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Capítulo 10

RECUENTO MICROBIANO
INTRODUCCIÓN

La determinación del crecimiento microbiano y/o biomasa celular dentro de una muestra
clínica o de un bioproceso, constituye una etapa muy importante para la evaluación de su cinética
de crecimiento, de allí que el conocimiento de las diferentes posibilidades de cómo ejecutarlas, es
de sumo interés dentro de la formación en microbiología. En este capítulo, solo se siguen algunas
metodología de empleo común en nuestro medio, no obstante producto del desarrollo
tecnológico estamos asistiendo a métodos cada vez más confiables y rápidos

OBJETIVOS

1. Estimaciones de biomasa celular (recuento microbiano), empleando diversos métodos,

tanto directos como indirectos.
2. Comparar los distintos métodos empleados, estableciendo las ventajas y desventajas de
cada uno de ellos.

1. RECUENTO MICROSCOPICO EN CAMARA DE NEUBAUER

La cámara de recuento de Neubauer, consiste en un portaobjetos especial con una

graduación en superficie y unas medidas muy concretas (Figura 10.1). Consta de 9 grandes
recuadros de 1 mm por lado, por tanto presenta una superficie de 9 mm 2 (Figura 10.2). Los
recuadros de los vértices están divididos en 16 pequeños cuadrantes, mientras que el recuadro
central está dividido en 25. A la vez; este último, cada uno de los 25 se halla subdividido en 16
cuadrículas. Es decir, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas. De otro lado, presenta
una excavación con 0.1 mm de profundidad (distancia entre la superficie de la lámina portaobjeto
y la laminilla cubreobjetos) o lo que es equivalente al volumen: 1mm (largo) X 1 mm (ancho) X 0.1
mm (altura) = 0.1 mm3. (Figura 10.3).

Figura 10.1. Aspecto de la Cámara de Neubauer.

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Figura 10.2. Modo en cómo se halla reticulada la cámara de Neubauer

Figura 10.3. Representación frontal y el perfil de la retícula presentada en la cámara de Neubauer

La muestra una vez dispensada entre el portaobjetos y el cubreobjetos, se deja reposar

sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en
varias celdillas. Dependiendo de las dimensiones de las células, quizás sea necesario escoger los
cuadrantes de los vértices; o caso contrario, si se tratase de células relativamente pequeñas, el
conteo lo efectuaríamos en el recuadro central, para esto se obtendría un promedio, producto del
conteo de sólo 5 cuadrículas (las 4 de los vértices y la central) y lo multiplicaríamos por 25.

Se debe de advertir, que como la distribución de las células es completamente al azar, es

probable que muchas células queden en el límite entre celda y celda, razón por la cual se opta el
criterio de considerar dentro del conteo, a aquellas células que quedaron en el límite superior y
lateral derecho, y desestimar aquellas que quedaron en el límite inferior y lateral izquierdo.

Como se deduce, el cálculo es muy sencillo, así por ej.: Si en el recuadro central se
hicieron las siguientes estimaciones a) 12 (cuadrícula superior izquierda) b) 8 (cuadrícula superior
derecha) c) 10 (cuadrícula central) d) 12 (cuadrícula inferior izquierda) e) 8 (cuadrícula inferior
derecha), entonces el promedio es de 10 células por cuadrícula; por tanto, en las 25 serán 250
células. Si estas 250 células existen en 0.1 mm 3, en 1 mm3 existirán 2500 células y consecuencia
de ello en 1000mm3 (= 1 ml.) existirán un total de 2,5 X 10 6 células/ml.

Entre las ventajas que nos ofrece este método es el de ser muy rápido; sin embargo,
presenta el inconveniente de que sólo sirve para suspensiones celulares relativamente

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concentradas (> 10 X 106 céls./ml), por debajo de este valor el número de células observadas en el
campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente; por otro lado va
bastante bien para células relativamente grandes (levaduras), no hace distinción entre células
vivas y muertas (salvo con ciertas técnicas); o, cuando se trata de bacterias móviles, hay que
inmovilizarlas previamente con una mezcla de alcohol y agua.

2. RECUENTO EN PLACA

Este método se basa en la presunción de que cada célula bacteriana, puede crecer en un
medio de cultivo sólido formando colonias. De acuerdo a este criterio, el número de colonias
desarrolladas en un medio de cultivo sólido, puede corresponder al número de células
bacterianas viables presentes, en una cantidad determinada de muestra que haya sido inoculada.

El número de bacterias encontradas para una determinada muestra, será el indicador

microbiano de la calidad de los mismos. Para el caso de un bioproceso, se realiza con la finalidad
de controlar el crecimiento microbiano, o para determinar la biomasa de microorganismos
viables. Estos procesos de determinación también se utilizan para:

• Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfección, así como también para
determinar la eficiencia del tratamiento industrial, transporte y almacenamiento.
• Tener una idea sobre la alteración incipiente de los alimentos.
• Poner de manifiesto las fuentes de contaminación, durante el proceso de elaboración de
los alimentos.

Cuando es preciso efectuar diluciones debido a la gran densidad celular de la muestra, tal
como aparece en la Figura 10.4 y 10.5, se efectuará el conteo final tomando como criterio
microbiológico el escoger aquella placa que presente entre 30 – 300 colonias, a partir de la cual se
hará la estimación respectiva.

Figura 10.4. Recuento en placa, en el cual el inoculo se mezcla con el agar aún fundido.
Generalmente se coloca hasta 1 ml. de inoculo.
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Figura 10.5. Recuento en placa, en el cual el inoculo se distribuye sobre la superficie del agar
solidificado con la ayuda de la espátula de Digