

La fase estacionaria aparece cuando todas las células dejan de dividirse o

cuando las células viables han alcanzado un equilibrio con las no viables, o si se

quiere, la velocidad de crecimiento se hace igual a la de defunción.

Aunque el crecimiento neto se ha parado, aún existe metabolismo y, por tan-

to, acumulación de productos en la célula y en el medio. La masa celular total

puede permanecer constante (a), pero el número de células viables cae (e). Alterna-

tivamente, cuando la viabilidad decrece, las células se pueden lisar y la masa celu-

lar puede descender (b). Esto conduce a un medio complejo en productos de la lisis

y puede seguir un per!odo de crecimiento secundario denominado "crecimiento miste-

rioso".

CRECIMIENTO CELULAR Y RENDIMIENTO

La fermentación es un proceso en el que ciertos nutrientes alimentados al

sistema se convierten en masa celular y metabolitos (productos) y cada una de estas

conversiones se puede expresar cuantitativamente por un factor de rendimiento (o

simplemente rendimiento), Y, que refleja la eficacia la de conversión:

masa celular total !:,. X [9]

YX/S = masa ~nutriente consumido= -D. S
masa de producto D. P [ 1O]
YP/S = masa de ru trente consumido = -D. S

En algunas ocasiones también se define el rendimiento en producto referido

a la rriasa celular:

_ masa de producto D. P
[ 11]
y P /X - m a sa ce l ul ar total = D. X

Evidentemente se cumple que:

'<1111/J
[ 12]

El significado del rendimiento en células y en productos se puede obtener

considerando la estequiometr!a del crecimiento y de la formación de productos. En

el caso m§.s general:

A CaHbOc + B 0 2 +O NH 3 ------+M CetHSOyN<5 +N Ca'HS,Qy,No'

+ P co 2 + Q H
2
o

. Si se denomina r a la fracción de cenizas en la célula (y cuyo valor oscila

generalmente entre 0,07 y O, 10) se puede razonar de la siguiente manera:

masa de cenizas [ 13] VrttiiiJ

r = _m.....;.;as.;;.;a=c;_e~lu..;:;,l=-a..;;.,r=to;,;;;t~a.;:-1-

Por otra parte:

masa celuar total = masa org§.nica + masa de cenizas

con lo cual, dividiendo por la masa celular total se tiene:

_ masa org§.nica
1 - masa celular total + r [ 14]

o, lo que es lo mismo:

masa celuar total = masa org§.nica [ 15]

1 - r
y, utilizando la expresión [9]:
 y = masa org§nica/( 1 - r) = M(12rt+@ + 16Y+ 140)/(1- r)
[ 16]
X/S masa nutriente consumido A( 12 a + b + 16 e)

El rendimiento en producto se puede expresar de manera similar:

Y _ N(l2 a' + s' + 16 y' + 14o'

PIS - A( 12 a + b + 16 e)
[ 17]

(En las ecuaciones [ 16] y [ 17], los términos entre paréntesis representan pesos mole-

culares).

La forma usual de calcular los rendimientos consiste en medir la cantidad de

masa celular o producto obtenido y sustrato consumido en un período de tiempo, de

acuerdo con [9] y [10], que ser§n los rendimientos observados.

Es posible calcular los rendimientos te6ricos en células y en productos a partir

de los respectivos sustratos esenciales y, aunque en la actualidad existe mucha dis-

cusi6n con respecto al significado del rendimiento te6rico celular, permiten guiar

el diseño de experimentos y evaluar los resultados.

Para calcular el rendimiento te6rico en células a partir de la fuente de ener-

gía y carbono, existen dos procedimientos: uno se basa en el número de electrones

disponibles y el otro en el concepto de rendimiento constante en ATP.

La estimaci6n del rendimiento te6rico en producto requiere el conocimiento

de la estequiometría para la formaci6n del producto. En el caso de productos direc-

tos del catabolismo de la glucosa, la estequiometría se conoce:

La m§xima conversi6n es a 2 moles de etanol por mol de glucosa, o bien,

de 0,51 g de etanol por gramo de glucosa.

En la pr§ctica, los rendimientos te6ricos no se pueden alcanzar, puesto que

algo de sustrato ?e convierte en masa celular; sin embargo, pueden obtenerse resul-

tados muy pr6ximos. Así, para la producci6n de etanol se han llegado a obtener

rendimientos del 90 al 95 % del te6rico.

Para el caso de la producci6n de aminoácidos y de antibi6ticos, la estequio-

metría es más compleja y, en consecuencia, m§s difícil la estimaci6n del rendimien-

to te6rico.

EL MODELO DE MONOD

Este modelo es en la actualidad el punto de partida de la mayor parte de

los tratamientos matem§ticos del crecimiento microbiano. Monod supone que el me-

dio se puede formular de tal manera, que la concentraci6n de un solo sustrato sea

la que afecte al crecimiento (sustrato o nutriente limitante). Adem§s, también supo-

ne que una cantidad fijada de sustrato limitante se consume para producir una uni-

dad de biomasa. La velocidad de crecimiento ser§:

Velocidad de crecimiento = uX (g biomasa/l.h)

y la velocidad de consumo de sustrato limitante, u X/Y X' siendo Y X (o m§s esplki-

tamente YX/S) el rendimiento que refleja la eficacia de la conversi6n del sustrato

a masa celular.

Bajo la hip6tesis de un solo sustrato limitante, la velocidad específica de ere-

cimiento ser§ s6lo funci6n de la concentraci6n de dicho sustrato, en el supuesto de

que la temperatura sea constante, u = f (S).

Monod supuso un tipo de dependencia similar a la obtenida en la cinética en-

zim§tica por Michaelis-Menten:

[18] .,

donde:

um: m§xima velocidad específica de crecimiento (valor de u cuando S >> Ks)

S : concentraci6n de nutriente limitante

KS: constante de saturaci6n (magnitud inversamente proporcional a la afinidad

del microorganismo por el sustrato)

Se demostr6 que, en muchos casos, el crecimiento microbiano se podra des-

cribir por esta ecuaci6n, si se tomaba la precauci6n de eliminar la fase latente.

El significado ffsico de KS se obtiene haciendo u =u m/2, que sustituído en

la ecuación [ 18} lleva a:

[ 19}

es decir, K es la concentración de sustrato cuando la velocidad especHica de cre-

5
cimiento coincide con la mitad de su valor m§.ximo, como muestra la figura 6.

figura 6

El modelo de Monod est§. basado en observaciones empíricas, pero frecuente-

mente se racionaliza por la mencionada analogía con la cinética enzimática de Mi-

chaelis-Menten bajo la hipótesis de que la etapa limitante del crecimiento está con-

trolada por la velocidad de una reacción catalizada por una determinada enzima.

El modelo de Monod contiene 3 parámetros: Y, \..1m y K ; parámetros que de-

5
penden de la naturaleza del organismo, de la naturaleza del medio, del sustrato li-

mitante, de la temperatura y del Q!:!.

Con relación a la temperatura, los estudios de crecimiento de la especie "Ae-

robacter aerogenes" en glucosa como sustrato limitante se pueden considerar típicos:

se encuentra que el rendimiento Y es aproximadamente independiente de la tempe-

ratura. Por otra parte, K disminuye al elevarse la temperatura y los valores recí-
5
procos de K se pueden ajustar a una ecuación tipo Arrhenius:
5
 [20]

obteni~ndose para E
1
= 11.800 cal/mol.

Para l-l m se encontró que su valor se incrementaba al elevarse la temperatura

hasta alcanzar un m§ximo, pasado el cual, di~minura al seguir elevando la tempera-

tura; la dependencia se podla expresar de la forma:

[21]

obteni~ndose: E
2
= 14.230 cal/mol y E
3
= 32.900 cal/mol.

Estos datos de energlas de activación indican que la etapa de calda del ere-

cimiento con la temperatura es mucho m§s sensible a ~sta. Aunque no est§ muy

claro el significado flsico de estas energlas de activación, puesto que no se conoce

a qué cantidad molar est§n referidas, lo cierto es que la relación de Arrhenius es

muy útil como medio de calcular el efecto de la temperatura.

DETERMINACION DE LOS PARAMETROS DE LA ECUACION DE MONOD. OTROS

MODELOS

Monod estudió primero los datos de cultivos por cargas y obtuvo los paráme-

tros de su modelo tratando los datos experimentales. De la definición de rendimien-

to (ecuación [9]), se puede poner:

dX =_y dS
dt dt [22]

Considerando el rendimiento constante, la integración de esta ecuación permite ob-

tener la relación estequiométrica:

X - X
o
=Y (S
o
- S) [23]

donde X
o y So representan las condiciones iniciales. El factor de rendimiento se
puede obtener determinando la concentración máxima en biomasa que se obtiene

cuando S tiende a cero.

Las constantes l-l m y KS se pueden obtener por un tratamiento similar al de

 Lineweaver-Burk para la cinética enzim§tica. Teniendo en· cuenta la definici6n de

la velocidad especHica de crecimiento, lJ , la ecuaci6n de Monod, [ 18], se puede po-

ner de la forma:
1 dX
IJ=xdt [24]

La ecuaci6n [24] también se puede poner de la siguiente manera:

K
(d In X)-1 = _1 + _§. • _1
dt t =O JJ m u m S o [25]

Si se representa gr§ficamente el primer miembro (valores iniciales) frente a

1/S (para distintos valores de S ) se obtiene una lfnea recta en la cual la ordenada
0 0

'-' en el origen es 1/JJ m y su pendiente es KS/l-1 m' lo que permite determinar ambos

par§metros del modelo de .Monod. La Tabla l da algunos valores de KS para el mo-

delo de Monod., observ§ndose que los valores de KS son generalmente pequeños.

Tabla 1

Valores de KS para el modelo de Monod

(mg/ l) Organi srm

Sustrato Ks
Glucosa 1'o Enterobacter aerogenes
Glucosa 2,0-4,0 Eccherichia coli
Glucosa 25,0 Sacchar~ces cerevisiae
Ribosa 3,0 Hansenula pol~rpha

!\~etanol 120,0 H. polyrmrpha

Pimnfaco o, 1 E. aerogenes
Mlgnesio 0,6 E. aerogenes
Sulfato 3,0 E. aerogenes

Se ha cuestionado la validez de los par§metros del modelo de Monod obtenidos

por el procedimiento anterior, puesto que la situaci6n es no estacionaria y las célu-

las est§n sometidas a unas condiciones en contfnuo cambio y pueden no haberse

adaptado totalmente a dicho entorno.

 Como consecuencia de lo indicado, hay autores que afirman que se deben deter-

minar los par~metros en un sistema en estado estacionario, como por ejemplo, -el

guimostato que muestra la figura 7.

F
F (caudal volum~trico)
X = o - V X -
o C>l::::;)x

figura 7

El balance de materia (referido a biomasa), considerando mezcla completa y ali-

mento estéril (X
o
= O) lleva a la siguiente ecuación:

(F/V) X + \.1 X
o
= (f/V) X + dX/dt [26]

llamando f /V = D, "velocidad de dilución", que viene a ser el recíproco del tiempo

de residencia, se tiene, teniendo en cuenta la ecuación de Monod, [ 18]:

dX
crt=-DX [27]

físicamente, D viene a ser el número de volúmenes de fermentador gue pasan a

través del mismo en la unidad de tiempo.

Cuando se alcance el estado estacionario, la ecuación [27] se transforma en:

\.1 S
D =~m..;....._-= [28]
KS +S

obteniéndose los valores de los par§.metros haciendo una representación tipo Line-

weaver-Burk de la ecuación [28]:

[29]

donde 1/D representa el tiempo de resisencia.

 Consideraciones estadísticas elementales . indican que para que los valores de KS

sean válidos, el quimostato debería operar en un intervalo de valores de D tales que

la concentración residual del sustrato limitante sea del orden de magnitud de Ks·

Pero se ha visto que los valores de Ks son generalmente pequeños (para algunas

bacterias que se desarrollan en glucosa pueden llegar a valer 0,01 mg/1) y las con-

centraciones de este orden de magnitud no se pueden determinar por los métodos

analíticos usuales. Por ello, la utilización del quimostato no es siempre apropiada

para obtener los parámetros del modelo de Monod.

Esta dificultad se puede superar en ocasiones aplicando la técnica de Sheata y

Marr: en condiciones por cargas, un medio de concentración conocida en sustrato

limitante .se inocula con muy pocos organismos de los que se van a estudiar. Se

permite el crecimiento hasta que la concentración en biomasa alcance un valor de-

tectable, pero todavía muy pequeño; se hace esta medida, X, y se diluye el cultivo

con el mismo medio fresco anterior y se repite el procedimiento. Puesto que la

concentración en biomasa es siempre muy baja, el crecimiento no cambia aprecia-

blemente la composición del medio y las células estarán en un medio sensiblemente

constante, a pesar de no estar verdaderamente en estado estacionario. La repetición

del proceso permite hacer una representación gráfica de ]..1 frente a S.

Muchos autores han propuesto otros modelos para aquellos casos en que no se

ajusta bien el modelo de Monod. Así, Teissier ( 1942) propone la ecuación:

S In 2 [30]
]..1 = ]..1 m [ 1 - exp (- K )]

con un número de parámetros igual al de Monod.

Moser ( 1958) propone la siguiente relación:

]..lm Sw
]..1 = [31]
Kw+ Sw

que utiliza un parámetro más.

En ambos casos K es la concentración de nutriente a la cual ]..1 = ]..1 m/2.

El modelo de Moser se convierte en el de Monod cuando w = l. Cuando w > 1
la representaci6n de la ecuaci6n de Moser es sigmoidal, en lugar de hiperb6lica.

Jost ( 1973) utiliza un modelo de doble saturaci6n con igual número de parámetros
que el anterior:

[32]

Seata y Marr ( 1971) proponen la ecuaci6n:

k S k S
1 2
\.1 = K l + S + K + S
[33]
2
o una generalizaci6n de ésta que supone la adici6n ulterior de términos de la misma

forma.

Los estudios experimentales que han conducido al modelo de Monod y a los demás '111/1111

modelos se han llevado a cabo con poblaciones de microorganismos "osmotr6ficos"

(las sustancias nutritivas pasan a través de las membranas celulares) que es el modo

de nutrici6n típico de las bacterias, algas azules, muchas algas verdes, hongos (in-

cluyendo levaduras), etc. Sin embargo, existen muchas especies de protozoos que se

nutren por ingesti6n de materiales s6lidos, dándoseles el nombre de "fagotr6ficos".

Cuando los s6lidos son otros organismos, el modo de nutrici6n se denomina "holoz6i-

co".

Dado el uso de los protozoos en el tratamiento de aguas residuales y el impor-

tante papel que juegan en la dinámica de la biosfera, está justificado hacer una

breve consideraci6n sobre los mismos. En los protozoos se ha desarrollado un amplio

conjunto de estructuras celulares para la captura, ingesti6n y digesti6n de los ali-

mentos, así como para la excreci6n de lo que no han digerido. Algunos se denomi-

nan "predadores" porque buscan, capturan y consumen organismos-presa, para lo

cual, en ocasiones, el protozoo crea corrientes de agua en sus proximidades por el

movimiento de sus cilios, lo que lleva a los pequenos organismos suspendidos en el

agua a su orificio bucal ("filter feeders" o alimentadores-filtro).

Muchos investigadores encuentran que el crecimiento de microorganismos holoz6i-

cos se puede describir por el modelo de Monod, pero otros no lo encuentran satis-
factoría para el caso particular que estudian, y proponen modificaciones.

INFLUENCIA DE ALGUNAS CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Ya se ha considerado brevemente la influencia de la temperatura al estudiar

el modelo de Monod.

El pH es un parámetro importante que afecta tanto al crecimiento como a

la formación de producto, lo que justifica que en la mayoría de las fermentaciones

esté adecuadamente controlado, pues durante las mismas tiende a cambiar.

Aunque pueden existir excepciones, se pueden hacer algunas generalizaciones:

las bacterias se suelen desarrollar en intervalos de pH entre 4 y 8, las levaduras

lo hacen a pH de 3 a 6 y los mohos de 3 a 7. El conocimiento de estos intervalos

tiene importancia para evitar la contaminación.

Concentraciones elevadas de nutriente pueden producir una inhibición del ere-

cimiento, como se puede observar en la figura 8.

S S
e
figura 8

Para el caso de la glucosa, la inhibición sólo se presenta a concentraciones

muy elevadas (1 00 a 150 g/1). Este tipo de inhibición se supone debida a la deshi-

dratación de las células y es importante en la conservación de alimentos.

Control de la transferencia de materia

La transferencia de materia puede ser el factor controlante del crecimiento

en algunos casos. Asr, un cultivo aerobio en un fermentador no agitado, o agitado

pero con elevada concentraci6n de microorganismos, puede estar controlado por la

transferencia de oxigeno, y una disminuci6n del ox!geno disuelto implica una dismi-

nuci6n en la velocidad especHica de crecimiento: el ox'fgeno pasa a ser el nutriente

limitante. Se puede poner:

[34]

donde:

KL: coeficiente global de transferencia de materia

a : área interfacial especifica

Ce: concentraci6n de 0 en equilibrio en la fase gaseosa

2
C : concentraci6n de 0 en la fase liquida
2

Por otra parte, las necesidades de oxigeno de las células se pueden expresar
de la forma:
\..IX
Yo [35]
2
donde Y0 es el factor de rendimiento en células referido al ox'fgeno como nutrien-
2
te limitante:

=
masa de células obtenidas
masa de ox'fgeno consumido [36]

De las expresiones [35] y [36] se puede poner:

KL .a (Ce - C) = ~X [37]
02
y si se tiene en cuenta la definici6n de la velocidad especifica de crecimiento:

[38]

lo que indica que cuando el oxigeno es limitante, el crecimiento es una funci6n li-
neal de la fuerza impulsora, (C - C).
e
Casos parecidos se pueden presentar cuando las células utilizan otros sustra-
tos insolubles en agua, como celulosa o hidrocarburos. Así, se ha encontrado que,

cuando la levadura "Candida intermedia" se desarrolla en hexadecano, presenta los

resultados que se muestran en la figura 9.

1.000 rpm-

600 rpm.

tiempo

figura 9

Al principio, el crecimiento es exponencial hasta que el área superficial de

las gotitas de h~drocarburo llega a estar cubierta de células. En este momento, el

crecimiento se hace lineal (dX/dt es constante si lo es la fuerza impulsora) y, como

puede observarse en la figura 9, depende de la velocidad de agitación, ya que ésta

controla el área disponible para la transferencia de materia.

Cuando el nutriente es celulosa, el crecimiento está controlado por la hidróli-

sis de aquélla a azúcares fermentables. Como la reacción de hidrólisis es superfi-

cial, la cinética del crecimiento llega a ser lineal si la demanda de ¡3.zúcares es su-

perior a la que se suministra o si se hace necesario el contacto células-celulosa pa-

ra la hidrólisis.

También se puede dar el crecimiento lineal cuando las células se recubren

de una gruesa cápsula o cuando los nutrientes han de pasar a través de un aglome-
rado de micelio.

TIPOS DE fERMENTA ClONES

·El sistema de clasificación sugerido por Gaden relaciona la formación de pro-

dueto con la utilización de sustrato y presenta ciertas ventajas en el estudio de la

fermentación cont1nua. La clasificación de Gaden se presenta de forma abreviada

en la Tabla 2.

Tabla 2

Tipos de fermentaciones, según Gaden

Tipo Caracterfsticas Ejemplos

1 formación de producto directamente relaciona- Etanol

da con la utilización del hidrato de carbono Acido glucónico
Acido l§ctico
(por lactobacillus)

2 formación de producto indirectamente relacio- Acido dtrico

nada con la utilización del hidrato de carbono Acido itacónico
Amino§.cidos

3 Formación de producto no asociada, aparente- Antibióticos

mente, con la utilización del hidrato de carbono Vitaminas

POr su parte, Deindoerfer clasifica las fermentaciones según su desarrollo, clasifica-

ción particularmente útil en el estudio de la fermentación por cargas, de la siguien-

te forma:

1) Reacciones simples

Los nutrientes se convierten en productos según leyes estequiométricas fijas,

sin acumulación de productos intermedios. Existen dos subtipos:

a) Con crecimiento celular (figura 10). Ejemplo: levadura.

b) Sin crecimiento celular (Figura 11). Ejemplo: §.cido glucónico sin recircula-
 ción de células.

Carbono consumido
de la glucos

o
S:
.8,...
ra
u

tiempo
tiempo

Figura 10 Figura 11
Crecimiento de "Aerobacter cloacae" Conversión por "Aspergillus niger"
resuspendidos en forma de micelio

2) Reacciones simult§neas

Se forma m§s de una clase de producto, variando las velocidades relativas

de producción de cada uno de ellos con la concentración de nutriente. Ejemplo: la

obtención de grasa y proteínas celulares durante el crecimiento de "Rhodotorula glu-

tinis", tal como se muestra en la Figura· 12.

Azilcar

/
~..asa
/
.,....
-c..el..ular total

/
/ Grasa celular

Prote!na ·celular

tiempo

Figura 12
 3) Reacciones consecutivas

Aqur ocurre que una sustancia intermedia se acumula antes de formarse el

producto. Un ejemplo es la obtención de §cido glucónico a partir de glucosa me-

diante un organismo carente de gluconolactonasa ("Pseudomonas ovalis"), apareciendo

cantidades apreciables de gluconolactona, tal como muestra la figura 13.

Glucosa

Acido gluc~nico

olactona

tiempo

Figura 13

4) Reacciones por etapas

Es el caso de dos reacciones simples regulables por inducción enzim§tica. En

la figura 14 se presenta la utilización por la "E. coli" de una hexosa y una pentosa

que se le suministran simult§neamente.

Se observa que primero consume completamente la hexosa y luego consume

la pentosa. Monod llamó a este tipo de fermentación, "diauxia".

 -
tU
e::
tU
.¡

.,
S..
<1)

t.)
tU Fase de consumo
,Q sorbitol
ro
tU
ro
.¡
m
e::

-
<1)
ro Fase de consumo
de glucosa
"'
o
~

t.,
tiempo

Figura 14

BIBLIOGRAFIA

AlBA, S. y cols.; "Biochemical Engineering", 2ª ed., Academic Press, New

York (1973).

BAILEY, J .E. y OLLIS, D.F.; "Biochemical Engineering Fundamentals", McGraw

t., Hill, New York (1977).

LAPIDUS, L. y AMUNDSON, N.R. (eds.); "Chemical Reactor Theory", Prentice

Hall, Englewood Cliffs, N.J. ( 1977).

QUINTERO, R.R.; ·"Ingeniería Biogutmica", Alhambra, México ( 1981).

WANG, D.I.C. y cols.; "Fermentation and Enzyme Technology", john Wiley and

Sons, New York (1979).

 TEMA 6
ESTERILIZACION
-----------~~----
 ESTERILIZACION

INTRODUCCION

La esterilización se podrfa definir como la eliminación de todo organismo vivo

en un determinado aparato o medio. Sin embargo, esta definición es muy estricta,

entendiéndose por esterilización en la mayor parte de los casos, cualquier proceso

que altere a los organismos lo suficiente para impedir su desarrollo.

Se debe distinguir entre esterilización y otros conceptos parecidos como la

"desinfección", que consiste en la eliminación de aquellos organismos que pueden

... causar una infección, o la "pasteurización", que consiste en la eliminación de un

gran número de microorganismos, pero no todos, con el fin de llegar a un número

aceptable para determinados fines.

Las razones generales de la esterilización son:

a) Evitar la transmisión de enfermedades

b) Evitar la alteración por microorganismos (putrefacción)

e) Evitar el comensalismo de organismos extraños con el fin de facilitar el

desarrollo de los organismos de interés

En ocasiones se pueden presentar simultáneamente dos o tres de las razones

apuntadas.

Por otra parte, son objeto de esterilización:

1) Sólidos: aparatos e instrumentos microbiológicos, fermentadores, medios de

filtración estéril, alimentos, etc.

2) Líquidos: medios de cultivo, agua para procesos estériles, líquidos parente-

rales, etc.

3) Gases: aire (para salas estériles o para fermentaciones aerobias), nitrógeno

(cuando se ha de evitar la oxidación), etc.

·'METODOS DE ESTERILIZACION
Los métodos usados para la esterilización son los siguientes:

1) Destrucción f!sica de los microorganismos

Este método es fundamentalmente el fuego directo, pero es poco usado in-

dustrialmente, debido al peligro de dañar el material. En pequeña escala se puede

utilizar para esterilizar el instrumental.

2) Muerte o inactivación

La muerte o inactivación se puede conseguir de tres formas:

a) Calor (seco o húmedo)

b) Otras fuentes energéticas (radiaciones ionizantes, UV, etc.)

e) Agentes qufmicos

3) Separación ffsica

Este método queda restringido, por razones evidentes, a líquidos y gases. El

único proceso realmente útil en este campo es la filtración. La precipitación elec-

trostática o la centrifugación pueden servir como pasos pre-esterilización con el fin

de eliminar la mayor parte de los microorganismos.

Se citará finalmente que, a escala industrial, sólo tienen importancia:

- La esterilización de medios de cultivo para fermentación (vapor)

- La esterilización comercial de alimentos (calor, rayos UV, rayos gamma, .J

etc.

La esterilización del aire para uso en fermentaciones o para obtener bote-

llas estériles, bien por filtración (separación) o por compresión (inactiva-

ción)

CINETICA DE LA ESTERILIZACION POR CALOR. MUERTE TERMICA DE MICRO-

ORGANISMOS

Para todo organismo existe un margen de temperaturas dentro del cual puede

vivir y multiplicarse, pero por encima de una temperatura determinada, su metabo-

lismo se perturba, probablemente como consecuencia de la desnaturalización de sus

sistemas enzim~ticos esenciales. Una vez alcanzado este punto, el proceso letal tie-

ne una elevada energra de activación, por lo que bastan ligeros incrementos de tem-

peratura para obtener grandes aumentos de velocidad.

La temperatura crrtica cambia de unos microorganismos a otros, pero para

bacterias esporuladas suele oscilar entre 50 y 100 ºC, bajo condiciones de. humedad

media. Se debe destacar que la forma esporuloclarel "Clostridium botulinum" tiene una

energra de activación de unas. 65.000 cal/mol (recuérdese que para reacciones qu!mi-

cas ordinarias, la energra de activación suele oscilar entre 10.000 y 20.000 cal/mol).

Con este dato y una constante experimental, es posible calcular cualquier combina-

ción tiempo-temperatura que produzca una esterilización aceptable.

Debido a que el "C. botulinum" es muy patógeno, se utiliza en su lugar, con

fines experimentales, una raza seleccionada de esporas de la bacteria no patógena

"Bacillus stearothermophilus", de resistencia térmica parecida. Como estas especies

son las m~s resistentes desde el punto de vista térmico, se tiene la seguridad de

que las otras, menos resistentes, desaparecer~n.

Se ha observado que a mayor temperatura se produce m~s r~pidamente la

muerte de las esporas y que a una temperatura dada, se requieren tiempos diferen-

tes para destruir las esporas de una misma especie, ya que algunas son m~s resis-

tentes al calor que otras. Si se hace una representación gráfica del número de es-

poras que sobreviven frente al tiempo a que se les tiene sometidas a una tempera-

tura dada, se observa experimentalmente que el número de esporas que sobreviven

desciende asintóticamente hasta cero, con lo cual no es posible conocer el tiempo

necesario para matar a todos los microorganismos, es decir, cuando la curva alcan-

za el cero. Por ello, se utiliza un tratamiento estad!stico tomando como tiempo

adecuado el necesario para reducir el número de esporas a una cierta fracción del

número original. Este tiempo se conoce como "tiempo de muerte térmica a la tem-

peratura de trabajo". Nótese que estos tiempos de muerte térmica no representan

esterilización completa, sino un concepto matem~tico que se puede considerar como

esterilización efectiva.
Cinética logar'ttmica
Si N es el número de microorganismos, o su concentración, existentes en el

cultivo puro, se comprueba que la velocidad de destrucción a una temperatura de-

terminada obedece a una cinética de primer orden:

dN
-crt=kN [ 11

Integrando y teniendo en cuenta que a tiempo cero el número o la concentración

de microorganismos es N :
0

ln
*)o
=- k t [2]

o bien:
.,¡J
-k t
N = N e
o [3]

siendo k la constante especifica de destrucción del microorganismo.

La constante k se puede relacionar con la temperatura mediante la ecuación

de Arrhenius:

k =A e-E/RT [4]

siendo:

A: constante característica (s - 1)

E: energía de activación (cal/mol)

R: constante de los gases (1,987 cal/mol.K)

De las ecuaciones [2] y [4] se deducen inmediatamente las representaciones

gráficas de la Figura 1 y Figura 2, respectivamente. De la primera se obtiene el

valor de k a la temperatura de trabajo y de la segunda, la energía de activación.

Una variante de la cinética logarítmica es el "tiempo de reducción decimal"

(TRD), D, valor muy utilizado por los microbiólogos, especialmente en la industria

de alimentos. Se define como el tiempo necesario para la que población pase a va-

ler un décimo del valor original a una temperatura dada (Figura 3).

De la propia definición de 0:
 N 1 -k. O
N=io = e
o

de donde:
D _ 2,303 [51
- k

T= Cte. ln k E
ln k = ln A- R·T

t 1/T

figura 1 figura 2

Los valores de O se pueden obtener a diferentes temperaturas dentro de un

amplio intervalo.

lag

T = Cte.

--+ ---- 1

\--- D ---1 t

figura 3
 Si ahora se representan los valores de D (en escala logarítmica) frente a la

temperatura (Figura 4), se obtiene el denominado "valor Z", definido como el núme-

ro de grados (C 6 F) para los cuales el valor de D se reduce 10 veces.

log

1
__ _j_ ____ _
1

\--"valor z-1 T

rigura 4

A veces, y con fines comparativos, se utiliza el "valor Q", que se define co-

mo el incremento en la velocidad de inactivación para un determinado incremento

de temperatura. Así, por ejemplo, Q

10
(2f) = 3,8 significa que para un incremento

de temperatura de 10 2f, el aumento en la velocidad de inactivación es de 3,8 ve-

ces.

Cinética no logarítmica

No siempre se encuentran los resultados indicados anteriormente. Así, en mu-

chas ocasiones, al representar ln (N/N ) frente a t se obtienen grMicas como las

o
que se indican en la Figura 5, datos típicos de muerte térmica para esporas de "B.

stearothermophilus".

Es frecuente para el caso de esporas y de poblaciones mixtas (aunque dentro

de éstas, cada especie particular puede presentar comportamiento logarítmico) que

la inactivaci6n por calor siga una cinética no logarítmica.

 lo
10

N/N0 1

1o- 1

10- 2

10- 3

10- 4
o S 10 15 20 25 t (min.)

figura 5

Un modelo útil para algunas esporas que utiliza un pequeño número de par~-

metros cinéticos es el de Prokop y Humphrey ( 1970), que supone la siguiente se-

cuencia:

~
--------¡.. ks
--------+ No

Las esporas resistentes, NR' antes de llegar al estado letal, N , pasan a tra-
0
vés de un estado intermedio, N . Las ecuaciones diferenciales que gobiernan el mo-
5
delo ser~n:

[6)

[7)

donde N representa el número de células por ml.

-La solución del sistema formado por las ecuaciones [6) y [7) conduce a:

[8]

donde N representa la concentración de células viables (NR + N ) a un tiempo t

5
y N es la concentración inicial de células viables.
o
 La representación gr§fica de la ecuación [8] con las constantes cinéticas

apropiadas est§ de acuerdo con la figura 5.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LOS CONSTITUYENTES DEL MEDIO

Como ya se ha indicado, la energfa de activación para la inactivación micro-

biana por calor húmedo suele tener valores elevados, lo que es importante cuando

se compara la muerte térmica de microorganismos con la descomposición térmica

de los restantes componentes del medio de fermentación o de un determinado pro-

dueto alimenticio.

La Tabla 1 muestra las energ!as de activación de esporas bacterianas y algu-

nas vitaminas termosensibles.

Tabla 1

Energ!as de activación de esporas bacterianas·

y de vitaminas del grupo B
Vitamina/Espora E (cal/mol)

Acido fólico 16.800

Cianocobalamina 23.100
Clorhidrato de tiamina 22.000
B. stearothermophil us 67.700
B. subtilis 76.000
C. botulinum 82.000

A continuación se considerar§ el efecto de la temperatura para alcanzar un

determinado nivel de esterilidad en un medio de fermentación y simult§neamente

se observar§ su efecto sobre la destrucción de una determinada vitamina del men-

cionado medio.

Por ejemplo, supónganse las esporas del "B. stearothermophilus" y la tiamina.

Los par§metros cinéticos proporcionados por la bibliografra son los siguientes:

 Tiamina B. stearothermoQhilus
f T = 102 2C f T= 125 2C
< <
-1 -1
l k = 0,014 min
l k = 0,07 min
E = 22.000 cal/mol E = 67.700 cal/mol

La Figura 6 muestra una representación de Arrhenius para ambos casos.

1, o

k (min. - 1 ) B. stearothermophilus

o, 1 Tiamina

0,01
2,1 2,5 2,8
1/T (K.10- 3 )

Figura 6

Se observa que al aumentar la temperatura, el aumento en la constante de

descomposición para las esporas es mucho más acusado que para la vitamina, lo

cual es muy importante tener en cuenta: alcanzar esterilidad sin gue los nutrientes

se alteren.

Usando los datos de la Figura 6 se puede llegar a obtener un incremento de

temperatura que pueda economizar los nutrientes (tiamina) sin sacrificar el nivel de

esterilidad deseado.
 Lo dicho se muestra en la Tabla 2 con un criterio de esterilidad de N/N 0 =
10- 16 para las esporas del "B. stearothermophilus". Por tanto, a cada temperatura,

se debe mantener el medio un tiempo suficiente para que se verifique la condición

de diseño indicada.

Tabla 2

Efecto de la temperatura sobre la destrucción de timina

para un nivel de esterilidad constante (N/N = 10 )
para esporas de "B. stearothermophifus"

Testerilización Tiempo requerido Pérdida de tiamina

(2C) (m in) (%)

100 843 99,99

110 75 89
120 7,6 27
130 0,851 10
140 o, 107 3
150 0,015

Se observa en la Tabla 2 que, debido a las diferencias en las energías de ac-

tivación, la pérdida de nutrientes decrece proporcionalmente al elevarse la temper::l,-

tura, necesit§.ndose tiempos m§s cortos. Por otro lado, sin embargo, los tiempos ex-

tremadamente cortos requeridos a altas temperaturas no se pueden lograr f§.cilmente 'lflllll

en procesos por cargas.

En resumen, y de acuerdo con lo visto, el sistema m§.s idóneo para la esteri-

lización por calor es el de alta temperatura y tiempos cortos (HTST: "high tempera-

tures - short times").

INFLUENCIA DEL pH EN LA MUERTE TERMICA

Según Davey y cols., la dependencia de la muerte térmica con el pH se puede

correlacionar mediante la expresión:

ln k = - R ET + a(pH) 2 + b(pH) + e [9]

que se puede escribir de la forma usual:

ln k = - R ET + ln A [ 1O]

siendo:

ln A = a(pH) 2 + b(pH) + e [ 11]

En la Tabla 3 se representan los valores de los par§metros E, a, b y e obte-

nidos por Davey.

Tabla 3

Coeficientes cinéticos para la inactivación del "C. botulinum"

Sustancia E (kcal/mol) a b e

Spaguettis 79,29 0,1634 2,3428 105,06

Macarrones 72,50 o, 1878 2,6147 104,38
Paella 74,71 0,2032 2,7949 107,81

DISEÑO EN ESTERILIZACION

Como se ha mencionado, la resistencia térmica relativa de esporas bacteria-

nas, comparada con la de otros tipos de microorganismos, sugiere la destrucción en

la medida de lo posible de estas esporas como objetivo de la esterilización. Por otra

parte, es imposible alcanzar un nivel de esterilidad absoluto, pudiénd.ose afirmar so-

lamente que la esterilización ofrece una cierta probabilidad de reducir un contami-

nante de un nivel a otro.

En general, no se conoce el nivel inicial de contaminante, debiéndose suponer

un valor absoluto que sea conservativo en su estimación. Se debe tener en cuenta

que para el caso particular de la industria de enlatados, las exigencias suelen ser

muy estrictas, siendo típico un criterio de diseño de N/N

o
= to- 12 • Por otro lado,

ya se ha dicho asimismo que los microorganismos m§s peligrosos en este campo son

las esporas de "Clostridium botulinum".

ESTERILIZACION POR CARGAS

Considérese un volumen de l!quido conteniendo células o esporas en suspensi6n

que se calienta hasta la temperatura de diseno. Para estudiar la relaci6n tiempo-

temperatura hay que tener en cuenta la ecuaci6n cinética de muerte térmica:

dN [ 1]
-dt=kN

Pero la constante cinética no es realmente constante en la esterilizaci6n por car-

gas, lo que se debe a que la temperatura va variando tanto durante el calentamien-

to como durante el enfriamiento. Por ello la integraci6n de la ecuaci6n [ 1] conduce

a: t
N
o
'V
total = ln -N = A JO e-E/RTdt [ 12}
"41111

El s!mbolo 'V total representa el criterio de diseño del proceso de esteriliza-

16
ci6n, que generalmente es un dato (asr, si se impone N /N = 1O será 'V total =
0
16
In 10 = 36,8). Pero en un ciClo de esterilizaci6n por cargas, las etapas de calen-
tamiento, permanencia y enfriamiento contribuyen a la eliminaci6n de los microor-

ganismos, y no s6lo la de permanencia, es decir:

In ~o = In [ ~o . ~1 • ~2 ] . [ 13]
calentérnento resi~ia enfriarrúento
siendo N el número total de contaminantes después de calentar hasta la tempera-
1
tura de esterilizaci6n, N su número después de la permanencia a dicha temperatura
2
y N su número total después de enfriar desde la temperatura de esterilizaci6n hasta

la de utilizaci6n (fermentaci6n, por ejemplo). La expresi6n [ 13] se resume de la for-

ma:

'V T ota 1 = 9c a 1entamtento

. + 9 R est'd encta
. +'V E n f namtento
. . [ 14]

La evaluaci6n de las tres contribuciones se realiza de la siguiente manera:

t 1 -E/RT
e dt [ 15]
'V Calentamiento
Jo
 N1 t2 e -E/RT dt
íJ Residencia = ln N= A [ 16]
2
Jt1
t3 e -E/RT dt [ 17]
íJE n f namiento
. .
Jt2
donde t , t y t representan, el tiempo de calentamiento, de residencia y de en-
1 2 3
friamiento, respectivamente.

La ecuación [16] no tiene problema de integración, ya que la temperatura

permanece constante durante el tiempo de residencia, con lo que la contribución de-

bida a la residencia es de obtención inmediata. Sin embargo, para integrar las ex-

presiones [15] y [17] es necesario conocer el perfil temperatura-tiempo durante el

calentamiento o enfriamiento, que depende de un cierto número de factores: inyec-

ción de vapor directo, serpentines o camisas de calefacción, calentamiento eléctrico

o combinación de estos métodos. También son par~metros importantes a considerar

la viscosidad del medio, cantidad de sólidos en suspensión, presencia de sustancias

insolubles (aceites vegetales, por ejemplo), etc.

Deindorfer y Humphrey ( 1959) han deducido los perfiles temperatura-tiempo

para cada tipo de calentamiento o enfriamiento que, junto con los parámetros ciné-

ticos de muerte térmica, se pueden sustituir en las ecuaciones [ 15] y [ 17], posibili-

tando el c~lculo de las contribuciones de las etapas primera y tercera a la destruc-

ción de los microorganismos contaminantes. Estos perfiles se muestran en la Tabla 4.

Un perfil típico temperatura-tiempo para operaciones de fermentación a esca-

la industrial se representa en la Figura 7 (el ciclo completo dura generalmente en-

tre 3 y 5 horas).

Con el fin de tener una idea de la contribución de cada uno de los términos

en la esterilización total, se pueden dar como valores típicos los siguientes:

íJ Calent. íJ Resid. ílEnfriam.

= 0,2 = o, 75 = 0,05 [ 18]
íJ Tota 1 íJ Total íJ Total
 Tabla 4
Perfil de temperaturas en esterilización por cargas (Deindorfer y Humphrey)

Tipo de calentamiento Perfil Parámetros

o enfriamiento temperatura-tiempo

h S
a=-~~-
MT e
at o p
Vapor directo T = To( 1 + 1 + bt) S
(hiperbólico) b =M

Vapor indirecto -at

T = TH(1 + be )
(cambiador de calor) (exponencial)

g
Calentamiento eléctrico T = To (1 + at) a = -=='"--
MT e
o p
(lineal)

WC' U A
Enfriamiento --12.-,
a = Me (1-e WC P )
-at
(cambiador de calor) T = Tco (1 + be ) 1?y - T
(exponencial) o co
b = T
co

T temperatura a cualquier tiempo (K)

T temperatura inicial del medio (K)
o
t tiempo (min)
h entalpía del vapor relativa al medio (kcal/kg)
S caudal másico de vapor (kg/min)
M masa del medio (kg)
ep capacidad calorífica del medio (kcal/kg.K)
TH temperatura de la fuente de calor (K)
u coeficiente global de transmisión de calor (kcal/m 2min.K)
A superficie de transmisión de calor (m 2 )
q caudal de calor transferido (kcal/min)
C' capacidad calorífica del refrigerante (kcal/kg.K)
p
T temperatura de entrada del refrigerante (K)
co
w caudal másico de refrigerante (kg/min)
 T (C)

150
Re si den ci a
1 1

100

50

o
o 100 200 t (min)

figura 7

Se observa que la etapa de enfriamiento tiene pequeña contribuci6n al ciclo

total y que la mayor importancia la tiene la porci6n correspondiente a la permanen-

cia.

Por lo general deben evitarse ciclos de calentamiento excesivamente largos,

no s6lo por razones econ6micas y porque existe el peligro de destrucci6n de nu-

trientes, sino porque también se pueden originar sustancias potencialmente inhibido-

ras para la posterior fermentaci6n •.

Aplicaciones de la esterilizaci6n por cargas

Una importante aplicaci6n de la esterilizaci6n en régimen no estacionario es

la destrucci6n de microorganismos t6xicos en alimentos envasados (cerveza, leche,

etc), donde se puede considerar la existencia de una geometría particular. Se trata

de resolver un problema de transmisi6n de calor en régimen no estacionario, distin-

guiéndose dos casos, según el recipiente contenga un líquido o un s6lido.

 a) El recipiente contiene un lfguido

Se puede admitir mezcla completa en el lfquido, originada por la convección

o por la propia agitación mec§.nica que se provoca al esterilizar el recipiente, con

lo que se puede asimismo formular la relación:

Calor transmitido a través de

[ las paredes del recipiente
l =[ Aumento de energía térmica
del recipiente
l
es decir:
U A (T - T) =m C ..QT [ 19]
m p dt

donde:

m : masa del recipiente

C : calor especifico del recipiente '11111111
p
A : §.rea de transmisión de calor (área del recipiente que se est§. esterilizando.
T m: temperatura del medio de esterilización
U : coeficiente global de transmisión de calor

La integración de la ecuación [ 19], suponiendo que el recipiente tiene una

temperatura inicial T. (a t
1
= O), dar§.:

UA
me p [
- ln (T m - T) l
T
Ti
[20]

operando:
UA
- -- t
T = T m. - (T
m
- T.) e
1
mC p [21] ..,

que permite calcular la temperatura en el interior del recipiente al cabo de un

tiempo t, conocidos el resto de los parámetros.

El cálculo se puede llevar a cabo de la forma siguiente:

12) Se fija un tiempo t y con ayuda de la ecuación [21] se calcula T.

22) Con la ecuación de Arrhenius, [4], se calcula k.

32) Este cálculo se repite agregando un cierto incremento al tiempo. A cada

intervalo de tiempo se calcula el valor medio de k por la expresión:

[22]
 42) Se calcula ahora la relación N /N para la ecuación [3], correspondiente
o
a la cinética logar!tmica, y se compara con el valor deseado (dato de diseño). Se
.
da por finalizado el cálculo cuando N /N iguale o supere el valor deseado:
0

t t
o
= o t
o
+ f¡t t
o
+ 2 ll t t
o
+ n ll t

T T.1 Tl T2 Tn
k k¡ k¡ k2 kn
k k¡ 1<2 k
Y2
N /N 10
o

'-' b) El recipiente contiene un sólido

En este caso la temperatura varfa con el tiempo y la posición, siendo la

ecuación que describe este fenómeno la siguiente:

dT
[23]
dt

siendo:
K
a =e
p p
[24]

donde K es la conductividad calorHica.

La ecuación diferencial [23] se ha integrado para ciertas geometr!as y sus

resultados se pueden obtener de los gráficos de las Figuras 8, 9 y 10. En estos grá-

ficos:

Tm - T at K X
y =
Tm - T.1 X =-2
X¡
m
= l1Xi n =-
xl
[25]

El parámetro y se denomina "temperatura residual adimensional". La te mpe-

ratura residual de un objeto infinito es igual al producto de las temperaturas resi-

duales de los correspondientes objetos infinitos que forman por su interacción el co-

rrespondiente objeto finito. As!, para el caso de un cilindro de longitud finita (lata

de conservas, por ejemplo):

~
Tm - T Tm - T
= [26]
Tm -T.1 cilindro Tm -T.1 cilindro i
plano
finito infinito infinito
figura 8
Figura 9
 l. O....--r---:-----,:--:---:-----r----r----r-"7'"":---r--------,

figura 10
 Con la expresión [26] se puede determinar T en cualquier punto del cilindro

finito y a cualquier tiempo. Ordinariamente se determina en el centro (punto m§.s

alejado para la transmisión de calor, n = O) y una vez determinada la temperatura

T en el centro térmico a un tiempo t , el resto de los cálculos se verifica como

1
se indicó en el apartado anterior.

ESTERILIZACION CONTINUA

La esterilización continua ofrece ciertas ventajas con respecto a la realizada

por cargas, entre las que cabe destacar:

1) Mayor factlidad de control

2) Reducción del tiempo correspondiente a un. ciclo de esterilización

3) Potencial incremento en el rendimiento en productos de la fermentación

Quizás la ventaja más importante sea la enumerada en tercer lugar, lo que

se debe a que la destrucción de nutrientes es mínima porque aquí se obtienen con

mayor facilidad temperaturas altas en tiempos cortos (HTST) a diferencia de la es-

terilización por cargas, que supone períodos relativamente largos de calentamiento

y enfriamiento.

El esquema de la figura 11 presenta una esterilización con inyección direc-

ta de vapor al medio a esterilizar, lo que supone una elevación casi instantánea de

la temperatura al valor previamente determinado.

Vapor

sin V!lvula
de exp.
Vac!o

"holding section"
enfriador
flash

Medio est6ril
figura 11
 El tiempo durante el cual el medio es retenido a esta temperatura viene de-

terminado por la longitud del tubo ("holding section") •. Luego se produce un en fria.-

miento instanténeo al pasar por una vélvula de expansi6n que comunica con un reci-
piente donde se ha hecho el vado.

El perfil temperatura-tiempo para el dispositiv~ de la Figura 11 se muestra

en la Figura 12, déndose unos valores numéricos a título orientativo.

T 2-3 min.

140 e

37 e
~

t
Figura 12

Otro tipo de esterilizador contínuo es el que utiliza un cambiador de calor

de placas, muy frecuentemente empleado en industrias de fermentaci6n, y cuyo es-

quema se muestra en la Figura 13.

Medio
est~ril
vapor

,_ 1
\

"holding section"
medio sin
Agua ester.
refrig.

Figura 13
 Las placas calentadas con vapor aumentan la temperatura del· medio a esteri-

lizar, que se mantiene a una temperatura elevada durante un cierto tiempo y luego

se enfr!a en la otra secci6n del cambiador. Aunque el tiempo necesario para calen-

tar y enfriar el medio es mucho mayor que para el sistema de inyección directa

de vapor, visto antes, la contribución de estos intervalos al ciclo de esterilización

es mucho menor (alrededor del 1 al 2 %) que en el caso de la esterilización por

cargas.

El perfil temperatura-tiempo para este caso se muestra en la figura 14.

figura 14

En el diseño de esterilizadores continuos constituídos por tubos es importante

considerar que no todas las porciones del medio emplean el mismo tiempo en pasar

por la zona de calentamiento del esterilizador, lo que se debe a que tanto en flujo

laminar como en fluJo turbulento la velocidad media del fluído, v, es función de la

distribución radial de velocidades (para régimen laminar, v = 0,5 umáx; para régimen

turbulento, v =. 0,82 u á ). En cambio, si se trata de flujo de pistón, el tiempo

m x
medio en la zona de calentamiento es exactamente igual al tiempo de exposición

al calor en todas las porciones del medio, lo que hace más fácil calcular la longitud

de la zona de calentamiento requerida para dar un determinado nivel de esterilidad.

Sin embargo, en la práctica es dif!cil obtener el flujo de pistón y se hace

necesario predecir la distribución de tiempos de residencia, lo que es complejo Y

hace recomendable su determinaci6n experimental.

Para ilustrar la importancia de la distribuci6n de tiempos de residencia en

el cálculo de la esterilizaci6n contfnua, se ofrecen los datos de la Tabla 5, donde

se supone que la zona de calentamiento se mantiene a una temperatura constante

a la cual k (constante de velocidad de muerte térmica de los microorganismos) es

1
igual a 10 s - y el tiempo medio de residencia (longitud de la zona de calentamien-

to dividida por la velocidad media, v) se supone constante e igual a 5 s.

Tabla 5

Efecto de la distribuci6n de tiempos de residencia en los resultados

obtenidos en un esterilizador continuo

Valores de N/N
o
k (s - 1) TR (s) Pe{*) flujo de pist6n Datos experimentales

22 10-18
10 5 200 1 '8. 10-
22 1,5.10- 16
10 5 100 1,8.10-
22 3.10-15
10 5 70 1 '8. 10-

5 22 2.10-13
10 50 1'8. 10-

(*) Las cesviociores del flujo cE pist6n se ¡x.¡ecBt expresar por el rrtSdulo de Feclet, Pe,
de tal rmnera que para flujo de pist6n, Pe =oo , y para rrezcla carpleta, ~ = O.

De la Tabla 5 se observa que, debido a la distribuci6n de tiempos de residen-

cia, la suposici6n de flujo de pist6n puede conducir a errores de muchos 6rdenes de

magnitud en la estimaci6n del nivel de esterilidad, que es significativamente más

bajo que el previsto para flujo de pist6n y tanto más, cuanto menor es el m6dulo

de Peclet.

Para adaptarse al comportamiento real se han propuesto varios modelos, uno

de los cuales es el "modelo de dispersi6n", en el cual, la desviaci6n del flujo de

pist6n está caracterizada por un coeficiente de dispersi6n axial, y se estudiará a

continuaci6n.
 Aplicación del modelo de dispersión

Considérese una longitud diferencial de un esterilizador contfnuo, dx, de sec-

ción circular uniforme, por donde circula el medio que contiene las células (figura

15). Los microorganismos entran por transporte másico y por dispersión (originada

por un gradiente de concentración) y dentro se verifica la muerte térmica, con lo

que los microorganismos que no han llegado a inactivarse saldrán por los mismos

mecanismos indicados (transporte másico y dispersión).

.. ~ ~ :
Fntradapor Salida por
Transporte mas1co
dx Transporte másico
Fntrada por
Gradiente de concentración Salida por
Gradiente de et::JOCentración

Figura 15

El balance de materia (como microorganismos) en estado estacionario, tenien-

do en cuenta que no existe acumulación, proporciona lo siguiente:

Transporte mfisico: FN (nº/tiempo)

ENTRADA
f Gradiente de concentración: - D
z
S(dN)
dx x
(nº/tiempo)

Transporte másico: FN + dFN (nº/tiempo)

SALIDA
\. f Gradiente de concentración: D S(dN)
z dx x+dx
(nº/tiempo)

GENERACION - k N S dx (nº/tiempo)

donde:

N número de microorganismos por mi

2
D : coeficiente de dispersión axial (cm /s)
z
x dirección axial (cm)
1
k constante cinética de muerte térmica de los microorganismos (s- )
S sección del tubo (cm 2¡

Por tanto:

f N - O z S (d;x )x - k N S dx = [27)
Desarrollando en serie de Taylor con aproximación de segundo orden:
2
dN dN d N [28]
(dx )x+dx = (dx )x + dx2 dx + • • •

la expresión [27] queda de la forma:

2
dN d N [29]
D
Z
S (ddN ) - k N S dx
X X -
=- D z S (d x )x - D z S dx2 dx + dF N

Pero:

n2 2 cm
FN =N ~ ) • S (cm ) • v (-g [30]
cm
siendo v la velocidad media. Diferenciando [30] teniendo en cuenta que S y v son

constantes:

dFN = V S dN [31] ..;

LLevando [31] a [29], dividiendo por (S.dx) y reajustando, queda:

2
d N dN [32]
D--v--kN=O
z di
dx

Ecuación diferencial de segundo orden no lineal que se puede resolver poniéndola en

forma adimensional, para lo quese utilizan los siguientes módulos adimensionales:

- N
N =N concentración adimensional de microorganismos
0
V L
Pe = módulo de Peclet (de Bodenstein o de dispersión)
0 z
X
x = 1. dirección axial

Da = k L módulo de Damkohlder (o de reacción)

V

siendo L la longitud del esterilizador y N la concentración de microorganismos a

o
la entrada (n2/cm ).
3

Con estos valores, la ecuación [32] se puede escribir nuevamente de la forma:

d~
- -2
dÑ [33]
- Pe - - Pe Da N = O
dx dx

Ecuación que se ha podido resolver para N, obteniéndose la siguiente expresión:

[34]
 donde: ..
4 Da
ó =1 1 +--
Pe [35]

La ecuación [34] indica que la concentración de microorganismos a la salida

del esterilizador se puede obtener si se conoce el módulo de Peclet y el de Dam-

kohlder.

Para el caso particular en el que el medio circula en un régimen que se

aproxima al flujo de pistón (Pe ---+ oo ), se puede demostrar que la ecuación [34] se
reduce a:
2
N D
~ ) = exp(- Da + --ª- ) [36]
No x=L Pe

S~n embargo, como ya se ha dicho anteriormente, lo más corriente es que el módulo

de Peclet esté comprendido entre O e oo.

Debido a que la ecuación [34] es de uso engorroso, para su utilización en el

cálculo, Aiba y cols. la han resuelto gráficamente, presentando un resultado como

el que muestra la figura 16.

En la figura 16 se representa el nivel de esterilización, N/N frente al mó-

o
dulo de reacción, k.L/v, para distintos valores del módulo de Peclet, v.L/D . Para
z
utilizar el gráfico es necesario conocer: k, v, L y Dz.

Valores de k existen en la bibliografra para la inactivación térmica de espo-

... ras resistentes. La velocidad. media y la longitud de la zona de calentamiento son

parámetros físicos que se pueden especificar según el proceso de fermentación que

vaya a tener lugar. finalmente, para obtener el valor de D necesario para el cál-
z
culo del módulo de Peclet, Levenspiel ha publicado valores de coeficientes de dis-

persión axial para flufdos que circulan por tubos bajo diferentes condiciones hidrodi-

námicas.
 10"'1:=ft:t:'~~\~\~~~+~\t==F==I=="=1"~=t===t===t==t
\ \ \ \ \ \.
1\ \ \ \ "

\ \ \ 1\ \ \

-
z
z \ \\ \ 1 '\

\ \ \ \ \ \
IQ-11~~\ S\~1~~\\$:::\~$=~1\$$~
a='
\ \ \ \ 1\ \ 1\ \
¡'\ \ \ \ \ \
to···~~a1 ft=El=~\\~\
\ 1\ \ \
1
=t: \a~\a.:=EE'\~,
\ \
s
\\ \ \\ 1\1 1 ro.

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

N,(= k~)

Figura 16
BIBLIOGRAFIA

AlBA, S. y cols.; "Biochemical Engineering", 2ª ed., Academic Press, New

York (1973).

BAILEY, j.E. y OLLIS, D.F.; "Biochemical Engineering Fundamentals", McGraw

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QUINTERO, R.R.; "lngenierla Biogulmica", Alhambra, México (1981).

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WANG, D.I.C. y cols.; "Fermentation and Enzyme Technology", john Wiley and

Sons, New York (1979).

 TEMA 7
TIPOS DE FERMENTADORES
 1

j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
'Wij
j
j
j
j
j
j
j
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j
._,j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
J
 TIPOS DE FERMENTADORES

INTRODUCCION

De manera similar a lo que ocurre en el resto de la industria química, los

fermentadores utilizados depender§n de las características del sistema a tratar y

de la capacidad de producci6n que se desee alcanzar.

Se debe tener en cuenta que los microorganismos contienen gran cantidad de

agua (60 a 95 %), por lo que su densidad difiere poco de la del agua, lo que indica

que es necesario poco arrastre hidrodinámico para mantener a los gérmenes en sus-

pensi6n, logr§ndose con facilidad la aproximaci6n a "mezcla completa" por simple

agitaci6n o por burbujeo de un gas a través del fermentador.

FERMENTADORES AGITADOS

Los cultivos superficiales presentan escaso rendimiento, por lo que la econo-

mía del proceso y la velocidad de producci6n requerida hacen que el reactor más

utilizado para procesos bioquímicos sea el tanque profundo agitado, tanto en su mo-

dalidad por cargas como contínua. Las principales razones que han llevado a su

adopci6n son:

- Gran versatilidad

- Homogeneidad en toda la masa de reacci6n

- Fácil control

Fermentador por cargas

El dispositivo básico del fermentador por cargas se ilustra en el esquema de

la Figura l. Consiste en un vaso cilrndrico que debe tener buena agitaci6n que, de

acuerdo con lo dicho, puede aproximarse mucho a las condiciones de mezcla com-

pleta; presenta también un fácil control del pH y de la temperatura, para lo que

dispone de una camisa exterior suplementada, en ocasiones, por serpentines interio-

res.
 i nócu lo -------.,¡

1 entrada de vapor o,
salida de agua

~= ;-salida
_ nivel

pantalla deflectora

camisa-
, entrada de agua

cvndensado------------

figura 1
La energia calorrfica procede principalmente de:

- Calor de reacción
- Energia disipada por el agitador

- Energia disipada por el aire al pasar a través del medio liquido

Existen muchos tipos de agitadores y la selección se basa en la correlación

de datos para sistemas semejantes en escala planta piloto. Sin embargo, las interac-

ciones entre las fases fluidas y los microorganismos son tan complejas, que el uso
de tales correlaciones no es siempre satisfactorio, especialmente cuando se basan
en la semejanza geométrica y en el mantenimiento de la potencia aplicada por uni-

dad de volumen de fluido. Para el caso de cultivos de mohos o de bacterias fila-

mentosas pueden aparecer acusados cambios en las propiedades reológicas del siste-
ma durante el curso de la fermentación.
 La esterilización del medio, recipientes, etc., se suele lograr, a escala indus-

trial, por medio de vapor, pero el aire se suele esterilizar por la elevada tempera-

tura que se genera en el compresor, seguida por el paso a través de filtros adecua-

dos.

En ocasiones es necesario impedir la formación de espuma, que aparece

cuando algunos de los metabolitos producidos son tensoactivos. Tales espumas alte-

ran el funcionamiento del fermentador, disminuyendo su volumen útil y obligan a

disminuir la velocidad de transferencia de oxigeno. Para impedir ésto se suelen aña-

dir antiespumantes (aceites, alcoholes de alto peso molecular, siliconas, etc.) que

en. el caso de ser metabolizables no necesitan de su posterior separación, aunque

será· necesario utilizar grandes cantidades durante el periodo de fermentación.

El tipo de fermentador que se viene comentando supone la existencia de par-

t!culas biológicas en suspensión; pueden ser células aisladas, pero en la mayor parte

de los casos son agrupaciones celulares o "flóculos". Tanto en un caso como en el

otro, en lo que sigue siempre ser§.n denominados flóculos.

Fermentador continuo tanque agitado (F.C. T.A.)

Hace más de 30 años, Monod concibió la idea de alterar el sistema disconti-

nuo suministrando continuamente nutriente fresco al cultivo bien agitado, a la vez

que se extraia una corriente conteniendo células y productos, llegándose a un estado

estacionario tal que la concentración de células, la velocidad especHica de creci-

miento y las demás caracteristicas del cultivo no cambiasen con el tiempo.

Considérese un fermentador por cargas donde se está obteniendo un determi-

nado producto y se ha llegado a la fase de crecimiento exponencial (máxima veloci-

dad de formación de masa celular y de producto, en su caso). Si ahora se extrae

del fermentador una cantidad de células y de producto igual a la velocidad de pro-

ducción y se alimenta con una cantidad de nutrientes igual a la que desaparece en

el mismo tiempo, es evidente que el sistema comenzará a operar en estado estacio-

nario.
 ,....__----<~
Salida
de aire
r-n-1 !Controladnlr
d~ pH T
'---¡
Reserva
de ácido

r-----""
1
Filtro
de aire
r----1 Filtro
----, 1---¡ ~------..
.__... 1
de aire
1

' ¡ : 1

r---~
1 ' ;
Bomba de r--"1
1 ! 1
alimento
1 1

! 1 1 Y. efluente RotámetrlJ
Reserva
de medio
estéril Aire
•
1

Agitador comprimido
magnético ____ j
Figura 2

r----
1
-1 Controlador de la bomba ~-----------------.1
•
1
1

Salida
Medio ~--------~~ de aire
estéril
Bomba de r------.~~ Rebosadero
alimentación
i
- 1
Señal de control de 1
retroalimentación del
la bomba de 1
alimentación
Aire ..¡ Filtro ~ 1
1
1
1
Volumen y
temperatura
constantes Luz 1 =: 0----J
Fotomultiplicadu,

Figura 3
 Aunque las condiciones indicadas se podrian mantener indefinidamente, existen

causas que lo impiden, principalmente:

1) Los contaminantes accidentales que son aqui muy frecuentes, pues el me-

dio proporciona condiciones óptimas

2) La presencia de mutantes que, en ocasiones, afectan seriamente a los ren-

dimientos obtenidos

El reactor en si mismo es esencialmente igual al que ya se vió para la fer-

mentación por cargas, diferenciándose básicamente en la existencia de las corrien-

tes que continuamente entran y salen. En la práctica se han utilizado dos varian-

tes: el "quimostato" y el "turbidostato". Un esquema del primero se presenta en la

Figura 2, mientras que el segundo se muestra en la Figura 3.

Los componentes esenciales del quimostato son los que determinan:

- Volumen constante del recipiente

- Dispositivo de alimentación (bomba)

- Reserva de medio estéril

Aireación (flujo de aire constante)

- Además, es deseable que el pH y la temperatura sean controlados

El medio se elabora de tal forma, que todos los nutrientes, excepto uno de

los esenciales, estén en exceso respecto a la concentración celular o producto de-

seado. El nutriente limitante controla la población celular en estado estacionario

y, como cualquier nutriente se puede utilizar como limitante, el sistema presenta

una gran flexibilidad para el estudio de la fisiologia de los microorganismos que se

desarrollan.

El turbidostato es un aparato similar al anterior, sólo que el control de la

concentración celular se mantiene mediante medidas de la densidad óptica. Su es-

quema se muestra en la Figura 3.

Cuando la densidad óptica se eleva por encima de cierto valor, la bomba se

activa y se alimenta medio fresco al tanque. Puesto que el volumen se mantiene

constante por medio del rebosadero y el sistema está completamente mezclado, el

resultado es que el cultivo se diluye, extrayéndose algunas células del reactor. A

pesar de su aparente simplicidad, el turbidostato no es muy usado debido a la difi-

cultad del control de la concentración celular.

Los sistemas cont!nuos que m§s éxito han obtenido son aquéllos que emplean

levaduras o bacterias donde el producto deseado es biomasa o metabolitos primarios

(compuestos que forman el "inventario qu!mico" de una célul~, por ejemplo, enzimas

y amino§cidos) o productos asociados con el mecanismo de crecimiento o de pro-

ducción de energ!a:

- Obtención de levadura de cerveza

- Obtención de prote!na celular

- Producción de cerveza (Alemania, Canad§, Australia)

- Tratamiento de aguas residuales

En sistemas contrnuos tiene especial significación la naturaleza autocatal!tica

del crecimiento microbiano. Por otra parte, en ausencia de microorganismos no hay

conversión, por lo que es esencial retener cierta cantidad dentro del tanque; si el

caudal se incrementa sobre ciertos valores, entonces todos los gérmenes son arras-

trados y la conversión cesa: se ha producido el "lavado". Sin embargo, si los micro-

organismos se alimentan al fermentador simult§neamente con los nutrientes, se ha-

cen m!nimas las posibilidades del lavado. Para operar en estas condiciones se nece-

sita un flujo contrnuo de microorganismos de caracter!sticas tales que no alteren

las condiciones en el tanque, siendo la fuente lógica de los mismos el efluente del

fermentador, que contiene organismos y nutrientes en las mismas condiciones .bio-

qu!micas y fisiológicas que las que existen en su interior. Dicho efluente se puede

pasar por una centr!fuga o a un tanque de sedimentación con el objeto de obtener

un concentrado celular para recircular.

Dentro del sistema cont!nuo se utilizan también fermentadores en serie, como

se representa en la Figura 4.

Aunque el F.C.T.A. opera a altas conversiones de sustrato y, en consecuen-

cia, las pérdidas de éste en la corriente de salida no son significativas, la coloca-

ción de tanques en serie (suministrando cantidades adicionales de sustrato a cada

uno), resuelve el problema del "lavado" e incrementa la productividad a pesar de

que el caudal se va incrementando en la dirección del flujo.

figura 4

El sistema de tanque múltiple es particularmente útil cuando en el proceso

equivalente por cargas es necesario variar las condiciones en el curso de la fermen-

tación.

FERMENTADORES TUBULARES

En el interior del fermentador, las células pueden existir en dos configuracio-

nes geométricas distintas:

a) Libremente suspendidas

b) Adheridas a la superficie
Como ya se ha comentado, los microorganismos, cuando est§n libremente sus-

péndidos se suelen agrupar formando fl6culos de tamaño muy superior al de una

simple célula. Los factores que influyen en este fenómeno no se conocen bien, pero

lo que sl se sabe es que se puede intensificar por adici6n de agentes floculantes

(por ejemplo, sulfato o cloruro de aluminio) no debiendo olvidarse que, bajo condi-

ciones similares, ciertas especies presentan mayor tendencia a formar fl6culos que

otras, lo que se ha utilizado con fines taxon6micos.

Por otro lado, los microorganismos pueden adherirse a una superficie inerte
desarrollando una pel!cula biológica que la cubre y cuyo espesor depender§ de fac-
-----------------------

tores similares a los que contribuyen a la formaci6n de los fl6culos.

El comportamiento del fermentador por cargas o el F.C.T.A. ya vistos, est§

determinado fundamentalmente por la existencia de fl6culos. Por el contrario, en

un fermentador tubular, la existencia de f16culos o de peltculas depender§ de la

configuraci6n y de los caudales.

Sup6ngase el fermentador tubular con parttculas s6lidas de tamaño similar

(Figura 5).

o
o
o o
o
o 0 o
o o
o o o o o
o o o o
o 0 o -o o
o o o
o o o o
00 oo
o
ooo o o o
o
o o o
o

Lecho fijo Lecho fluidizado Elutriación

Figura 5

Si el liquido circula a bajos caudales, se tiene la disposi~i6n denominada de

"lecho fijo". Cuando se aumenta el caudal, aumenta también la pérdida de presión

y cuando ésta llega a ser igual al peso del lecho por unidad de sección, las partf-

culas aparecen suspendidas, obteniéndose el "lecho fluidizado", existiendo un interva-

lo de presiones que lo pueden crear. Finalmente, si se incrementa aún m§s el cau-

dal, la cafda de presi6n producir§ el arrastre del s6lido ("elutriaci6n").

Para la disposici6n que se estudia, si se tiene en cuenta que los fl6culos tie-

nen una densidad muy parecida a la del fluido, se puede descartar la primera situa-
ci6n.
 El caso m§s frecuente es el tercero, donde los fl6culos son arrastrados por

el ltquido, siendo necesario el suministro cont1nuo de microorganismos a la base del

fermentador, lo que se puede lograr con una corriente de recirculaci6n (figura 6).

Separador
-
~----------Producto

--
o o
O o Microorganismos
o o
recirculados
o
o o
o o
000
oo
o o

Figura 6

Cuando se tiene una pel1cula microbiana fija, el fermentador tubular no pre-

senta los problemas de lavado que aparecen con los fl6culos. La disposici6n m§s

conveniente es aquélla que permite a la peltcula desarrollarse sobre superficies de

part!culas inertes (soporte) dispuestas, bien en lecho fijo, bien en lecho fluidizado.

La elecci6n depende del tipo de crecimiento de los microorganismos.

Para el caso de lecho fijo, la fase ltquida cae por gravedad en forma de pe-

11cula y si se trata de un sistema aerobio, la fase gaseosa es continua y pasa como

resultado de la convección natural originada por el car§cter exotérmico de las re-

acciones microbiol6gicas. El comportamiento de este reactor est§ tntimamente liga-

do al valor del §rea interfacial y sus condiciones ser§n no estacionarias en el sentí-

do de que la composici6n varia de un momento a otro.

 Procesos con microorganismos adheridos superficialmente a un soporte se uti-

lizan industrialmente en el tratamiento de aguas residuales con el nombre de "fil-

'
tros percoladores" (el nombre de filtro quiz~ no sea muy adecuado, pero se puede

argumentar en su favor que la pel!cula microbiana filtra los sólidos tanto org~nicos

como inorg~nicos suspendidos en el agua). La materia org~nica es metabolizada y

el producto obtenido contie_ne compuestos oxidados muy simples: co 2, No;, as! co-
mo microorganismos adicionales. Los "filtros percoladores" vienen a ser una imita-
ción de los procesos naturales que ocurren en el suelo.

En los fermentadores de lecho fluidizado que utilizan flóculos (generalmente

de distinto tamaño) se debe considerar el incremento de porosidad al ir desde el

fondo hasta el tope del reactor. La porosidad representa también una medida del

tiempo de residencia de las células.

En la Figura 7 se puede observar que al desplazarse hacia el tope, se incre-

menta la porosidad, disminuyendo el tiempo de residencia.

(/)
o
E
(/)

-~lOO
~
00
....
o
o
....
u -o
·~ ,......... ~
E~ -o
'-" ·~
(/)
o
....
=
•O o
o..
·~
u
=
(J,)
.._¡

~ 0~----------------------~
Base Tope

Figura 7
La velocidad del 11'quido ha de ser reducida tanto para lograr la conversión
adecuada como para evitar que se produzca el arrastre de los microorganismos, co-

sa que se asegura mejor por medio de un ensanchamiento en la parte superior que

disminuye la velocidad ascensional y favorece la sedimentación de los flóculos que

llegan hasta all1'.
 El fermentador tubular de lecho fluidizado (fermentador de torre) se ha uti-

lizado principalmente para la fabricación continua de cerveza.

BIBLIOGRAFIA

ATKINSON, B.; "Biochemical Reactors", Academic Press, London (197 4).

BAILEY, J.E. y OLLIS, D.F.; "Biochemical Engineering Fundamentals", Mc-

Graw Hill, New York ( 1977).

BLAKEBROUGH, N. (ed.); "Biochemical and Biological Engineering Science",

2 vols., Academic Press, New York (1967-68).

QUINTERO, R.R.; "Ingenierfa Bioguimica", Alhambra, México (1981).

WANG, D.I.C.; "Fermentation and Enzime Technology", John .Wiley, New York

(1979).
--------- -------------
 ..

TEMA 8
DISE~O DE REACTORES BIOLOGICOS. 1
 DISEr\10 DE REACTORES BIOLOGICOS. J.

INTRODUCCION

La Ingenierta del Reactor Biológico tiene como fin principal la explotación

económica de las propiedades sintéticas y degradativas de los microorganismos, sen-

tando las bases para diseñar los reactores bioqutmicos o fermentadores, an§logamen-

te a lo que hace la Ingenieri'a del Reactor Qutmico con respecto a las reacciones

qutmicas.
Los parámetros a determinar son an§logos: ast, para sistemas por cargas, se

debe determinar el tiempo de operación y el volumen de reactor y, para sistemas

condnuos, el tiempo de residencia o la velocidad de dilución. Sin embargo, el diseño

mecánico ha de ser m§s elaborado para evitar la contaminación, especialmente en

lo que respecta a los sistemas continuos.

Similarmente a lo que ocurre en las reacciones quimicas, es necesario el co-

nacimiento de las expresiones cinéticas, que aqui son mucho más complejas, y los

avances m§s significativos se han logrado desde que se han propuesto modelos ciné-

ticos simplificados que permiten predecir el comportamiento del sistema con ayuda

de un pequeño número de par§metros susceptibles de determinación experimental.

SISTEMA CONTINUO DE TANQUE UNICO

Para un tanque de volumen efectivo V, admitiendo mezcla completa, un ba-

lance de biomasa conduce a (Figura 1):

F F
X
o
.._ - -v X
S S
o

V eo

Figura 1
 V dX = [1]
dt
donde:
X: concentraci6n de biomasa (g/1)

F: caudal volumétrico (1/s)

r : biomasa producida en el tanque por unidad de volumen y unidad de tiem-

x
po (g/l.s)

Si se dividen ambos miembros de la ecuaci6n [1] por V y se introduce la

"velocidad de diluci6n":
D = F/V [2]

que viene a ser el valor rec!proco del tiempo espacial (número de volúmenes de .,¡¡1

fermentador que pasan a través del mismo en la unidad de tiempo) y, por otro la-

do, se expresa r en la forma usual:

X
rX = ll X [3]

siendo ll la velocidad espec!fica de crecimiento, queda:

dX
dt = D(X 0 - X) + ll X [4]

que, para régimen estacionario y alimentaci6n estéril, se reduce a:

O = (l.l - D)X [5]

ecuaci6n que indica que una poblaci6n celular distinta de cero s6lo puede mantener-

se cuando el cultivo es capaz de ajustar su velocidad específica de crecimiento pa-

ra hacerla igual a la velocidad de dilución:

ll = D [6]

En caso contrario, el régimen estacionario se alcanzará cuando la concentración de

biomasa en el tanque sea cero:

X =O [7]

fenómeno que se conoce con el nombre de "lavado".

Análogamente, un balance de sustrato conduce a:

dS 1
dt = D(S
0
- S) - yu X [8)
siendo Y el factor de rendimiento de masa celular.
 La ecuación [8] para régimen estacionario y alimentación estéril ( l-1 = D) se

reduce a:

X = o
Y(S - S) [9]

ecuación que se podrra haber planteado sin balance, por la definición del factor de

rendimiento.

Como ya se ha visto, los modelos _propuestos para representar la cinética de

crecimiento de microorganismos, conducen a expresiones de la velocidad especffica

de crecimiento de la forma general:

l-1 = f(S) [ 10]

siendo S la concentración de sustrato limitante y apareciendo en la función f dos

o más parámetros cinéticos dependientes de la naturaleza del microorganismo y del

medio de cultivo, del nutriente limitante, asr como de las condiciones de operación:

temperatura, pH, etc.

En general, si los microorganismos disponen de concentraciones apreciables

de todos los nutrientes necesarios, es decir, ninguno de ellos es limitante del creci-

miento, la velocidad especifica de crecimiento será constante y máxima (fase lo-

garrtmica de crecimiento):

lJ = lJ m
[ 111

valor al que tienden las ecuaciones de la forma general [10] cuando S se hace muy

grande.

En estas condiciones, las ecuaciones [6] y [9] son independientes, el estado

estacionario sólo puede existir para una velocidad de dilución. igual a )..l m y las con-

centraciones de biomasa y sustrato en la salida no están determinadas, aunque sr

relacionadas entre sr de acuerdo con la ecuación [9].

Esta indeterminación ha sido comprobada experimentalmente para un cultivo

contínuo de "Bacillus lineus" no limitado por ningún nutriente, como se observa en

la Figura 2.
Una vez alcanzado el régimen estacionario, t , la concentración de biomasa
a
en la salida permanece constante, pero si en un momento determinado se sustituye
parte del medio de cultivo (nutrientes m§s células) del tanque por medio de cultivo

fresco estéril, tb y te, la concentración de la biomasa en la salida disminuye y

permanece constante en el valor impuesto.

lag
X

e¡
1
1• •••
1
1

t
a tb t
e
t .J

Figura 2

La indeterminación desaparece si un nutriente pasa a ser limitante y es pre-

ciso utilizar la ecuación [ 10], ya que entonces el sistema vendr§ regido por las ex-

presiones:
D = f(S) [ 12]

X = Y(S o - S) . [ 13]

con lo que, conociendo los par§metros cinéticos que intervienen en f(S), el factor

de rendimiento, Y, y las condiciones de operación, O y ~· la ecuación [ 12] de~er­

mina la concentración de sustrato limitante en la salida y la [ 13] la concentración

de biomasa.
Si el objetivo perseguido es la biomasa, la productividad vendr§ dada por:
Productividad = X.D [ 14]

que representa la biomasa producida por unidad de tiempo y por unidad de volumen

de fermentador.

Si el objetivo es un compuesto qufmico producido por el microorganismo, la

productividad depender§ del tipo de fermentación de que se trate; para el caso m§s
sencillo del tipo 1 de la clasificación de Gaden, en el que la formación de producto
est§. directamente relacionada con el consumo de sustrato, la concentración de pro-

dueto en la corriente de salida ser§.:

[' 15]

Productividad = P.D [ 16]

Como ya s.e ha visto, las ecuaciones de la forma general [10] indican que

u crece siempre con S, teniendo el valor límite u m· Por tanto, para una concentra-
ción de sustrato en la alimentación dada, S , el m§.ximo valor posible de la veloci-
o
dad específica de crecimiento ser§.:

[ 17]

con lo que, si se impone una velocidad de dilución superior a esa, no podrá nunca

cumplirse la ecuación [12], y el sistema tenderá a:

X = O S = So [ 18]

ya que la pérdida de microorganismos en la corriente de salida del fermentador es

siempre superior a su velocidad de generación en el interior del mismo. Este fenó-

meno de lavado del tanque, ya comentado, es característico de los reactores bioló-

gicos y supone una limitación importante para los mismos.

Aplicación de los modelos de crecimiento microbiano

Considerando las dos ecuaciones de la forma general [10] m§.s simples que

se han propuesto, de dos par§.metros:

Modelo de MONOD [ 19]

S ln 2
Modelo de TEISSIER )..I=Um[l-exp(- K )] [20]
S

se puede observar que el significado de los dos parámetros cinéticos, u y K , es

m s
el mismo en las dos ecuaciones:

)..lm: valor límite de )..1 cuando S crece

K
5
: valor de S para el cual )..1 = u m/2
 Las ecuaciones expl!citas para la concentración de sustrato en la salida ser§n:

D K
S
Modelo de MONOD S = D [21]
l..lm

K \.1m
__§_
ln(
Modelo de TEISSIER S = ln 2 1J m - D) [22]

y, por consiguiente, la productividad para biomasa:

MONOD [23]

Ks 1J m
TEISSIER X.D = Y.D[S - ~ ln(l..l _ D) [24]
o m

Dado que X y D varran en forma contraria, es decir, en general X disminuye

al aumentar D, es evidente que las ecuaciones anteriores pasar§n por un m§ximo

entre D =O y el valor critico de D dado por [ 17]. La condici6n de m§ximo se ob-

tendr§ cuando:
d[X.D] O [25]
dD =
que para el modelo de Monod conduce a:

Dópt = ~m(l - '~)

y~
[26]

y para el modelo de Teissier:

S 1n 2 1J m D,
o
K - 1n(---------D~,---) - opt = o [27]
S
1J m opt l..lm - D,opt

En la Tabla 1 se indican los valores de S, X y X.D en funci6n de O, previs-

tos por ambos modelos para un sistema caracterizado por:

-1
l..lm = 1,0 h y = 0,6
KS = 0,2 g/1 S
o
= 10 g/1

J Dcrit = (1)(10)/(0,2 + 10) = 0,98 h- 1

MONOD
l Dópt = (1)[1 - /0,2/(0,2 + 10)] = 0,86 h- 1
 = (1)[1 - exp(- 100~~ 2)] = 1,00 h-
1

TEISSIER -1
D,
opt
= 0,97 h

Tabla 1

Modelo de MONOD Modelo de TEISSIER

D (h-l) S X X.D S X X.D
0,25 0,067 5,960 1,490 0,083 5,950 1,488
0,50 0,200 5,880 2,940 0,200 5,880 2,940
0,75 0,600 5,640 4,230 0,400 5,760 4,320
0,86 1,229 5,263 4,526 0,567 5,660 4,868

"" 0,90
0,95
1,800
3,800
4,920
3,720
4,428
3,534
0,664
0,864
5,602
5,482
5,042
5,208
0,97 6,467 2,120 2,056 1,012 5,393 5,231
0,98 10,000 0,000 0,000 1,135 5,319 5,213
1,00 10,000 0,000 0,000 10,000 0,000 0,000

Los datos de la Tabla 1 se representan en la Figura 3, donde se puede ob-

servar que el modelo de Teissier supone una mayor constancia de X y de S (éste

no representado, aunque se puede ver en la tabla) hasta muy cerca de la velocidad

de dilución crítica.

En la Figura 4, correspondiente al cultivo contínuo de la especie bacteriana

"Aerobacter aerogenes" se observa que el comportamiento corresponde a lo previsto

por estos modelos, si bien en este caso, el modelo de Teissier representa mejor los

resultados.

Es interesante señalar, como se observa en el caso anterior, que dados los

-4 -1
pequeños valores de K (generalmente comprendidos entre 10 y 10 g/1), el valor
S

de Dópt est§. generalmente muy próximo al Ocrit' por lo que en la optimización

de un reactor biológico el problema de su estabilidad juega un papel fundamental.

 X Modelo de Teissier
6¡----~_..,.,...

o ~-----------r----------_.~-----------r----
0,0 0,5 1 ,o 1,5
velocidad de dilución
D (h- 1 )
figura 3

X S
(mg/1)

"Aerobacter aerogenes"
4 (según Herbert)

2
j

0,2 0,4 0,6 0,8

Figura 4
 Los datos de la Figura 5, obtenidos para "A. aerogenes", revelan una marcada

disminución de X cuando D disminuye, y un comportamiento similar se ha encontra-

'
do para la levadura "Torula utilis". Esta tendencia no est§ prevista en los modelos

considerados.

X
(g/1)
6

"Aerobacter aerogenes"
2

2 4 6 8 -1
D _(h)

figura 5

Esta desviación, para valores de O pequeños, que presentan los dos modelos

considerados, se debe a que ambos no tienen en cuenta el mantenimiento o metabo-

lismo endógeno, es decir, que las células consumen también energfa en procesos dis-

tintos de la bios'íntesis. Para ello habrfa que usar modelos de tres parámetros, como

el de Herbert, que supone consumo de masa celular en el mantenimiento o el de

Marr y Pirt, que suponen que el .sustrato se consume también en el mantenimiento:

HERBERT [28]

1 ¡.¡m S X
MARR Y PIRT (-r s) =Y K + S + K'X
e [29]
S

habiéndose partido del modelo básico de Monod en ambos casos.

Otro efecto que acentúa estas diferencias a D bajos es la no viabilidad de

algunas células, que tampoco se tiene en cuenta en los dos modelos simplificados

utilizados.
 En general, a D muy pequeños, la concentraci6n de sustrato también lo es,

y en estas condiciones es cuando influye més el mantenimiento y cuando la viabili-

dad fracciona! de la biomasa se aparta més de la unidad, por lo que la concentra-

ci6n de biomasa varia con D de la forma que se indica en la Figura 6.

o D Dcn.t.
'

Figura 6
D = O corresponderfa ~ la condici6n de equilibrio de una fermentaci6n por

cargas formada por una cantidad finita de biomasa con viabilidad cero.

Sin embargo, como esto~ dos efectos influyen poco a los valores de D de in- "111111

terés pr~ctico, el an§lisis realizado anteriormente puede considerarse cualitativa-

mente correcto.

SISTEMA DE TANQUES EN SERIE

Si se considera un sistema formado por N tanques en serie de igual tamaño,

V, a través de los cuales pasa un caudal volumétrico F, para la etapa n (Figura 7)

se tendr~ un balance de biomasa:

FX n [30)

o bien, dividiendo por V:

 DX
n- 1
+ ¡.¡ X
n n
= DX
n
[31]

de donde:
D
X = X [32]
n D- \.1
n
n-1

y, por consiguiente, para las N etapas:

[33]

F
X
n-1
-- ----u- - F
X
S
n
S n
n-1
111

er.a p a n

figura 7

La velocidad de diluci6n estará limitada para evitar que se produzca el lava-

do en el primer tanque, al que serían aplicables las ecuaciones obtenidas anterior-

mente. Por tanto, para una alimentaci6n estéril (X = O), D = u , y en consecuen-

0 1
cía:
N-1x
\.1 1 1
[34]

que indica que un sistema de N fermentadores en serie del mismo volumen s6lo es

estable si ¡.¡ es mayor que la velocidad específica de crecimiento en cualquier eta-

1
pa posterior, lo que suele ocurrir, dado que a lo largo de la cascada S disminuye.

Por otra parte, la limitaci6n del ca·udal para evitar el lavado es más drástica

que en el caso de un solo tanque de volumen VT, ya que si se compara éste con

una serie de N tanques de volumen V = VT/N:

Un solo tanque: D < Dcrit ="(S)

~ o
 N tanques: [36]

luego, el caudal deber~ ser N veces menor. Si N tiende a infinito, se producir~ la

aproximaci6n al fermentador tubular flujo de pist6n, y el razonamiento anterior in-

dica que se producirta el lavado para cualquier caudal de la alimentaci6n. En efec-

to, como se ver~ m~s adelante, el fermentador tubular flujo de pist6n no puede

funcionar con alimentaci6n estéril.

Adem~s, la productividad de un sistema de tanques en serie es menor que

la de un solo tanque, como era de esperar, dada la naturaleza autocatalttica del

crecimiento microbiano. El sistema de tanques en serie puede ser indicado para fer-

mentaciones complejas, en las que el producto que se desea obtener no est~ rela-

cionado directamente con el consumo de sustrato, como, por ejemplo, en la fabrica-

ci6n de penicilina, que requiere una primera etapa de desarrollo del micelio cuyas

condiciones 6ptimas son pH = 4, 7 y T = 30 2C, mientras que la etapa de produc-

ci6n del antibi6tico se verifica mejor a pH = 7,3 y T = 20 2C.

También tiene utilidad cuando se necesitan células en un estado fisiol6gico

determinado, empleando la primera etapa para conseguir una gran concentraci6n en

biomasa y ajustando el volumen de la segunda para conseguir la velocidad de crecí-

miento adecuada para obtener células con las caractertsticas deseadas.

Una situaci6n distinta se presenta cuando la cascada de tanques en serie se

alimenta, adem~s, con medio de cultivo fresco y estéril en cada etapa, de manera

que el caudal total va aumentando a lo largo de la cascada. Si se supone que todos

los tanques tienen igual volumen y que cada uno de ellos se alimenta con el mismo

caudal de medio de cultivo fresco, que es igual al del primero, se tendr~ para la

etapa n (Figura 8) el balance de biomasa:

F X
n-1 n-1
+ )J X V = F X [37]
n n n n
Por otra parte:

F n-1 = (n-1)F [38]

F F + F (n-1)F + F = nF [39]
n = n-1 =
 Llamando O a la velocidad de diluci6n correspondiente al primer tanque,

O = F/V:

nDX [40]
n
de donde
X = (n-1)D X [ 41]
n nD - J.l n-1
n
y, por tanto, para los N tanques:

[42]

Fn-~-------r------,
..----L--+----,
xn-1
sn-1 n
X
n
S
n
F
Xo =0
So etapa n

Figura 8

Puede comprobarse que este sistema es equivalente al tanque único, tanto

en productividad como en capacidad de tratamiento, por lo que representa ventajas

'-' apreciables con respecto al sistema de tanques en serie simple, puesto que permite

utilizar distintas condiciones sin pérdida de productividad.

TANQUE UNICO CON RECIRCULACION

Tanto la capacidad de tratamiento como la productividad de un reactor bio-

l6gico mezcla completa pueden aumentarse considerablemente mediante recirculaci6n

de biomasa, al mismo tiempo que esta recirculaci6n supone una inoculación continua

del reactor, que aumenta la estabilidad del sistema. Su esquema se muestra en la

Figura 9, donde:

a. : raz6n del caudal de recirculaci6n al caudal de alimentación

 e: factor de multiplicación de la concentración de biomasa (centrifugación

o sedimentación)

(l+a)F CONCENTRADOR
.
F
X =0
- - -d-- xl
DE
BIOMASA

o
S ob
o

F = aF
r

Figura 9
Un balance de biomasa alrededor del fermentador lleva a:
dX
(F/V)X
0
+ (a F/V)cX
1
+ ].l X
1
= (l+a) (F/V)X
1
+ dt [43]

Cuando se alcanza el estado estacionario con alimentación estéril:

[44]

de donde:
].l = D[l + a(l-c)] [45]

y mediante un balance de sustrato se obtiene para el estado estacionario:

Y(S - S)
o [46]
xl = 1 + a(l-c)

Si se tiene en cuenta que el denominador de esta expresión es menor que

la unidad, ya que e > 1, se observa que con la recirculación, D > ].l y que x1
aumenta con respecto al caso de no existir recirculación. Ambos efectos favorecen

la economfa del proceso. Naturalmente, si e = 1, la recirculaci6n no tendrfa ningún

efecto, como era de esperar, ya que se est~ considerando un reactor mezcla com-
pleta.

Todo lo dicho se puede observar m~s claramente considerando un caso con-

creto para aplicar las ecuaciones, lo que se muestra en la Figura 10.
 X X.D
(g/1) g/1. h)
A
10
Datos para el cálculo:
¡_¡ = 1 ,o h
-1
m
y = 0,5
K = 0,2 g/1
S
S = 10 g/1
S o
e =2
Cl. = 0,5

~------~----_.~------~----_.~----~ o
0,5 1,0 1,5 2,0 1
D (h- )

figura 10

Las curvas referidas al tanque con recirculación son:

A: concentración de biomasa en el interior del tanque

C: concentración de biomasa a la salida

B: productividad a la salida (X.D)

Las curvas para el caso en que no haya recirculación son:

D: concentración celular en el tanque y a la salida

E: productividad a la salida (X.D)

Se puede ver que la productividad se incrementa con la recirculación, puesto

que en este caso:

¡_¡ , f(S )
max o
. =
DcrJ.t 1 + a. (1-c)
=
[47]

El sistema no es fácil de obtener en el laboratorio debido a la dificultad en

la separación contfnua de la suspensión de células evitando la contaminación, por

lo que, excepto para el tratamiento de aguas residuales, se han descrito relativa-

mente pocos casos.

Se podrta pensar que el sistema ganarte en eficacia realimentando con célu-

las solas, pero desde el punto de vista pr~ctico es imprescindible que estén en sus-

pensión para que se mantenga su viabilidad.

FERMENTADOR TUBULAR FLUJO DE PISTON (F.T.F.P.)

Como ya se ha indicado anteriormente, en este caso la alimentación no pue-

de ser estéril, pudiéndose recurrir a la recirculaci6n, si bien en este caso, a dife-

rencia del F.C.M.C., el estado fisiológico de las células que salen es diferente de

la media dentro del tubo. Un esquema de este fermentador se muestra en la Figura

11.

(1 +a )F CONCENTRADOR
DE
xl BIOHASA

.. dV
~
dz
L

K A >

F =a F
r

Xr = cX
F 1
S
o
X =0
o

Figura 11
Dado que los medios de cultivo son siempre fases acuosas de densidad pr~cti-

camente constante, el F.T.F.P. se comporta exactamente igual que el fermentador

por cargas.
 Un balance de biomasa en dV dará:

AuX + r Adz
X
= Au(X + dX) + dX Adz
dt
[48]

que para estado estacionario se reduce a:

dX
u-= r [49]
dz x

o, teniendo en cuenta la definición de la velocidad, u:

u = dz/dt dz = u dt [50]

se puede poner:
dX
= r = 1-1 X [51 1
dt X

Suponiendo aplicable el modelo de Monod al f.T.f.P. (o al fermentador por

cargas):

dX 1-Im X S
dt = K + S [52]
S

o bien:

dS 1 1-1m X S
dt = y K + S [53]
S

y de las ecuaciones anteriores:

dX y.Q.§.
dt= - dt
[54]

Integrando para unas condiciones iniciales, X , S:

0 o
X = X - Y(S - S)
o o
[55]

Llevando el valor de X a la ecuación [53]:

dS 1 1-Im S[Xo + Y(So- S)]

dt = K + S
[56]
S

pudiéndose separar variables:

Ks dS S dS 1-1m
[X + Y(S - S)]S - [X + Y(S - S)]S =y dt [57 1
o o o o

Integrando entre los límites indicados y operando, queda finalmente:

X + Y(S +K s ) ln[Xo +~(S -So)] - Ks Y ln [-S

S ] = 1-1 t (X o + YS o ) [58]
0 0 m
0 0
 La concentración de sustrato en la corriente de salida, S, se obtendrá de

[58] haciendo t = L/u, y entonces X se obtendrá de [55].

Utilizar en la práctica un f.T.f.P. puede ser difrcil para condiciones aero-

bias; en ocasiones se han descrito casos en los que el aire se inyecta a lo largo

del tubo.

BIBLIOGRAFIA

AlBA, S. y otros; "Biochemical Engineering", (2ª ed.), Academic Press, New

York (1973).

ATKINSON, B.; "Biochemical Reactors", Academic Press, London (1974).

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WANG, D.I.C.; "fermentation and Enzime Technology", John Wiley, New York

(1979).
 TEMA 9
DISE~O DE REACTORES BIOLOGICOS. 11
 DISEÑO DE REACTORES BIOLOGICOS. 11.

METODOS GRAFICOS PARA TANQUES AGITADOS

La velocidad especHica de crecimiento, l..1 , es en muchas ocasiones una fun-

ción compleja de la concentración de nutriente, concentración de sustancias tóxicas

y otras circunastancias del medio de crecimiento. Asimismo, no es fácil disponer

de los valores de K •
S

De lo dicho se desprende que los métodos analrticos no siempre se pueden

utilizar, por lo que Luedeking y Piret (1959) han aplicado a la fermentación contí-

~ ciertos métodos gráficos usados para las reacciones químicas ordinarias: parten

de los datos obtenidos por cargas y miden la velocidad de crecimiento, (dX/dt)crec.

que representan frente a la concentración en biomasa en el tanque para el ciclo

de crecimiento (curva A de la Figura 1).

dX
dt

Figura 1

La porción de curva que representa la fase de crecimiento logarítmico está

comprendida entre los punto P y Q; se trata de una recta cuya pendiente es l..1 y

cuya prolongación pasa por el origen. La fase de retardo (lag) está comprendida en-

tre N y P y la fase estacionaria y de mortandad creciente recorre los puntos QRA.

N6tese que la máxima velocidad volumétrica (punto R) se alcanza después de la fa-

se lag.
La velocidad de pérdida de masa celular en el fermentador cont!nuo debe ser

proporcional a su coocentraci6n y a la velocidad de diluci6n:

(dX/dt) per
, d• = (F/V)X = DX [1]

lo que indica que al representar, para este caso, (dX/dt) pé r d• frente a X se debe

obtener una recta de pendiente D (recta B de la Figura 1, que Luedeking denomina

"línea de operaci6n") que pasa por el origen.

Cada intersecci6n de la recta B con la curva de crecimiento indica que la

velocidad de pérdida de organismos es igualada a la velocidad de incremento por

crecimiento, es decir, se trata de un punto de equilibrio. Se sabe que:

(dX/dt)neto = (dX/dt) crec~m.

. - (dX/dt) per
, d. [2]

pero para estos puntos:

(dX/dt) ne t o =O (estado estacionario) [3]

es decir:

(dX/dt) crec~m.
. = (dX/dt) per
, d. [4]

El método gráfico se puede usar para predecir la poblaci6n en estado esta-

cionario para una D dada o, inversamente, se puede emplear para encontrar una D

necesaria para mantener una concentraci6n celular deseada.

La curva A y la recta B coinciden en dos puntos: N y R. El punto B repre-

senta un equilibrio estable, siendo la soluci6n deseada que representa, además, velo-

cidades y concentraciones elevadas. Se dice que es un punto de equilibrio estable

porque, si se produce cualquier desviaci6n a su alrededor, el sistema tiende a res-

tablecer las condiciones primitivas. En efecto, sup6ngase que estando en R, por

cualquier motivo X crece en el tanque, pasando a la zona de la derecha. En este

momento:

(dX/dt) < O [5]

neto
es decir:
 (dX/dt)crecim. - (dX/dt)pérd. < o [6)

o bien:
(dX/dt) . < (dX/dt) , d [7)
crec~m. per •

Se produce un "lavado" que hace disminuir X. Lo contrario ocurre si la des-

viaci6n se produce en sentido opuesto.

Por el contrario, en el punto de corte estacionario inferior, punto N, la velo-

cidad y la concentraci6n son muy bajas y, adem§.s, es un punto de equilibrio inesta-

ble, de forma que si X crece, sigue aumentando.

En el gr§.fico de la Figura 1, la distancia vertical entre la recta B ("línea

de operaci6n") y la curva de crecimiento A, a cualquier concentraci6n de biomasa,

representa la velocidad neta a la cual la concentraci6n celular est§. cambiando.

Cuando la curva de crecimiento est§. por debajo de la recta B, (dX/dt) t es nega-

ne o
tiva y se est§. produciendo el "lavado" (pérdida a mayor velocidad que la de crecí-

miento).

La condici6n de fermentaci6n por cargas se tendr§. cuando D = O, es decir,

cuando la línea B coincida con la abscisa.

La tangente a la curva cuya prolongaci6n pasa por el origen, PQ, proporcio-

ciona el valor de D 't , es decir, el m§.ximo valor posible para D en estado esta-
en.
cionario.

Por tanto, para darse la fermentaci6n contínua se requiere:

0< D< lJm [8)

hecho que comprobaron Luedeking y Piret en la fermentaci6n continua del §.cido

l§.ctico.

METODOS GRAFICOS PARA SISTEMAS DE TANQUES EN SERIE

De la misma forma que se ha estudiado el comportamiento gr§.fico para un

solo fermentador, se puede tratar un sistema en etapas múltiples. Del primer tan-

que sale una corriente con una concentraci6n celular X que se alimenta al segundo
1
tanque, donde la velocidad de crecimiento vendr§. dada por un punto de la curva,
tal como se muestra en la figura 2.

dX
dt
1
1
1
1

~l=F/fl
1

1
1
1
1
1

figura 2
Para operar en estado estacionario, la (dX/dt)crecim. en el segundo tanque

será igual a la (dX/dt) ~ d ; haciendo un balance:

pcr •
[9]
n2 x 1 + (dX/dt) crecJ.m.
. = D2 X2
de donde:

(dx/dt) crecim. = (dX/dt)pe'rd = D2 CX 2 - X1 ) [ 10]

que es la ecuaci6n representativa de la segunda recta, de pendiente 0 2• Por repeti- 'ffllll

ci6n del procedimiento se determinan los valores de x 1, x2, x3••• , como se observa

en la figura 2.
Como en la mayor parte de los casos el volumen de los tanques es el mis-

= Dn' todas las rectas serán paralelas.

Se debe tener en cuenta que el procedimiento indicado s6lo es aceptable si

los experimentos por cargas representan también condiciones continuas; por ello, el

método gráfico se deberá tomar con precauci6n, considerando los valores obtenidos

como aproximados en un orden de magnitud. Esto no significa que los datos de fer-
mentación por cargas no tengan valor; son generalmente una gura válida para el di-
seño de una planta continua, pero para el diseño racional en escala industrial son

necesarios los datos de cultivo continuo a escala planta piloto.

Si la fuente de energra se alimenta sólo al primer tanque, no se debe espe-

rar crecimiento en los siguientes, a menos que se suministre sustrato adicional a

los mismos. Sin embargo, el método gr§fico de obtención de X ,

1
x2, ••• no tiene

ésto en cuenta.

DINAMICA DEL QUIMOST ATO

Se debe considerar que el quimostato no actúa siempre en estado estaciona-

rio; al iniciar el proceso, cierto tiempo después de un cambio en alguno de los pa-

r§metros de operación (tal como O ó S), cambios de velocidad de rotación del agi-

tador, etc.

Se puede partir de las ecuaciones obtenidas por aplicación de un balance de

biomasa y de sustrato:
dX/dt = -DX + ]..1
m
XS/(K +-S)
s [ 11]

dS/dt = D(S - S) -u XS/Y(K + S) [ 12]

o m s

que, para estado estacionario se igualan los primeros miembros a cero, presentando

dos soluciones:

X = O [ 13]
1a Solución
S = So [ 14]

que define el estado estacionario denominado "1avadq";

X = Y(S - S) [ 15]
za Solución o
S = DK /(U
s m
- D) [ 16]

que determinan el estado estacionario normal.

Las ecuaciones [ 15] y [ 16] sólo tienen sentido si:

X > O O< S < S [ 17]

o
lo que se cumplir§ solamente si ocurre que:

D< ]..1 S /(K + S ) [ 18]

m o s o
 Si fuera igual, se podrta comprobar con [16] que S = S0 •
Para unas condiciones iniciales (X , S ) y para valores especificados de los
0 0

par§metros biológicos (llm' Ks, Y) y par§metros de operación (D, S), ¿a cu§l de los

dos posibles estados estacionarios se aproximar§ el sistema (si es que se dirige a

alguno)? Para contestar a esta pregunta habr§ que hacer un an§lisis de estabilidad.

La estabilidad del estado estacionario con respecto a pequeñas perturbaciones se

puede determinar por el primer método de Liapunov, cuyos resultados, para este

caso, se presentan en la Tabla l.

Tabla 1

Estabilidad de un guimostato de acuerdo con el modelo de Monod

Estado estacionario O > · ll S /(K + S ) O < ll S /(K + S )

m o s o m o s o

Lavado asintóticamente inestable

estable (nodo)

Normal inestable asintóticamente

(X< O) estable (nodo)

De la Tabla 1 se deduce que los dos estados estacionarios no pueden ser am-

bos asintóticamente estables para cualquier conjunto de condiciones de operación,

por lo que habr§ una relación crítica entre O y S que determina cu§l estado esta-
0

cionario puede ser estable. Esta relación se puede representar gr§ficamente, obte- flll1l!ll

niéndose el diagrama de operación del sistema (Figura 3), en el que se observa que,

para condiciones por debajo de la curva límite, el estado estacionario normal ser§

asintóticamente estable, y el estado estacionario correspondiente al lavado ser§

inestable.

Estos resultados se comprenden f§cilmente desde el punto de vista biológico,

porque la curva del diagrama de operación representa la m§xima velocidad específi-

ca a la cual la población puede crecer para una determinada concentración de sus-

trato limitante en la alimentación.

 Los resultados de la Tabla 1 y del diagrama de operación dan la estabilidad

del estado estacionario con respecto a las pequeñas perturbaciones.

Lavado: e.e. nodo estable

Normal: e.e. sin sentido (X<O)

e.e. inestable
Normal: e.e. estable (nodo)

S
o

figura 3
Diagrama de operación para el modelo de Monod
Ecuación de la curva lfmite: O = 1JmS0 /(Ks + S0 )

Para hacer una análisis más general, es decir, saber lo que ocurrirfa con res-

pecto a grandes perturbaciones, bastará integrar numéricamente las ecuaciones dife-

renciales [ 111 y [ 12] para un gran número de diferentes condiciones iniciales y re-

presentar las soluciones en un plano de fases. La solución obtenida por Koga y

Humphrey para un quimostato que sigue el modelo de Monod, se representa en la

figura 4.

Para hacer sus cálculos eligieron los parámetros biológicos y de operación

de tal manera que sólo el estado estacionario normal era el asintóticamente estable

con respecto a las pequeñas perturbaciones. Las curvas obtenidas son las soluciones

de [ 111 y [ 12] para diferentes valores iniciales de X y S. El tiempo es el parámetro

a lo largo de estas trayectorias y las flechas indican la dirección con el incremento

de tiempo. La representación indica que todas las trayectorias se dirigen a los va-

lores del estado estacionario de X y S, de tal manera que el estado estacionario

es asintóticamente estable también con respecto a las grandes perturbaciones.

 S/S
o

X/Y.S o
Figura 4

Los c~lculos hechos para otros valores de los par~metros siempre indican

que, cuando las condiciones de operación son tales que el estado estacionario nor-

mal es asintóticamente estable con respecto a las pequeñas perturbaciones, también

lo es con respecto a las grandes perturbaciones.

COMPARACION ENTRE LA FERMENTACION CONTINUA Y LA DISCONTINUA

Se trata de obtener una relación entre la productividad en el proceso contr-

nuo y el proceso por cargas correspondiente. Es necesario deducir expresiones para

la velocidad volumétrica media del proceso por cargas y la velocidad m~xima del

proceso contínuo. La Figura 5 representa dos ciclos de fermentación por cargas,

mostr~ndose en ordenadas la concentración en masa celular y en abscisas el tiempo.

Los intervalos de tiempo indicados representan:

t 2: pertodo de adaptación siguiente a la inoculación (lag)

tm: crecimiento logarítmico

t : degradación celular y recogida

o
 t : vaciado, limpieza, llenado y esterilización
1

tL = t + t + t representa tiempos no produ<;:tivos

0 1 2
te = tm + t
0
+ t1 + t
2
= tm + tL representa un ciclo completo

X ~--------,-~~----,---------~~~
m

X. ~

t t t
m o m

Figura 5

Aplicando a tm la ley de crecimiento logarftmico:

[ 19]

Si se supone que la concentración inicial de nutriente es S y que se agota

0

totalmente:
Y = (X
m
- X )/S
o o [20]

de donde se deduce que la velocidad· media de producción en la fermentación por

cargas ser§:
y S
o
(r )
cargas media
= (X m - Xo )/t e = (lf1 ) ln(X /X ) t (g/l.h) [21]
~m m o + L

Para el proceso continuo en un solo tanque sin recirculación se sabe que:

(r) = (dX/dt) . =~X [22]

cont. crec~m.

o bien:
( r) cont. = DX [23]

y el valor m§ximo:
 (r
cont. max.
) , = D,opt. Xm [24]

Si se sustituyen los valores de D y de Xm, valor que se obtiene sustitu-

6pt.
yendo D en la expresión:
6pt.
D K8
X = Y(S - )
[25]
o llm - D

y si se supone que K << S , lo que es muy frecuente, operando se llega a:

S O

[26]

Se puede definir ahora el par~metro G igual al cociente entre la velocidad

en régimen continuo y en régimen discontinuo, de la forma:

[27]

El valor de G depende fundamentalmente de tL y de ll m (o del tiempo de

duplicaci6n, t d = In 2/¡_¡ m). Es obvio que cuanto mayores sean tL y ll m (o menor

td)' tanto m~s favorable ser~ el proceso continuo. Por el contrario, la influencia

de (X /X ) ser~ menor al estar en forma logarrtmica.

m o
La ecuaci6n [27] se ha representado en forma gr~fica como se muestra en

la Figura 6, observ~ndose en la parte inferior que, a partir de tL y un haz de rec-

tas en las que el par~metro es td' ·.se determina el valor de la abscisa, tL .l1 m· Con "ff//!!
este valor y el cociente (X /X ), par~metro del haz superior, se calcula G.
o m
Asi, por ejemplo, para tL = 10 h; td = 0,5 h; X/Xm = 0,05, se obtiene:

G = 16,8 [28]

La ecuaci6n que da G se basa en la constancia de Y, que puede no ser rigu-

rosamente cierta. Sin embargo, la citada ecuaci6n y el gr~fico se pueden utilizar

como primer intento de comparaci6n.

 t
G
1 30
X
o
X
m

20
16,8

10

tLum
o 20
tL 10
~ 20
td l1
m
figura 6

BIBLIOGRAfiA

AlBA, S. y otros; "Biochemical Engineering", 2ª ed., Academic Press, New

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SIMON, P. y MEUNIER, R.; "Microbiologie Industrielle et Genie Biochimigue",

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 TEMA 10
AISLAMIENTO Y UTILIZACION DE ENZIMAS
 AISLAMIENTO Y UTILIZACION DE ENZIMAS

INTRODUCCION

Actualmente existen muchas enzimas comerciales que se utilizan en la elabo-

ración de bebidas y alimentos, en el tratamiento de pieles y tejidos, en Medicina,

etc. En la Tabla 1 se enumeran algunas enzimas de importancia industrial.

El grado de pureza es variable y en muchas ocasiones la industria emplea

sistemas enzim§ticos complejos para llevar a cabo una secuencia de reacciones. Con

todo, los fabricantes de enzimas normalizan sus productos presentándolos frecuente-

mente en forma de concentrado activo que luego se diluye adecuadamente para dis-

poner de una serie de actividades standard. Ciertas aplicaciones exigen extractos

enzimáticos relativamente puros, como son la glucosa oxidasa, las enzimas para el

diagnóstico cltnico y aquéllas utilizadas en la industria alimentaria.

Las enzimas pueden ser extracelulares (secretadas por la célula para degradar

los nutrientes macromoleculares del medio, que as! pueden atravesar la pared) o en-

zimas intracelulares (que se producen dentro de la célula y no son secretadas al

exterior; su obtención es generalmente m§s compleja que en el caso anterior).

A las enzimas se puede llegar a partir de las fuentes naturales, vegetales

y microorganismos.

a) Extracción de gl§ndulas animales: Un ejemplo de este caso es la obtención

de la renina, generalmente a partir del estómago de ternero.

b) Extracción de plantas: Ejemplo t!pico es la obtención de la papatna proce-

dente del fruto de la papaya o de su látex y la preparación de compuestos diastási-

cos a partir de la cebada en germinación.

e) Extracción de microorganismos: En este caso se han de cultivar los micro-

organismos seleccionados que produzcan determinadas enzimas. La rápida duplicación

de los microorganismos comparada con plantas y animales indica que los procesos
microbianos se pueden adaptar más fácilmente a las demandas del mercado.
 ALGUNAS ENZIMAS DE OO'QRTANCIA INDUSTRIAL
Importancia
Nanbre Fuente Aplicacion Notas canercial

Amilasas licuefactoras de almidon

Diastasa Malta Digestivas, pan Actividad alfa- +++

y beta-amilasa
Takadiastasa "Aspergillus oryzae" Digestivas, pan Contiene muchas +++
otras enzimas,
proteasa, RNasa
Ami lasa "Bacillus subtilis" Textil, fermenta- La preparacim
cion de alcohol, cruda contiene
produccion de glu- proteasa
cosa
Amilasa resistente "Aspergillus niger" Digestivas pi opti.Iro 4-5 +
a los acidos

Amilasas sacarificantes de almidon

Amiloglucosidasa "Rhizopus niveus", "A. niger" Produccion de +++

"Endanycopsis fibuliger" glucosa
Invertasa "Saccharanyces cerevisiae" Banboneria: pre-
vencion de cris-
talizacion de azucar
Pectinasa "Sclerotina libertina" - Clarificacion de Marcas ccmerciales: +++
"Coniothyrium diplodiella" jugos, separacion Scrase, Pectinol
"A. oryzae", "A. niger" de pectina, con- Filtragol
"A. flavus" centracion de cafe

otras enzimas ccmerciales

Penicilinasa "B. subtilis", "B. cereus" Separacion de Takamine +

penicilina
Glucosa oxidasa "A. niger" Separacion de Takamine +
glucosa u oxigeno
de varios alimentos
"Penicillium chr¡sogenum" Determinacion de Nagase Co.
glucosa
Hialuronidasa Animales, bacterias Usos medicos +
Lipasa Pancreas, roohos ( "Rhyzopus" ) Digestivas, +
aranatizacion de
productos lacteos
Citocraro e Levadura ( "q:md.ida") Usos medicos Sankyo Co. +
Catalasa Esterilizacion de
leche
Queratinasa "Streptanyces fradiae" Separacion del Merck Co. +
pelo de las pieles·

CONTINUA

Tabla 1
 ALGON1\S ENZIMAS DE IMPORTANCIA INDUSTRIAL
( OJNTINUACION)

Nanbre Fuente Aplicacion Notas Importancia

canercial

Enzimas nucleoliticas y otras nuevas enzimas

5'-Fosfodiesterasa "Penicillium ci trinum" Fabricacion de Yarnasa Co.

"S. griseus", "B. subtilis" acidos inosinico Takeda Co.
y guanilico
(5'-nucleotidos)
Acido adenilico "A. oryzae" AMP ---~ IMP En la +
dearninasa Takadiastasa
Cuajo microbiano "Mucor" sp. Fabricacion de Meito Sangyo +
queso
Naringinasa, "A. niger" Eliminacion del Rohm and Haas +
hesperidinasa sabor amargo del
zurro de lizoon
Glucosa isomerasa "Lactobacillus brevis" Glucosa __ _, pH optim:::l 6-7
fructosa
Lacasa~ "Coriolus versicolor" Secado de barniz
Celulasa "Tricoderma koningi" Digestivo pH Óptim:::> 4,6

Proteasas animales y vegetales

Tripsina Pancreas animal Usos medicos, +++

ablandamiento de
carne
Pepsina Estanago animal Digestivo, ablan-
damiento de carne
Alfa-quizootripsina Estanago animal Usos medicos
Cuajo Estanago de ternera Fabricacion de +++
queso
Proteasa pancreatica Pancreas animal Digestivo, depilacion ++
limpieza, curtido
Papaina Papaya Digestivo, usos +++
medicos, ablanda-
miento de carne
Bromelaina, ficina Piña, higo Digestivo, usos
medicos, ablanda-
miento de carne

Proteasas microbianas

Proteasa "A. oryzae" Mejora del "sake" +

Proteasa "A. niger" Alimento, Resiste acidos -++
digestivo pH optim:::l 2-3
Proteasa "B. subtilis" Denerentesg,
~r:.,ecu Cl.On e
pH optim:::l 7, o ++
aní~~4aga
carne
Proteasa "Streptanyces griseus" " 11 " " .. .. pH optizoo 8, O ++
Varidasa "Streptococcus" sp. usos medicos Lederle Co. -++
Streptoquinasa "Streptococcus" sp. Profibrino- ++
lisina
EXTRACCION DE GLANDULAS ANIMALES
El método se puede ilustrar con la preparaci6n y uso de la renina, que es

una enzi'ma comercial que cuando est§ impura recibe el nombre de cuajo.

Se obtiene de los est6magos de animales j6venes que se alimentan pr§ctica-

mente s6lo de leche y su misi6n es facilitar la digesti6n de la leche. Cuando el

animal cambia de dieta, entonces disminuye el contenido de renina en su est6mago.

Para su aislamiento se puede partir de est6magos frescos o inyectarles aire y de-

jarlos secar.
Para obtener el cuajo, muy esquem§ticamente, se pueden seguir las etapas

que se describen a continuaci6n:

a) Tratar la fuente natural (est6magos frescos o secos) con una disoluci6n

de ClNa al 6 %, a la que se le ha añadido una pequeña cantidad de §cido b6rico

para rebajar su pH hasta 5,2 (la misi6n del §cido b6rico es rebajar el pH y actuar

de conservador). As! se deja unos d!as (en ocasiones puede producirse una contami-

naci6n bacteriana que estropea completamente el sistema).

b) Se filtra y se acidifica el l!quido con ClH hasta rebajar su pH a 2,5 y se

deja otros 2-3 d!as. La misi6n de esta etapa es múltiple:

- acci6n esterilizante

- coagular la mayor parte de la materia coloidal

- activar la pro-renina, que es el precursor del producto activo

e) Si se desea una disoluci6n dilu!da basta neutralizar parcialmente el l!quido

y filtrarlo.

Por otro lado, si se desean disoluciones m§s concentradas o un producto sóli-

do, se puede precipitar la prote!na mediante un "salado" con ClNa o SO Na en su

4 2
punto isoeléctrico. (pH = 3,6) y dejar reposar durante unas 12 horas.

Existen otros métodos, pero no se entrar§ en detalles.

Cuando se obtiene corno polvo, se suele diluir con almid6n hasta lograr una
actividad standard y venderse como polvo o tabletas. El rendimiento en producto ac-
tivo es generalmente inferior al 1 % referido a est6magos secos.
 La principal aplicación del cuajo es para hacer queso: después de que la le-

che se ha agriado (o acidificado) se añade el cuajo, cuya misión principal es hidro-

lizar un fragmento polipéptido del caseinógeno de la leche o "caserna kappa", dejan-

do libre la paracaseina, que forma un complejo insoluble con los iones Ca++; este

complejo se separa de la disolución como co§gulo que generalmente ocluye otros

componentes de la leche. Se aglomera y se extrae y exprime el suero, se le dan

formas caracteristicas y se deja madurar generalmente algunos meses.

Otros productos enzimáticos de origen animal son la pancreatina y la pepsina,

enzimas proteol"íticas que se obtienen a partir de las mucosas del cerdo y ganado

vacuno joven. Su aplicación principal es el curtido de pieles con fin suavizante.

También se utilizan en Medicina.

Ejemplos de aplicación médica de enzimas obtenidas de fuentes animales

TRIPSINA

Esta enzima pura y cristalina se obtiene como subproducto en la extracción

de la insulina del p§ncreas de bóvido. En disolución es inestable y sólo se puede

conservar algunas horas en tampón de fosfato; por ello, inmediatamente después de

cristalizada, se debe secar por liofilización.

Se aplica en escala limitada para la limpieza de heridas y para reducir la

formación de pus. Ejerce su acción sobre el tejido dañado y necrótico, pero no ata-

ca al tejido sano.

HIAL URONIDASA

Degrada el §cido hialurónico (muco-polisacárido integrado por unidades de N-

acetilglucosamina), compuesto importante del tejido conjuntivo, ya que viene a ser

como un "cemento" aglutinante de la estructura.

La enzima est§ muy extendida; existe en el veneno de serpiente, sanguijue-

las, algunas bacterias patógenas y también en los test!culos de los mamHeros, a

partir de los cuales se extrae (para ello se maceran los test!culos en acético diluido,
 luego se somete el extracto a precipitación fraccionada y finalmente se liofiliza).

Como aplicación médica se adiciona a disoluciones para inyecciones subcut§-

neas, para acelerar su absorción. También se mezcla con el toxoide diftérico, que

luego puede administrarse por via oral.

ENZIMAS PROCEDENTES DE VEGETALES

Las proteasas constituyen un importante grupo. En los EE.UU. se importan

anualmente cientos de toneladas de l§tex de papaya seco por su actividad proteol!-

tica. La papaína es una de las m§s importantes enzimas proteoltticas, pero también

se utilizarr la bromeina (del jugo de piña) y la ficina (de los higos) junto con enzi-

mas de origen microbiano. Las diferentes enzimas pueden utilizarse solas o mezcla-

das. En todo caso se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones:

a) El pH y la temperatura para que la mezcla presente una actividad óptima.

b) Las proteasas se pueden dividir en: endotipos (atacan a la zona central

de las proteínas dando polipéptidos) y exotipos, que eliminan los amino§ci-

dos terminales. Es importante el adecuado balance entre estos dos tipos

para lograr un determinado fin.

e) En ocasiones es conveniente que la enzima no deba ser demasiado estable

al calor, para poder ser destruída, una vez logrado el nivel de transfor-

mación deseado.

Entre las principales aplicaciones de las mezclas de proteasas cabe destacar

las que se estudian a continuación:

1) Curtido. Tradicionalmente, después del pelado con cal, se sol!a hacer un

· tratamiento con deyecciones de perro, a veces suplementado con gallinazas, cuyo

fin era suministrar enzimas proteoliticas. Su efecto era lograr una degradación par-

cial de la superficie de la piel, lo cual produc!a un reblandecimiento de la textura,

una mejora de su aspecto y una distribución m§s uniforme de los colorantes.
 En la actualidad, aquellos productos se han sustituido por mezclas de enzimas

proteolfticas pues, aparte de su desagradable manejo, no se podfan normalizar fácil-

mente.

2) Modificaciones en harinas. Según las clases y condiciones climáticas exis-

ten trigos "fuertes" o "duros" y trigos "blandos". La harina de los primeros tiene

un elevado contenido en gluten, siendo muy satisfactoria para la elaboración de

pan, pero no dan hojaldres ni bizcochos suficientemente esponjosos. Se han podido

mejorar para estos fines las harinas procedentes de trigos duros, introduciendo enzi-

mas proteolfticas que degradan parte del gluten.

3) Industria cervecera. Para evitar el enturbiamiento de las cervezas se sue-

len añadir pequeñas cantidades de enzimas proteolfticas que permiten mantenerlas

claras y brillantes después de un almacenamiento prolongado, incluso a temperaturas

próximas al punto de congelación. La turbidez es producida por la precipitación

parcial de protefnas.

4) Extracción de aceite a partir de residuos de pescado. La acción de enzi-

mas proteolfticas produce la degradación parcial de los tejidos, lo que permite una

mayor facilidad de acción de los disolventes en la extracción de aceites ricos en

'-' vitaminas a partir de hfgados de pescado. El proceso se puede verificar asf más rá-

pidamente y a temperatura .más baja con mejores rendimientos y contenidos vitamf-

nicos más elevados.

5) Limpieza y lavado de ropa. Se utilizan preparados enzimáticos para quitar

manchas de alimentos en la ropa antes de la limpieza en seco, y también para de-

gradar los residuos de sangre y pus en las sábanas de hospitales antes de su lavado.

6) Recuperación de la plata en placas fotográficas. Las proteasas pueden ser-

vir para licuar la gelatina de las películas, destruyendo sus propiedades coloidales

y permitiendo asf recuperar fácilmente las sales de plata.

 7) Ablandamiento de carne. Se han utilizado la papaina y otras proteasas con

este fin; el objetivo es convertir las partes duras de la carne en parte tierna, con

lo que se incrementa su valor comercial. La dificultad consiste en evitar una acción

local excesiva mientras se mantiene un tratamiento adecuado en los tejidos profun-

dos, ya que la velocidad de difusión de las enzimas, por su elevado peso molecular,

es muy baja. Parece que los mejores resultados se obtienen con tejido liofilizado

o muy finamente desmenuzado.

Las enzimas amilol!ticas están asociadas a la degradación del almidón y están

muy extendidas en el reino animal y vegetal. Una fuente muy importante son las

semillas en germinación, especialmente la cebada, pero actualmente se preparan

cantidades cada vez mayores a partir de microorganismos (mohos y bacterias). Aun-

que el almidón varía según proceda de una planta u otra, de forma general se pue-

de considerar como la mezcla de amilosa y amilopectina. La primera es un pol!me-

ro lineal de O-glucosa con enlaces ce- 1,4, mientras que la amilopectina posee cade-

nas similares, pero unidas en forma ramificada mediante enlaces 1,6 adicionales.

Los dos grupos más importantes de enzimas amilol!ticas son las cc-amilasas

y las ¡3-amilasas, si bien existen otras más, y un producto comercial generalmente

está formado por una mezcla de enzimas diferentes; la elección de un preparado

u otro implica tener en cuenta una serie de caraétertsticas: resistencia al calor,

pH, etc.

Las g, -amilasas se conocen también como enzimas dextrinizantes, ya que su

acción principal consiste en producir una degradación del almidón e'n fragmentos

más pequeños denominados generalmente dextrinas. Su ataque se localiza únicamente

en los enlaces 1,4 y este efecto preliminar va seguido de otro más lento que da,
en el siguiente orden: moléculas más pequeñas de dextrinas, luego maltosa y final-
mente glucosa.
 Las S-amilasas son un importante constituyente de la malta, pero no existen

en proporci6n elevada en enzimas de mohos y bacterias. Degradan los polisac§ridos

a s-maltosa. Como las harinas naturales la contienen, la enzima que suele adicio-
narse es la a. -amilasa.

Como se dijo anteriormente, en los preparados comerciales de enzimas amilo-

llticas existen otras enzimas, entre las que cabe destacar la maltasa, cuya misi6n

principal es romper la maltosa para convertirla en glucosa, pero hasta esta fase,

s6lo degrada muy lentamente el almid6n.

Es conveniente destacar que las enzimas especlficas se pueden aislar única-

mente mediante técnicas muy refinadas y que, en consecuencia, los productos co-

merciales contienen generalmente varios tipos de enzimas.

Entre las principales aplicaciones de las enzimas amilollticas, cabe destacar

las siguientes:

1) Hidr6lisis del almid6n previa a la fermentaci6n alcoh6lica. Se utilizan

principalmente en industrias de cerveza y alcohol, donde se hace uso de malta de

cebada para transformar el almid6n en polisac§ridos más pequefios y azúcares sobre

los cuales puede actuar la levadura.

2) Modificaci6n de harinas. Con el fin de que la masa produzca suficiente

co 2 como resultado de la fermentaci6n de la levadura, es necesaria la presencia

de una pequefia cantidad de azúcar, pero no todas las harinas alcanzan este nivel.

Por ello, en estos casos se suele recurrir a la adici6n de a.-amilasa procedente de

microorganismos.

3) Clarificaci6n de jugos de fruta. El jugo recientemente exprimido suele ser

turbio, debido a la presencia de almid6n en suspensi6n, lo que puede corregirse adi-

cionando una mezcla adecuada de amilasas. Este tratamiento es particularmente

útil para el jugo de manzana, que adquiere un aspecto claro y brillante.
 Es necesario decir finalmente, que existen otras muchas aplicaciones de las

enzimas amilolíticas, pero por su extensión no se tratar§.n aquí.

ENZIMAS OBTENIDAS DE MICROORGANISMOS

Se trata de una industria de gran importancia en la actualidad, a lo que han

contribuído las especiales características de los microorganismos: tiempo de duplica-

ci6n y obtenci6n de mutantes por control genético. También es necesario decir que

esta industria ha guardado un cierto car§.cter esotérico (ocultismo). Son muy impor-

tantes las siguientes consideraciones:

- La elecci6n del microorganismo, ya que entre las distintas especies de un

mismo género y aún razas de la misma especie, varía ampliamente la composici6n

enzim§.tica. Así, se ha visto que de 278 "Aspergilli", tan s6lo 34 producfan cantida-

des apreciables de a.-amilasa y maltasa, pero es que incluso dentro de las razas de

la especie "A. oryzae" existen grandes variaciones.

- Los rendimientos son afectados por el tipo de sustrato, especialmente la

fuente de nitr6geno.

- Asimismo, los rendimientos también son afectados por las condiciones de

crecimiento. Así, por ejemplo, se ha visto que se puede utilizar la especie bacteria-

na "Bacillus subtilis" para producir una mezcla enzim§.tica predominantemente ami-

lolítica o predominantemente proteolítica bajo condiciones de desarrollo diferentes.

Como es natural, los fabricantes deben seleccionar y mantener sus propias

especies y multiplicarlas bajo condiciones determinadas. Como antes se apuntaba,

esta industria está caracterizada porque generalmente existe una gran reserva de
la fuente de sus productos y de sus métodos de trabajo.

Cabe destacar que la mayoría de los organismos utilizados en la producci6n

de enzimas son aerobios estrictos.

Existen dos tipos diferentes de procesos para obtener enzimas de microorga-

nismos:
 a) Cultivo superficial en medio s6lido (método de Koji)

b) Cultivo liquido sumergido

En el primero se utilizan bandejas donde se coloca el sustrato y posterior-

mente se siembra. Las enzimas extracelulares se pueden obtener por lavados con

agua o tampones, siendo estos ltquidos posteriormente procesados.

El cultivo sumergido aireado para la obtenci6n de enzimas microbianas es una

técnica reciente basada en la experiencia adquirida en la Segunda Guerra Mundial

en el diseño de fermentadores para obtener penicilina. Algunos fermentadores pue-

3
den llegar a tener capacidades de 120 m y se han de controlar muy cuidadosamen-

\., te:

el caudal de aire esterilizado que circula a través del medio

- la concentraci6n de nutrientes

- el pH y la temperatura

Enzimas obtenidas de levaduras

Dentro de las enzimas que se fabrican industrialmente a partir de levaduras

merecen menci6n especial la lactasa y la invertasa.

la lactasa actúa sobre la lactosa para convertirla en los dos monosac§ridos:

galactosa y glucosa. Se utiliza para adicionar a derivados l§cteos (por ejemplo, he-

lados), que contienen lactosa en concentraciones relativamente elevadas, con el ob-

jetivo de evitar su cristaHzaci6n, que harta desagradable su uso, pues el consumidor

tiene la sensaci6n de estar comiendo arena o vidrio molido.

Para obtener lactasa se han utilizado las especies de levaduras: "Saccharomy-

ces fragilis", "S. lactis", "Candida spherica", "C. pseudotropicalis" y "C. utilis".

La invertasa actúa sobre la sacarosa para convertirla en glucosa y fructosa,

mezcla que recibe el nombre de azúcar invertido. Este se utiliza en jarabes y pas-

telerta. La invertasa permite el uso de concentraciones elevadas de sacarosa sin

llegar a cristalizar; se utiliza también para hacer miel artificial y diversos produc-
tos de repostería. Su· aplicación més pintoresca es para obtener bombones con nú-

cleos blandos: se hace un preparado con sacarosa como base fundamental y como

es bastante sólido, se puede recubrir de chocolate con facilidad. Si se incluye al

principio una pequeña cantidad de invertasa, ésta va licuando el relleno en el trans-

curso del almacenamiento.

La invertasa es una enzima intracelular y puede obtenerse de una cepa se-

leccionada de "Aspergillus oryzae".

Por último, la poligalacturonidasa de levadura (PGL) es una enzima extr~ce­

lular que elabora la especie "Saccharomyces fragilis" y que tiene propiedades pepto-

líticas.

Enzimas de mohos

Las enzimas obtenidas de mohos son esenciales en la producción de ciertos

alimentos fermentados, de écidos orgénicos (como el cftrico y el glucónico) y tam-

bién de antibióticos, como la penicilina. También tienen importancia en las altera-

cienes indeseables asociadas a enfermedades de las plantas, deterioro de alimentos,

etc.

Las enzimas de mohos se pueden obtener por medio de cultivo superficial o

de cultivo sumergido.

Como ejemplo de enzima de este grupo se tiene la glucosaoxidasa, que se

puede producir a partir de "Penicillium chrysogenum", de "P. notatum", o de algu-

nos otros, como el "Aspergi!lus niger". Se utiliza para eliminar glucosa u oxígeno
de ciertos alimentos. Por ejemplq, se usa en la desecación de huevos para privar
de glucosa a las claras, las yemas o el huevo completo, según la reacción:

g1ucosaoxidasa , 'd , .
g 1 ucosa + O2 ~ ac1 o g 1 ucon1co [ 1]

Como se precisa exceso de oxígeno para llevar a cabo esta reacción se añade

H2o2 como fuente del mismo y el exceso de H o se elimina por medio de catala-
2 2
sa, que es otra enzima:
 2 H 0 catalasa H [2]
2 2 > 2 20 + 0 2
La glucosa-oxidasa se puede utilizar para eliminar oxigeno de la cerveza y

otros alimentos enlatados o embotellados. La propiedad de la glucosa-oxidasa de

oxidar a la glucosa con velocidades hasta unas 400 veces superiores que a otros

azúcares es la base de algunas aplicaciones analtticas y médicas. Asi, se utiliza en

papeles de ensayo para la determinaci6n de glucosa en orina y sangre.

Existen otras muchas enzimas procedentes de· los mohos que tienen aplicacio-

nes industriales: amilasas, proteasas, pectinasas, etc. Las pectinas est§n constituidas

por cadenas de §cido anhidrogalactur6nico unidas por enlaces cruzados, lo que da

\, lugar a macromoléculas de peso molecular comprendido entre unos 10.000 y 300.000,

donde la mayor parte de los grupos carboxflicos est§n metilados. Las enzimas que

degradan a las pectinas son las pectinasas, que se pueden considerar constituidas

por dos grupos: pectinesterasas, que eliminan los grupos metilo y las poligalacturo-

nasas, que atacan a los enlaces glucosídicos de los restos de §cido anhidrogalactu-

r6nico.

PURIFICACION DE ENZIMAS

Existen numerosas técnicas para la purificaci6n de enzimas, algunas de las

cuales se revisar§n a continuaci6n.

A) Diferentes propiedades i6nicas: precipitaci6n, electroforesis y cromatografía de

cambio i6nico

Las propiedades i6nicas de las proteínas (y las enzimas son proteínas) son co-

nocidas; recuérdese que su punto isoeléctrico, pi, es el pH al cual no existe carga

neta en la proteína. En la Tabla 2 se muestran valores de pi de varias enzimas y

otras protetnas.

Como era de esperar, la solubilidad de una proteina depende del pH de la

disoluci6n y es generalmente m§s baja en el punto isoeléctrico. Puesto que las mo-

léculas de prote!na no tienen carga neta en el pi y tienen alguna carga a diferente

pH, · las fuerzas electrost§ticas de repulsión entre moléculas de so luto son mfnimas

en el pi. Este hecho sugiere un procedimiento de precipitación fraccionada para se-

parar protefnas con diferentes pi. A un pH dado, aquellas protefnas con el pi m§s

próximo tienden a precipitar. Variando el pH se ir§n separando diferentes fracciones

con diferentes protefnas.

Tabla 2
Punto isoeléctrico

Pepsina "' 1,0

AlbUmina de huevo 4,6
Sero-albQmina 4,9
U re asa 5,0
8-lactoglobulina 5,2
Y -globulina 6,6
1
Hemoglobina 6,8
Mioglobina 7,0
Quimotripsinógeno 9,5
Citocromo e 10,65
Lisocima 11,0

Sin embargo, si se imponen amplias variaciones de pH sobre una disolución

protefnica, se corre el riesgo de que se desnaturalicen muchos de sus componentes

y, en consecuencia, se utiliza m§s otra técnica de precipitación que se denomina

salado: la solubilidad de una protefna resulta muy afectada por la concentración sa-

lina en la disolución.

En 1889, Hofmeister observó que cuanto m§s negativamente cargados estaban

los aniones de las sales, eran m§s efectivos en la precipitac~ón de las protefnas y

un comportamiento similar presentaban los cationes. Como el (NH ) so es muy

42 4
soluble en disoluciones acuosas, es muy usado en el aislamiento de protefnas (tam-

bién se utiliza el Na so , pero menos ampliamente).

2 4
La principal variable a considerar en el salado de protefnas es la fuerza ióni-

ca, 1, definida por:

 1 n 2
I = 2 I c.z.
. 1 1 1
[3]
1=
donde:

Ci: concentraci6n de ion iésimo

Z.: carga del mismo

1

n : número total de iones en disoluci6n

Se supone que la adici6n de varias sales tiende a reducir la concentraci6n

de agua disponible para la hidrataci6n de grupos (ionizados o polarizables) de las

protefnas, por lo que disminuye su solubilidad.

Se ha podido establecer la siguiente correlaci6n para la solubilidad de las

pro ternas a alta fuerza i6nica:

lag S = S - ki [4)

siendo S la solubilidad, f3 una constante y k la llamada "constante de salado".

La precipitaci6n de las enzimas y otras prote1nas se puede lograr por otros

muchos medios: asr, un disolvente org§nico como la acetona es un buen agente pre-

cipitador de proteinas. Se puede suponer que tales disolventes, an§logamente a las

sales, producen una reducci6n en la concentraci6n de agua.

Las protefnas que se pueden desnaturalizar a alta temperatura m§s f§cilmen-

te que el componente de interés, se pueden separar de la disoluci6n por "cocinado"

(o guisado); una vez desnaturalizada, la proteina es menos soluble y precipita.

Otro procedimiento de precipitaci6n consiste en utilizar caserna, tierra de

diatomeas o gelatina: las prote1nas sedimentan al ser adsorbidas por estas part1culas.

La electroforesis es el movimiento de especies cargadas en el seno de un

campo eléctrico. La velocidad en estado estacionario, v, se alcanza cuando una par-

ticula de carga q en un flu1do bajo la acci6n de un campo eléctrico de intensidad

E alcanza el equilibrio:
¿ F = O [5]

[6]
- Frozamiento = Fejercida por el campo eléctrico
[7]
- F rozamiento = q.E
 Puesto que la mayor parte de prote!nas son globulares, se puede utilizar la

ley de Stokes para el rozamiento de una esfera de radio r p moviéndose en un l!qui-

do newtoniano de viscosidad ~ :
- F
r
= 6 ~ ~ r
p
v [8]

6 ~ ~ r
p
v = q.E [9]

de donde:
V = 6 g.E ~ ~ r
[ 1O]
p

Puesto que cada enzima tendr§. una carga q diferente, la aplicaci6n de un

campo eléctrico generar§. diferentes velocidades de las enzimas, lo que se puede

utilizar para su separaci6n.

Variando el pH del medio electroforético se puede alterar la velocidad de

una proterna. Si para una prote!na dada el pi es menor que el pH, su carga y su

velocidad son negativas. En cambio, para los componentes protetnicos para los que

se cumple que el pi es mayor que el pH, se mover§.n en direcci6n opuesta.

La técnica indicada se puede utilizar para medir el pi: el pi de una protetna

o de otras moléculas se puede determinar f§.cilmente si se colocan dichas moléculas

bajo un gradiente de pH y se busca d6nde la velocidad electroforética es nula.

Para el cambio de escala, la técnica de electroforesis presenta el problema

del calentamiento 6hmico de la disoluci6n.

En la cromatograf1a de cambio i6nico la disoluci6n con la prote!na se pasa

por una columna de lecho fijo que contiene una resina cambiadora de iones. Una

resina muy utilizada para purificaci6n de protetnas es la carboximetilcelulosa (CM-

celulosa, grupo carboximetilo cargado negativamente), que es un cambiador de ca-

ti6n; prote!nas cati6nicas (cargadas positivamente) se unir§.n por fuerzas electrost§.-

ticas dependiendo de la fuerza de la uni6n de la carga neta positiva y del pH de

la disoluci6n alimentada a la columna.

Después de ser retenida la protetna de esta manera, la columna se lava con

tampones que incrementan el pH y/o la fuerza iónica; ésto causa un debilitamiento

en el enlace de las protefnas, llegando a ser elufdas. Los efluentes (eluatos) obteni-

dos por lavado se van agrupando en distintas fracciones según las diferentes condi-

ciones. Similar procedimiento se puede emplear con intercambiadores ani6nicos, que

emplean frecuentemente resinas de dietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosa).

B) Adsorción y afinidad cromatogr§fica

Las prote1'nas presentan diferentes tendencias a ser adsorbidas por sustancias

como almidón, tierra de diatomeas, gel de poliacrilamida, etc. En consecuencia,

cuando una disolución conteniendo protefnas se desplaza en un lecho que contenga

aquellas sustancias, cada protefna se mover§ con una velocidad que ser§ tanto me-

nor cuanto mayor sea su tendencia a ser adsorbida.

Se suele utilizar la siguiente analogfa para dar una explicaci6n al principio

de la cromatografra: si se imagina que un grupo de automovilistas que comienzan

juntos en un punto de una carretera para hacer el mismo recorrido y a lo largo de

la carretera existen muchas "tascas", los m§s sedientos completar§n el recorrido

m§s tarde que los que no son bebedores.

El caso m§s sencillo de modelo de cromatografta supone que se alcanza un

equilibrio local entre la prote1'na adsorbida y la prote!na en disolución:

w.l.
K.l. = X.
[ ll]
l.

donde:

K.: coeficiente de partición

1

W.: fracción molar de la protefna i en el adsorbente

1

x.: fracción molar de la protefna i en la disolución

1

Un caso tfpico: una pequeña cantidad de prote!na se introduce en un sistema

portador tamponado que pasa a través de la columna rellena con el adsorbente, se-
gún se aprecia en la figura l. Si el flufdo portador se desplaza a través del lecho

con velocidad v, la velocidad vi de la pro te!na i vendr§ dada por la expresión:

 V.
~ 1
[ 12]
V

donde e: es la porosidad o fracci6n de huecos en el lecho, definida como:

volumen ocupado por el fluido

e: = -
volumen ocupado -por la columna [ 13]

siendo adem§s:
V = ..JL
e:.S
[ 14]

donde:
Q: caudal volumétrico de fluido

S: §rea de la seccí6n transversal de la columna

v: velocidad verdadera del fluido

Inyección de (proteína 1 +
la muestra + proteína 2)

figura 1
Diagrama esquem§tico de la separaci6n cromatogr§fica de proteinas

Si la afinidad del componente i es mayor (K 1 mayor), se mover§ en la co-

lumna relativamente lento, pero. si Ki se hace pequeño (menor afinidad por el ad-

sorbente), se mover§ a velocidades mayores, pudiendo llegar como m§xímo a ser

La cromatografta se· ha definido como la percolaci6n uniforme de un fluido

a través de una columna que contiene una sustancia sOlida m§s o menos finamente

dividida que retarda selectivamente ciertos componentes del fluido.

Un caso particular de especificidad de algunos biopol!meros ha sido utilizado
en la separaci6n de enzimas con el nombre de afinidad cromatogr§fica; unas 50 en-
zimas se han logrado fraccionar a escala de laboratorio haciendo uso de su propie-

dad de formar fuertes enlaces con inhibidores especHicos, sustratos modificados,

etc. Ejemplos de estos pares que interaccio~an especfficamente son:

Enzima + Inhibidor +======-+ Compl_ejo Enzima-Inhibidor [15]

Antígeno + Anticuerpo +======+Complejo Ant~geno-Anticuerpo [16]

Un diagrama esquemético de afinidad cromatogréfica donde aparece una inte-

racci6n especrfica entre un agente inmovilizado y un componente en la fase lfquida

se puede ver en la Figura 2.

B
Alimentació
~G' ~- IGJ~
Lavado
~--L-~- ---1---- --- _t_ ---

~ CYb cfJ09J
cj)ey
cJ

Columna d
relleno
CY 9 d
'V
q
(!:i
cfb c1 b

(a) Introducción de ~ G
la mezcla (b) Separación (e) Elución del
componente ligado
Figura 2
Diagrama esquemético de afinidad cromatogr~fica

Se tiene un número de moléculas biológicas A mezcladas con otras moléculas

B con un alto grado de especificidad: si la especie B se une al sólido que constitu-

ye la columna, entonces K es alta mientras que K A es baja. El componente A

8
saldr~ inmediatamente, pero no asr el componente B, que saldr~ después de eluir

con una disolución adecuada.

Por ejemplo, se puede utilizar una "columna de afinidad cromatogr~fica" para

aislar DNA-despolimerasa (DNAasa); para ello se enlaza qufmicamente el inhibidor

 de DNAasa a la superficie de un soporte conveniente (por ejemplo, agarosa o poli-

acrilamida), se pasa la disoluci6n que contiene la enzima, que quedar§ retenida for-

mando el complejo E-1, y luego se pasa otro eluyente apropiado que recupere la en-

zima enlazada.

.
Se han estudiado otras técnicas, como los tamices moleculares, la di§lisis y

la ultrafiltraci6n, entre otras.

El caso de los tamices moleculares permite separar protefnas de diferentes

tamaños; el relleno de la columna es un gel de partfculas con poros de tamaño ca-

racterfstico. Las moléculas mayores que el tamaño del poro no pueden difundir ha-

cia adentro del gel y pasan r§pidamente a través de la columna, mientras que las

especies m§s pequeñas penetran en el gel y se mueven m§s lentamente, como se

muestra en la figura 3•

•• •• •• •• •• ••••
000 000
00 -~CP(j
000
0
o o0 o 00
000
00
o o o
o

figura 3
Cromatograffa de tamices moleculares

La di§lisis y la ultrafiltraci6n son procesos basados en la propiedad de algu-

nas membranas para dejar pasar algunos componentes de una disoluci6n e impedir
o retardar el paso de otros.

BIBLIOGRAfiA

AlBA, S. y otros; "Biochemical Engineering", 21 ed., Academic Press, New

York (1973).

BAILEY, J.E. y OLLIS, D.f.; "Biochemical Engineering fundamentals", Me-

Graw Hill, New York ( 1977).

WANG, D.I.C.; "Fermentation and Enzime Technology", john Wiley, New York

(1979).

WEBB, F.C.; "Ingenierfa Biogufmica", Acribia, Zaragoza (1966).

 TEMA 11
ENZIMAS INMOVILIZADAS
 ENZIMAS INMOVILIZADAS

INTRODUCCION

Se dice que una enzima est§ inmovilizada cuando su movimiento en el espa-

cio ha sido restringido, bien completamente, bien en una regi6n muy limitada, lo

que da por resultado una forma de enzima insoluble que presenta mucho interés:

1) Porque su recuperaci6n para una posible reutilizaci6n es m§s f§cil, lo que

favorece la economfa del reactor en~im§tico.

2) Porque es útil al bioqufmico el guardar cierto paralelismo con el estado

natural de la enzima, generalmente unida a membranas en la célula viva. El estudio

de las enzimas inmovilizadas se puede considerar que forma parte de la Bi6nica,

ciencia que considera aquellos hechos especiales de los sistemas biológicos con el

fin de utilizarlos o copiarlos en dispositivos artificiales.

3) En algunos casos, la inmovilización supone un incremento de la actividad,

Por ejemplo, como muestra la Figura 1, la S -0-glucosidasa en disolución (•) pierde

actividad a 37 ºC mucho m§s r§pidamente que la forma inmovilizada (0 ) fJ3 -0-glu-

cosidasa - carbonato de celulosa].

En los últimos años se ha recomendado englobar dentro de la denominaci6n

t.., de enzimas inmovilizadas un conjunto de términos que han aparecido en la biblio-

graffa, como:

- enzimas insolubles

- enzimas unidas a una matriz

- enzimas atrapadas en gel

Las enzimas inmovilizadas se . utilizan como catalizadores heterogéneos, fun-

damentalmente en tanques agitados (donde están en suspensión) y en lechos de re-

lleno.

Se han descrito muchas técnicas para la preparación de enzimas inmoviliza-

das; de forma resumida, los métodos de inmovilización se pueden dividir básicamen-

te en cuatro grupos, si bien para algunos casos particulares puede darse mtis de un

tipo de inmovilizaci6n (por ejemplo, una enzima atrapada puede también estar ad-

sorbida a la matriz):
1) Adsorci6n e intercambio i6nico

2) Atrapamiento y encapsulaci6n
3) Entrecruzamiento intermolecular

4) Enlace covalente

Los dos primeros son de carticter m§s ffsico y los dos últimos de carticter

mtis qufmico.
100

-
~
.....,
t'O 80
>
...
.,....¡

t'O
~
~
... 60
-o
t'O
-o
.,....¡
>
...u
.,....¡

40
<

20

0....__...___....~....-_...L...._-'----L...___J

o 10 20 30 40 50
Tiempo de incubación (h)
a 37 Qc
figura 1

TECNICAS DE PREPARACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las diferentes técnicas de preparaci6n de enzimas inmovilizadas citadas se

esquematizan en la figura 2, y pasan a ser descritas a continuación.
 ADSORCION ATRAPAMIENTO

·~<imo
enzim•

~n
SOQOrte

polímero
INTERCAMBIO IONICO

enzima enzima
-•- -0- -:4»-
~&
membrana soporte

AOSORCION Y ENTRECRUZAMIENTO
ENTRECRUZAMIENTO

soporte

COPOLIMERIZACION UNION COVALENTE

aJS~nzima
enzima ' +
poli mero
1
soporte

Figura 2

Adsorción e intercambio iónico

Existen muchos ejemplos que indican que las enzimas se pueden adsorber so-

bre muchos materiales que presentan superficies neutras o cargadas. Con objeto de

evitar que la enzima se pueda perder por deserción, los adsorbentes m§s apropiados

son aquéllos ·a los que las enzimas se unen fuertemente, con un mlnimo de desnatu-

ralización. Algunos ejemplos se presentan en la siguiente relación:

- Ribonucleasa sobre Dowex-50 (resina cambiadora de cationes)

- Asparaginasa, quimotripsina y tripsina sobre CM-celulosa (carboxi-metil-ce-

lulosa)

Aminoacilasa, pepsina y varias proteasas sobre DEAE-celulosa (dietil-amino-

etil-celulosa)

- Invertasa sobre carbón

Atrapamiento y encapsulación
Algunas enzimas se pueden atrapar en un pol!mero (natural o sintético) que

presente una estructura semejante a un gel; as!, por ejemplo, el gel de almidón o

de poliacrilamida se han utilizado en muchos casos.

Se presentan algunos problemas:

1) Las enzimas tienden a desprenderse, debido a una amplia distribución de

poros en el gel.
2) No se pueden utilizar para atrapar enzimas hidrol!ticas, que degradan el

gel (por ejemplo, amilasas no se pueden atrapar en almidón).

3) Se puede presentar una apreciable reducción de la actividad enzim§tica

si el sustrato es de alto peso molecular y no puede penetrar a través de la matriz

para ponerse en contacto con la enzima.

También se han usado microc§psulas semipermeables de pol!meros sintéticos

(colodión, resina de silicona, etc.) para encapsular enzimas. Las c§psulas pueden

prepararse en tamaños que var!an de una a muchas micras; la encapsulación en ny-

lon, colodión, pol!méros, etc. puede utilizarse con fines médicos.

Entrecruzamiento intermolecular

Las enzimas pueden inmovilizarse al ser enlazadas covalentemente entre sf 'fltllllll

por medio de agentes bifuncionales como glutaraldeh!do o §cido bis-diazobencidinsul-

fónico.

El esquema de la figura 3 ilustra este tipo de inmovilización para la tripsi-

na de buey, que se adsorbe primero sobre part!culas de sflice coloidal formando una

monocapa, que luego se inmoviliza al formarse enlaces covalentes intermoleculares

por medio de glutaraldeh!do.

Este método de inmovilización de tripsina de buey permite una eficacia de

recuperación de aproximadamente un 99 % con una retención de la actividad de es-

teresa del 80 %. La actividad proteol!tica se encontró aproximadamente el 17 %

de la tripsina nativa.

C) ~ O• O + Glutaraldehido

~ Adsorción ~

Sección transversal

Vista superior

Figura 3

Asimismo, esta forma de inmovilización, a diferencia de las que se han men-

cionado, se caracteriza por el hecho de que las moléculas de sustrato pueden alean-

zar f§.cilmente a las moléculas de enzima, debido a que éstas forman una cubierta

alrededor de las partrculas y est§.n en contacto directo con la disolución. También

se ha logrado inmovilizar por este método la papafna.

Enlace covalente

El enlace covalente de una enzima a un soporte es el método m§.s importan-

te de. obtención de enzimas inmovilizadas. Existe una gran cantidad de soportes: vi-

drio, sflice, Sephadex, celulosa, nylon, poliestireno, etc.

Los grupos funcionales de la enzima implicados en el enlace covalente son

ros siguientes:

a) Grupos a mino: a - y E-

b) Grupos carboxilo: a-, S- y E-

e) El grupo -SH de la cistetna y el -OH de la serina

 d) El grupo imidazol de la histidina

e) El anillo fen6lico de la tirosina

El esquema de la Figura 4 muestra un ejemplo de enlace covalente de la

tri psi na con un copol1mero ( 1: 1) de etileno y anhídrido maléico. Los grupos anhídrido

del pol1mero reaccionan con los grupos amino de la enzima formando enlaces amida

y liberéndose simulténeamente crupos carboxilo. El entrecruzamiento de las cadenas

lineales del copol1mero se efectúa por medio de hexametílendiamina.

Figura 4

E"FECTOS DE LA INMOVILIZACION: RETENCION DE ACTIVIDAD

Cuando una enzima se inmoviliza por atrapamiento puede ser parcialmente

inactivada o desnaturalizada por los reactivos o productos implicados en la forma-

ci6n de la matriz "atrapadora"; la enzima no afectada podría ser completamente .,J

activa.

Cuando una enzima esté enlazada a un soporte, la actividad enzimética puede

perderse de varias formas:

1) Algunas moléculas de enzima se pueden inmovilizar de tal forma que se

impida el acceso del sustrato al centro activo.

2) Un grupo reactivo del centro activo puede estar implicado en el enlace

al soporte. En este caso se puede lograr una retención de la actividad protegiendo

el centro activo con un inhibidor reversible durante la formación del enlace.

 3) Las condiciones de la reacción para formar el enlace pueden causar desna-

turalización o inactivación.

Se puede decir, de forma general, que cuanto mayor es el número de enlaces

y mayor el tiempo empleado en la inmovilización, menor es la actividad retenida:
.
En la actualidad existen pocas directrices con respecto a la elección de una técnica

de inmovilización con el fin de obtener una buena retenci6n de actividad.

CINETICA DE SISTEMAS ENZIMATIC OS INMOVILIZADOS

Influencia de la transferencia de materia

Para el caso de enzimas inmovilizadas, el sustrato ha de difundir desde el

seno de la disolución hasta la superficie sólida cubierta por en~imas donde es con-

sumido y, si el soporte es poroso, el sustrato también ha de penetrar por los poros.

En consecuencia, la concentración de sustrato en la superficie será menor que en

el seno del flufdo (figura 5).

Enzijmas
Enzimas inm9vilizadas Película
inmovilizadas llJ¡:
,.....¡
l .-------estancada
~ 1/
tración~ ,¡-
_____,~""!!Tm,.-l"t" o ~

....,e
llJ
;..J
....
&~---r--------J
o
C/)
Flujo de ( mol S
---~sustrato área. tiempo)
Ns
(a) Situación real (b) Idealización de la
teoría de la película

Figura 5
Los procesos de transferencia de materia (difusión y convección) suministra-

rán el sustrato necesario para la reacción, desplazándose desde donde su concentra-

ción es más alta hasta donde su concentraci6n es más baja. En estas condiciones,
la velocidad de reacción observada depender§ de la transferencia de materia y de

la cinética intrinseca de las reacciones que se verifican en la interfase sólido-11qui-

do.
Cuando la transferencia de sustrato a la superficie es el factor limitante de

la reacción, las condiciones de flujo alrededor de la enzima inmovilizada influyen

sobre la velocidad de reacción. Esto se ve en la Figura 6, donde se puede observar

que la velocidad de reacción para quimotripsina inmovilizada depende de la veloci-

dad del agitador. Naturalmente, para una determinada concentración de sustrato,

a mayor velocidad de agitador, mayor velocidad de reacción.

8 REV/MIN =

-.,.,
'-
e: 6
e
........
o
-54
~

-
1
o
-2
>
........

o 1 2 3
(1/S).l0- 4 (mol/1)
Figura 6
La densidad de flujo de sustrato vendr~ dada por:

(mol de S/m 2 .s) [ ll

donde:

S concentración de sustrato en la interfase (mol!m 3 ó mol/1)

kL: coeficiente de transferencia de materia en la fase liquida (m/s). Existen

correlaciones para su determinación en función de las propiedades fTsicas
asi como de las condiciones hidrodin§micas.

S0 : concentración de sustrato en el seno de la fase ltquida

 En estado estacionario el sustrato no se puede acumular en la interfase y,

en consecuencia, debe coincidir la cantidad suministrada, de acuerdo con la ecua-

ción [1], con la consumida por la reacción en dicha interfase.

Supóngase aplicable la cinética de Michaelis-Menten:

r' S
(S ) max [2]
r
1
= kL o - S = K + S
m
donde r ~§x es la m§xima velocidad de reacción por unidad de área superficial ex-
2
terna (mol/m .s).

La expresión [2] se puede reajustar, obteniéndose una ecuación de segundo

grado en S que se puede resolver. Se obtiene asr una expresión compleja para r 1 ,

por lo que muchos investigadores hacen aproximaciones para la ecuación resultante:

1
r S
1 max o
r =S + K [3]
o m(ap)
donde:
r 1
~
K
m(ap) = K +
m (Hornby, 1968)
[4]
kL

1 Kr
K max m
m(ap) = K +
m kL(S o +K m)
(Schuler, 1972) [5]

r'
K 3 ~
m(ap) + Km + 4 kL
(Kobayashi, 1971) [ 6]

La ecuación [3] indica que para las enzimas inmovilizadas se puede usar con

cierta aproximación el tratamiento de Lineweaver-Burk.

Por otra parte, hasta ahora se ha supuesto que el sólido donde se ha inmovi-

lizado la enzima no es poroso. Sin embargo, este caso también se puede presentar.

La diferencia entre sólido poroso y no poroso se muestra den el esquema de la fi-

gura 7.

Kay y Lilly ( 1970) comprobaron que cuando se mol!an las partrculas de

DEAE-celulosa a las que estaba inmovilizada la quimotripsina, se observaba un acu-

sado incremento en la velocidad de reacción para cada concentración de sustrato

(figura 8).
 límite

Sólido
no p0roso

la

p.cl.OSO

Figura 7

1
-- ~ 0,4
e::
.,..;
e
....,
o
e
::l. 0,2

-0,2
-->

o 0,2
-1
1/S (mM)

Figura 8
 Los tratamientos matem§ticos desarrollados en el estudio de la cat§lisis he-

terogéna con respecto a la difusión en poros se pueden aplicar a sistemas de enzi-

mas inmovilizadas.

Considérese el caso de un soporte esfér.ico en el que está distributda unifor-

memente la enzima inmovilizada (aunque se estudia este caso, no quiere decir que

sea el m§s importante o común), según se muestra en la Figura 9.

Figura 9

Sea una part!cula porosa esférica de di§metro R y f!jese la atención en una

carcasa de radio r y espesor dr. Supóngase que se dan las siguientes condiciones:

a) La temperatura es constante en toda la partícula.

b) La difusión de reaccionantes (o sustrato) y productos en la estructura po-

rosa viene dada por la primera ley de Fick:

[
Densidad de flujo
transversal l-[ Coeficiente de difusión
efectiva global
l [ Gradiente de
concentración

e) La reacción superficial sigue una cinética tipo Michaelis-Menten.

En estado estacionario, la velocidad de difusión hacia el elemento en r+dr

menos la velocidad de difusión a la salida en r es igual a la velocidad de desapari-

ción del sustrato en el elemento:

E - S =D [8]
es decir:

donde:
S : concentraci6n de sustrato a la distancia radial r
r
3
ri: velocidad intrínseca de reacci6n (mol/m .s)

Por otro lado:

[ 10]

Sustituyendo [10] en [9] y despreciando infinitésimos de segundo orden:

d 2S dS r.4~r 2 dr
4~(r
2
+2rdr) + (--r) dr] - 4~r 2 ( r) = --=-J._ __ [ 11]
dr 2 dr r De
2
dS dSr r.r dr
2
dr + 2rdr(drr)r - r (dr)r =--=..l.D-:-- [ 12]
e

Dividiendo por r 2dr y reajustando:

[ 13]

Si se recuerda ahora la ecuaci6n de Michaelis-Menten:

r" S
max r [ 14]
r.l. =
K
m +S r
siendo:

r ~áx: velocidad máxima por unidad de volumen de soporte

K : valor verdadero para la enzima inmovilizada

m
queda finalmente:
d2S dS r'm'ax ~'
__ r+l--r= ~
[ 15]
dr 2 r dr D (K +S )
e m r

que tiene las siguientes condiciones límites:

 a) S = S para r = R
r
b) dS /dr
r
=O (simetr!a esférica) para r =O

La ecuación [15] se puede pasar a forma adimensional definiendo las siguien-

tes magnitudes:

S = S r /S r = r/R S = S/K m [ 16]

obteniéndose:

S
r
= S S dS
r
=S dS [ 17]

r = R r dr = R dr [ 18]

[ 19]
Km = S/S
Dividiendo:
dS
r S dS
= [20]
dr R
dr
2
d S
r s d s 2
[21 1
= ---.
dr
2 R2 d~2
llevando a [15]:

S
-2 - -
d
2
s 2 S dS
r"
max
S S
[22]
R dr
2 + RrRdr = D (.§. + S S)
e S
con lo cual:
r"
_ _..:::m=a.:.:.x _.::;:S_ _ [23)
r dr S De < ~ + S)
Si ahora se define un módulo adimensional, ~ , denominado módulo de Thiele,

por la expresión:
r"
max [24]
4: = R D
e

operando con el segundo miembro de la ecuación [23],

2 R2r''
R r" S
max
=
max S
= ~2 S [25]
D ( .§. + S
e S
s) e m (~ + SK S)
D K
K
( 1 + S S)
m m

la ecuación [23] se convierte en:

= ~2
2 ·s
d S + l Q.-ª. [26)
dr 2 r dr (1 + s S)
 Esta ecuación tendr~ ahora las siguientes condiciones ltmites:

a) S = 1 para r =1
b) dS/ dr = o para r = o

El perfil de concentración de sustrato se obtendrta por integración numérica

de la ecuación [26]; también se puede obtener la velocidad de reacción total en to-

da la part!cula que en estado estacionario serta igaul a la velocidad de difusión en

el exterior de la part!cula.
Es conveniente definir un factor de efectividad, 11 , como el cociente entre

la velocidad de reacción real y aquélla que existirta sin los efectos de difusión en

los poros:

r
11 = r"max S [27]
K + S
m

En general, en los sistemas enzim~ticos, 11 < 1.

La Figura 10 muestra la relación entre 11 y el módulo de Thiele, ¡p, de una

part!cula esférica porosa inmovilizada para varios valores de S. Cuando <P es peque-

ño, 11 es pr~cticamente 1 para todas las concentraciones superficiales, es decir, los

efectos difusionales son despreciables.

- e
..._,
~ !~~~=-------~~----------~--------~
~ 0,8
.,.,·:;:.¡_¡ 0,6
u
Q)
0,4
<.¡..¡
Q)

Q) 0,2
~

...o
.¡_¡
u
<ll
o' 1 '-:------:-----~--:---L.......L..------L..~..__u._...J.-.J....J
~ 20 40 (jJ 80100
Módulo de Thiele,<P

Figura 10
 Se ha estudiado también la influencia de la inhibici6n por sustrato o por pro-

dueto sobre el factor de efectividad de enzimas inmovilizadas en membranas (Moo-

Young y cols., 1972).

Cuando es apreciable el efecto de la difusi6n en el interior de soportes poro-

sos, la representaci6n Lineweaver-Burk de los datos para enzimas inmovilizadas pue-

de resultar pr§.cticamente lineal para un amplio intervalo de concentraciones de

sustrato, pero los valores de r max ap y de K m(ap ) que se obtienen por extrapola-
1( ( )

ci6n de la regi6n lineal, probablemente son muy diferentes de los valores reales.

Para obtener éstos es necesario utilizar prat!culas pequeñas y obtener velocidades

...,. de reacci6n a concentraciones de sustrato tan altas como sea posible.

Cuando se diseña un sistema de enzimas inmovilizadas usando un determinado

soporte, el tamaño de part!cula deber§. ser lo m§.s pequeño posible., dentro de las

limitaciones impuestas por la retenci6n del reactor o del sistema de recuperaci6n.

Una vez seleccionado el tamaño, es necesario elegir la cantidad de enzima a añadir

sobre el soporte: se trata de un compromiso econ6mico entre un alto contenido en

enzima (lo que da lugar a una elevada actividad por unidad de volumen de reactor,

pero bajo factor de eficacia) o un bajo contenido en enzima (lo que da lugar a una

baja actividad, pero a una mayor efectividad). Lo que parece ocurrir es que, cuando

la cantidad de enzima es baja, la concentraci6n de la misma sería mayor en la su-

perficie, en cuyo caso el factor de efectividad se incrementaría.

finalmente, no se debe olvidar que, aparte de la influencia de la transferen-

cia de materia considerada, pueden ejercer apreciable influencia los efectos elec-

trost§.ticos, de mezclado, la temperatura, etc., que hacen que el estudio de la ciné-

tica de las enzimas inmovilizadas sea difícil, aunque muy interesante, suponiendo
un desafío para la imaginaci6n a la hora de interpretar los casos pr§.cticos.
USO PRACTICO DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

Aplicaciones anal!ticas: electrodos enzim§ticos

En muchos laboratorios bioquimicos se pueden utilizar estos electrodos para

medir urea y glucosa en sangre, pero sus aplicaciones son mucho m§s amplias. La

Tabla 1 presenta algunos ejemplos de uso de electrodos enzim§ticos.

Tabla 1
ELECTRODOS ENZIMATIC OS

Sustrato medido Muestra Enzima Tipo de membrana

para el electrodo

Urea suero, sangre ureasa vidrio

orina
Glucosa suero, plasma glucosa-oxidasa vidrio
fenilalanina disol. acuosas amino§cido-oxidasa cristal
Glutamina muestras sintéticas glutaminasa vidrio
Amigdalina f lu!dos corporales S -glucosidasa cristal
Asparagina disol. acuosas asparaginasa vidrio
Penicilina caldos de ferment. penicilinasa vidrio

Todos los electrodos indicados utilizan una membrana del tipo de i6n selectivo

como sensor potenciométrico final. Se pueden agrupar estos sensores en tres cate-

gorras, según la naturaleza de la membrana activa del material empleado:

a) Electrodos de vidrio

b) Electrodos de membrana liquida

e) Electrodos de cristal

La figura 11 muestra un electrodo de vidrio para medir urea; dicho sistema

contiene un gel de ureasa-acilamida (enzima inmovilizada), donde la enzima cataliza

la descomposición de la urea según la reacción:

O=C-(NH 2 ) + H 0 ureasa > co2 + 2 NH3 ___2_.H__+_~ [28]

2 2

El amonio producido se puede detectar por un electrodo cati6nico monovalen-

te de una manera similar a la determinación del pH con el electrodo de vidrio.

Electrodo para
ión amonio

Celofán
Gel
ureasa

figura 11
El sistema descrito, con ligeras modificaciones, se podría utilizar para deter-

minar la concentración de glucosa o de lactato, empleando la glucosa-oxidasa o la

lactato-deshidrogenasa inmovilizadas, respectiva mente.

Aplicaciones médicas

Las enfermedades congénitas humanas conocidas en la actualidad {que produ-

cen desórdenes metabólicos) exceden de 120 y muchas tienen su origen en la ausen-

cía de una determinada enzima. Por ejemplo, la fenilcetonuria, enfermedad que pro-

duce un retraso mental, se supone originada por un déficit de la enzima que produ-

ce la transformación:

fenilalanina ----""'""'> tirosina [29]

Una posible alternativa a la terapéutica ordinaria {dieta con ausencia de fe-

nilalanina) podría ser suministrar la enzima ausente. Sin embargo, una enzima con

la misma función pero obtenida de una fuente no humana no se puede introducir

directamente en el cuerpo porque podrfa generar una reacción inmunológica adversa.

Una posible solución al problema supone el confinamiento de la enzima en una mi-

croc~psula, fibra o gel. De esta forma, se puede evitar la respuesta adversa produ-

cida por la enzima y el sustrato puede alcanzarla a través del gel, fibra hueca o

membrana de la microc~psula. Mientras las enzimas contenidas en membranas no

son suceptibles de ataque por anticuerpos, la composición protéica de las superfi-

cies de las membranas "in vivo" aumenta la resistencia a la transferencia de mate-

ria y origina una disminución de la eficacia en. la utilización de sustrato.

Una variante de la idea mencionada se ha propuesto para la construcción de

un "riñón artificial compacto": ureasa junto con una resina adsorbente o carbón se

encapsulan conjuntamente de tal manera que el NH producido por la descomposi-

3
ción de la urea sea adsorbido dentro de la microc~psula:

urea difusión
. , en > urea ureasa ~ CO + NH adsorción sobre ~ [30]
1a mJ.crocapsu 1a 2 3 resina o carbón

Entre las pruebas a pequeña escala de enzimas inmovilizadas est§.n los proce-

sos de conversión de esteroides. Asr, el cortisol, que se utiliza en el tratamiento

de la artrosis, se puede obtener de un precursor barato, 11-deoxicorticol, en una

columna que contiene 11- -hidroxilasa inmovilizada. En una siguiente etapa, el cor-
tisol se puede convertir en una sustancia de valor terapéutico superior, la predniso-

lona, usando otra enzima inmovilizada, t. 1-deshidrogenasa, en un reactor con lecho

fijo, tal como se muestra en el esquema de la Figura 12.

Estos esquemas revelan la extraordinaria especificidad de las enzimas corres-

pendientes.

La mayor parte de las transformaciones de esteroides utilizan microorganis-

mos determinados.

Procesos industriales

Existen varios procesos industriales que enplean en alguna etapa enzimas in-
movilizadas. Dos ejemplos importantes son la producción de jarabe de fructosa a
partir de almidón de marz y la manufactura de L-amino~cidos por desdoblamiento
 del racémico (que contiene ambos isómeros: D y L).

lH 20H
H C C=O
3 •• "OH

11-B-hidroxi-..
lasa
o inmovilizada
11-deoxicortisol Cortisol
~ 1 -dehidrogenasa
¡inmovilizada
TH20H
C=O
•• OH

o
Prednisolona

Figura 12

El proceso económicamente más importante es el mencionado en primer !u-

gar, pero muchos detalles del mismo son objeto de patente. Por ello se hará sólo

una breve descripción.

Después de que el almidón de mafz ha sido solubilizado por medio de una

t., hidrólisis ácida o enzimática, o·. combinación de ambas, la conversión a O-glucosa

se puede lograr por amiloglucosidasa inmovilizada. Pero la O-glucosa no es un pro-

dueto final ideal, debido a que es menos dulce que la sacarosa y, además, en diso-

lución concentrada tiende a cristalizar, lo que hace incómodo su uso. Estos proble-

mas se corrigen considerablemente isomerizando parte de la glucosa a fructosa por

medio de la enzima glucosaisomerasa (Figura 13).

La constante de equilibrio de esta reacción a 50 2C es aproximadamente 1

y este valor no cambia apreciablemente con la temperatura. En consecuencia, se

obtendrta en el equilibrio una relación glucosa: fructosa aproximadamente 1: l. Esta

mezcla tiene un poder edulcorante mucho mayor que la glucosa y se utiliza mucho
en la pr§ctica. El jarabe de fructosa-glucosa puede sustituir eventualmente al azú-

car invertido, cuyo volumen en 1972 fue de 900.000 toneladas.

~
1
- - . - - - - -, ,------,
1
H, ~o CH 2oH:
1 c:r 1 1
1 1 1 C=O 1
1
H-C-OH
~ -- -1- --- ~
1
L- -+---J
HO-C-H
HO-C-H 1
1 glucosa- H-C-OH
H-y-OH isomerasa 1
H-C-OH H-C-OH
1
1 CH 0H
CH 20H 2
O-glucosa D-fructosa

figura 13

La glucosa isomerasa es una enzima intracelular producida por un conjunto

de microorganismos, prefiriéndose los pertenecientes a las especies de "Streptomy-

ces". La necesidad de romper las células sin destruir la enzima hace que la glucosa

isomerasa sea m§s cara que las hidrolasas extracelulares. También, la glucosa iso-

merasa es muy sensible a varios inhibidores. Estos dos factores sugieren que la in-

movilizaci6n de esta enzima podrfa ser una estrategia deseable, por lo que se han
preparado varias formas.

finalmente, y respecto a la producci6n de L-amino§cidos, la figura 14 mues-

tra un diagrama de flujo de este proceso.

BIBLIOGRAfiA

AlBA, S. y otros; "Biochemical Engineering", 21 ed., Academic Press, New

York (1973).

ATKINSON, B.; "Biochemical Reactors", Academic Press, London ( 197 4).

GHOSE, T.K., fiECHTER, A. y BLAKEBROUGH, N. (eds.); "Advances in Bio-
chemical Engineering", 12 vols., Springer Verlag, Berlin ( 1979).

QUINTERO, R. R.; "Ingenierfa Biogufmica", Alhambra, México ( 1981).

 Crista-
1
lizador
Acetil- 1
1 r------...1
1 1
----,
1
1 : ,---.---, 1 Acetil-o-
1
DL- 1 1 r-----
amino- l 1
1 1-F=::;;;:;:;;;,.
!cidó i 1
1 1 Columna
1 1
1 1 1 de
1 1
1
1 enzima
--==~...J l.
1
1 irunovil cemi-
zacio

Agua
alient

Carnb~ador
Ln~ltr:' calo<

Figura 14

WANG, D.I.C.; "Fermentation and Enzime Technology", john Wiley, New York

( 1979).
 TEMA 12
REACTORES ENZIMATICOS
 REACTORES ENZIMATICOS

INTRODUCCION

Las transformaciones bioquímicas se pueden verificar bien con el concurso

de microorganismos o bien mediante enzimas aisladas de los mismos (o también de

fuentes animales o vegetales). Las enzimas extracelulares producidas por microorga-

nismos existen en cantidades elevadas y se utilizan en muchos procesos industriales.

En la Tabla 1 se presentan algunos ejemplos.

Tabla 1
APLICACIONES INDUSTRIALES DE ENZIMAS
MICROBIANAS EXTRACEL ULARES

Enzima Industria Utilización

a-amilasa panadería reducción de la viscosidad de la pasta;

aceleración de la fermentación
papelería producción de aprestos
glucoamilasa azúcar producción de glucosa
proteasas lavandería incorporación a los polvos de lavado
alimentación manufactura del queso, etc.
pectinasas alimentación clarificación de jugos de frutas

También existen técnicas en gran escala para el aislamiento y extracción de

enzimas microbianas intracelulares y de otros seres vivos. Algunas se utilizan en

reactores enzimáticos.

Se debe tener en cuenta el coste adicional del aislamiento y, en algunos ca-

sos, la inmovilización, sobre el coste global de la fermentación. Entre las ventajas

potenciales que , frente a los organismos, pueden presentar las enzimas aisladas es-

tán: mayores rendimientos, menor impurificación por productos secundarios y ausen-

cía de lisis. También, en el caso de enzimas inmovilizadas, existe la posibilidad de

modificación de la cinética de la enzima.

La elección entre la forma libre o inmovilizada de una enzima para cada ca-

so particular depende de la naturaleza del proceso de conversión y de las estabili-

dades relativas de las dos formas en el sistema.
Algunos procesos como la elaboraci6n del pan o el ablandamiento de la carne

suponen la adici6n de enzimas al final del proceso, haciendo imposible su reutiliza-

ci6n.

TIPOS DE REACTORES
Muchos tipos de reactores se utilizan con enzimas, tanto en su forma libre

como inmovilizada. Se puede hacer una primera clasificaci6n en reac;tores tipo tan-
gue y reactores tubulares, cuyas caractertsticas se revisar~n a continuaci6n. En la

Figura 1 se muestran algunos ejemplos de reactores enzim~ticos.

Tanque agitado Multi-etapa Lecho Columna de Tubular

fluidizado relleno

Tanque agitado con Columna de relleno Recirculacion

ultrafiltracion con recirculacion en bucle

Figura 1

El m~s simple es el tangue agitado por cargas (sistema cerrado), que contie-

ne la enzima soluble o inmovilizada junto con el correspondiente reactante hasta

que se alcanza el grado de conversi6n deseado, momento en que se ·debe descargar

y limpiar para comenzar con otra carga. Si la enzima est~ inmovilfzada, se puede
separar para reutilizar; sin embargo, la actividad enzim~tica se puede perder duran-

te el proceso debido a roturas mec~nicas o a cambios en el pH.

El caso anterior se puede convertir en un reactor contrnuo mezcla completa
(RCMC, sistema abierto), si se dispone de una entrada para la disoluci6n de reac-
 tante y una corriente de salida para el producto. El sistema ha de disponer de con-

trol de temperatura, pH, ox!geno (en su caso), etc. Puesto que siempre se est§. en

condiciones de buena mezcla, la concentración de reactante será baja y la de pro-

dueto alta, lo que indica que es apropiado para reacciones catalizadas por enzimas

que presenten inhibición por sustrato, pero es poco eficaz cuando existe inhibición .

por producto. La baja concentración de reactante requiere una alta actividad de la

enzima. Si se utiliza una enzima inmovilizada se suele preferir un soporte org§.nico

debido a la flexibilidad y a la disponibilidad de grupos reactivos que permiten una

alta retención de la actividad enzimática ("enzime loading"); el soporte más fre-

41, cuentemente utilizado es DEAE-celulosa, debido a su bajo coste.

Una modificación del RCMC supone la inclusión de una membrana o ultrafil-

tro a la salida, que permite la retención de macromoléculas insolubles o solubles.

Cuando el reactante es insoluble, la enzima se debe usar en su forma soluble, como

es evidente.

El reactor tubular de lecho fijo es el más frecuente dentro de los reactores

enzimáticos tubulares. La enzima inmovilizada se coloca en el tubo y la disolución

se hace circular a su través. Se hace necesario el uso de soportes especiales que

den buenas condiciones de flujo. Para el caso ideal de flujo de pistón, este reactor

es cinéticamente más eficiente que el RCMC, sobre la base de producto formado

por unidad de tiempo y por unidad de actividad enzim§.tica.

Los requerimientos más bajos de actividad enzim§.tica para este reactor tie-

nen importancia económica. Estos reactores de lecho fijo son particularmente apro-

piados cuando la cat§.lisis enzimática presenta inhibición por producto, puesto que

la concentración de producto es baja a la entrada y solamente alcanza un valor al-

to a la salida. Solamente cuando la reacción es de orden cero no presenta ventajas

el reactor tubular frente al RCMC.

finalmente, también se ha usado el reactor tubular en lecho fluidizado. En

otros procesos qufmicos estos reactores son apropiados cuando se necesitan altas

velocidades de transferencia de materia y de transmisión de calor, pero para su uso

con enzimas inmovilizadas pasan a ser m§s importantes las buenas caracter!sticas

de flujo. Aquf no se logra la aproximación al FP cuando la corriente de entrada

contiene cantidades apreciables de material insoluble.

Para el reactor de lecho fluidizado se suelen utilizar soportes densos (por

ejemplo, alúmina) para obtener la enzima inmovilizada.

ECUACIONES DE DISEI\10 PARA REACTORES ENZIMATICOS IDEALES

Sólo se considerar§n aqur las tres clases. de reactores: tanque agitado por

cargas, reactor cont!nuo flujo de pistón y reactor contrnuo mezcla perfecta. Prime-

ro se considerar§ el caso de una reacción no inhibida y posteriormente el caso en

que exista inhibición.

La ecuación de Michaelis-Menten para un solo sustrato sin inhibición es:

r S
r =
-dS =_m_= [1]
dt Km+S

para la reacción:

kl
E + S +======+ E-S [2]
kz

E-S _ __:.:k;...__;::. p + E [3]

Obsérvese que la ecuación [ 1] se puede poner:

r
m = k Eo [4]

Si se designa por ke: a la m§xima actividad de enzima en el reactor (mol/s)

o
(donde e: 0 es la cantidad de enzima añadida inicialmente en moles), entonces E
0
=
t-
0
/V, siendo V el volumen de disolución en el reactor (litros).
De [4]:

[5]

que se puede llevar a [ 1] quedando:

 k e:
-dS o
dt = K [6]
V(1 + Sm)
Para un reactor por cargas en condiciones isotermas, el balance de sustrato

en dt lleva a:
O - rVdt = O + dS V [7]

dS [8]
r = - dt

con lo cual, integrando la ecuación [6]:

K k e:
m o dt
- (1 +S) dS = V
[9]

-
I:o
K
(1 + ....!!!)
S dS = k~o I: dt [ 10]

Efectuando operaciones:
k e:
o
(S o - S) - K ln (-ª--)
m ·S = V
t [ 11]
o

Si se designa por x la conversión:

S - S
o
X = S [ 12]
o

e.., entonces la ecuación [ 11] se convierte en:

k e: o REACTOR AGITADO
S 0 x - Km ln(1-x) = V t
POR CARGAS [ 13]

Para un reactor tubular flujo de pistón, la enzima inmovilizada estará conte-

nida en el mismo y será atravesada por una disolución de sustrato con un caudal

F = V/t; para flujo de pistón, la ecuación [13] se puede poner de la forma:

k e: 0 T REACTOR TUBULAR
S X - K ln(1-x) = [ 14]
o m = F FLUJO DE PISTON

donde T = V/F es el tiempo espacial.

 Si se trata de un reactor contínuo mezcla perfecta, para estado estacionario

(suponiendo E << S):

F S
.o
+ (-r) V = F S [ 15]

de donde:

F(S - S)
0
r = V
[ 16]

o bien:

So - S
1" = r [ 17]

Considerando:

S r
m
ke: S
o
r = K +S = V(K + S) [ 18]
m m

se llega a:

k e: S
S -S=rT o
o = V(K + S) T [ 19]
m
o bien, reordenando:

k e: S
o
= -vl" [20]

Si se tiene en cuenta la conversión:

S - S
o
X ::i:
S S = S o (1-x) [21]
o

se puede obtener:

ke: S (1-x)
S o o
X
o --=-:V-::--- T [22]

ke: (1-x)
x So (1-x) + x Km = o
V [23]

y, dividiendo por (1 - x):

k e:
S
o
X + K X
m 1-x = -V-o T
REACTOR CONTINUO
MEZCLA COMPLETA
[24]
 En las ecuaciones [13], [14] y [24], las contribuciones relativas del primer

término del primer miembro (correspondiente a una reacción de orden cero) y del

segundo término (correspondiente a una reacción. de primer orden) sobre el tiempo

de reacción para alcanzar un determinado valor de x, dependen de los valores reta-

tivos de S0 y Kn'l Esto se puede ver en la figura. 2 para un reactor por cargas.

lOO

50

10

-....
......,
5

oQ.
ecu
·.-1
E-< 1
0,5

o, 1 o, 1 0,5 1 5 10 50 lOO
S /K
o m

figura 2
Se trata de una representación log-log de t frente a S /K , donde se obser-
o m
va que a valores bajos de S /K (reacción esencialmente de primer orden) el valor
o m
de t, para un determinado valor de x, es pr~cticamente
independiente de S /K •
o lJ1
Por otra parte, para valores de SiKm altos (reacción esencialmente de orden cero),

el tiempo necesario para alcanzar un determinado valor de x es proporcional a

S /K (pendiente aproximadamente 1).

o m
Las relaciones entre x y f (caudal volumétrico) para reactores contfnuos,

mezcla perfecta y flujo de pistón, ecuaciones [ 14] y [24], se representan en la fi-

gura 3. A valores altos de ·s0 (es decir, S/Km > 10) y bajos de x (::: 0,5), las cur-

vas para los dos reactores son pr~cticamente iguales. En estos casos, el segundo
término del primer miembro de [ 14] y de [24] es despreciable. En cambio, para va-

lores bajos de S /K y caudales bajos, se logran valores més altos de x para flujo
o m
de pist6n que para mezcla completa.

-.
><
'-'
¡::
•O
·.-!

...rn
Q)
>
¡::
o 0,2
u
o 0,5 1 ,o
q 1 '5

Figura 3

Comportamiento de los reactores enzim§ticos cuando existe inhibici6n

Hasta ahora se ha supuesto que la reacci6n enzimética no presentaba ningún

tipo de inhibici6n, lo que no se cumple siempre. A continuaci6n se considerarén dos

caso de inhibici6n.

a) Inhibici6n por sustrato

Se puede demostrar que, cuando se presenta esta inhibici6n, para un meca-

nismo del tipo:

k1
E + S +-======+ E-S [25)
k2

k3
E-S + S +-======+ E-S-S [26]
k4

k [27]
E-S E + p

la ecuaci6n de velocidad viene dada por:

 r S
m
[28]

donde Ks es la constante de disociación del complejo (E-S-S) que aparece en la

etapa [26], es decir, Ks = kik 3•

Se pueden obtener ecuaciones para 'os tres tipos de reactores estudiados. La

deducción es an§loga a la vista para obtener [13], [14] y [24]. Asi:

S02 2 "-
~ot REACTOR AGITADO
S x - Kmln(l-x) + 2K (2x-x )
0
= -V- POR CARGAS [29]
s

REACTOR TTJBULAR
FLUJO DE PISTON [30]

REACTOR CONTINUO
MEZCLA COMPLETA [31]

Como ya se apuntaba, la inhibición por sustrato tiene más importancia para

el reactor tubular flujo de pistón que para el reactor continuo mezcla completa,

ya que en este último caso, la transformación se verifica en condiciones de baja

concentración en sustrato.

La inhibición por sustrato en un reactor por cargas se puede reducir alimen-

tando el reactor intermitentemente y en el reactor tubular flujo de pistón, alimen-

tando el sustrato en varios puntos a lo largo del mismo.

b) Inhibición por producto

No se van a considerar todos los tipos de inhibición que podrían presentarse

por la presencia de diversas sustancias en el medio donde se lleva a cabo una reac-

ción enzim§.tica. Se considerar§ sólo el caso en el que el producto formado puede

actuar como inhibidor y, dentro de este caso, sólo cuando la inhibición es competí-

tiva o no competitiva.
 Las ecuaciones que se han obtenido para reactores enzim§.ticos ideales, cuan-

do existe inhibición comptetitiva por producto son:

K S kt:o t REACTOR AGITADO

m
(1 - K)xS (1 + K~)Kmln(1-x) =-v- POR CARGAS
[32]
. o l.p
l.p

K S kt:oT kt: REACTOR TUBULAR

m o o [33]
(1 - K)xS - (1 + K)K ln(1-x) = ---y-""" = T FLUJO DE PISTON
. o . m
l.p l.p

K x~S kt:o REACTOR CONTINUO

m o
xS + K _JL_ +K.- 1-x =F MEZCLA COMPLETA __
[34]
o m 1-x
l.P

donde K. representa la constante de la reacción de inhibición por producto.

lp
Para el caso del reactor por cargas se ha podido observar que cuando S /K.
o lp
es pequeño, la inhibición competitiva por producto apenas tiene importancia; pero

para valores altos de S /K. y también de x, el avance de la reacción est§. muy

o lp
impedido. Efecto an§.logo se observa para el RTFP y es aún m§.s dr§.stico para el

RCMC, puesto que aqur todo el reactor contiene una alta concentración de produc-

to.

Para el caso de inhibición no competitiva, los resultados obtenidos son:

S K S kt: o t
o m s2 {2-x2x - (1 + K 0 )K ln(1-x) REACTOR
xS ( 1 + - - - )
o K. K. o 2 K. . m =-v- POR CARGAS
[35]
l.p l.p l.p l.p

S K S kt: .J
xS (1 + - o m - s2 (2-x2 - (1 o o
--) + K)K ln(1-x) =p- R.T.F.P. [36]
o K. K. o 2 K. . m
l.p l.p l.p l.p
x2S2 K kt: o
X O m
xS +K - + - - ( 1 + S (1-x))
o m 1-x K. =p- R.C.M.C. [37]
l.p o

K
Se ha encontrado que, para los mismos valores de S
0
,
m, K.1p y x, la inhi-

bici6n no competitiva presenta un efecto m§.s acusado sobre el avance de la reac-

ción que la inhibición competitiva.

PROBLEMAS PRACTICOS EN LOS REACTORES ENZIMATICOS

Las relaciones que se han considerado suponen comportamiento ideal de los

reactores {M.C. 6 F.P.) y, salvo el caso de inhibici6n por sustrato, el R.T.F.P. es

mAs eficaz que el reactor agitado.

Sin .embargo, en los casos reales se pueden presentar efectos de retromezcla,

limitaciones difusionales, o existencia de zonas estancadas, que pueden afectar sig-

nificativamente el comportamiento global del reactor.

Asimismo, existen otros factores que pueden influir muy acusadamente sobre

los resultados. Así, la adición de Acido o ~lcali para mantener el pH puede inacti-

var la enzima o producir la hidr6lisis del sustrato o del producto. Esto se puede

tratar de corregir propiciando una mezcla mAs eficaz lo que, a su vez puede con-

ducir, para el caso de enzimas solubles, a la formaci6n de espuma o a una desnatu-

ralizaci6n de las mismas; si se trata de enzimas inmovilizadas en forma de partku-

las, se puede producir atrición.

Cuando se utilizan enzimas libres, generalmente no se suelen reutilizar, salvo

que el reactor esté equipado con dispositivos de ultrafiltración. Lo mAs frecuente

es desnaturalizar al final por elevación de la temperatura (dentro del tanque para

el reactor por cargas o en la corriente de salida para un sistema contínuo) siempre

que, tanto el sustrato como el producto no resulten afectados.

El contenido enzimAtico presente en un reactor puede perder actividad con

el tiempo, bien por desnaturalizaci6n (por efecto de la temperatura o del esfuerzo)

o por envenenamiento (debido a la presencia de inhibidores, como metales pesados

o per6xidos) y también puede darse el caso de contaminaci6n microbiana.

Todos estos factores mencionados y quizAs algunos mAs, han de considerarse

por el diseñador para cada caso específico, tratando de alcanzar aquellas condicio-

nes de operaci6n donde se eliminen o, por lo menos se minimicen, los efectos inde-

seables.
BIBLIOGRAFIA

ATKINSON, B.; "Biochemical Reactors", Academic Press, London (1974).

BAILEY, j.E. y OLLIS, D.f.; "Biochemical Engineering fundamentals", Mc-

Graw Hill, New York ( 1977).

WANG, D.I.C.; "fermentation and Enzime Technology", john Wiley, New York

(1979).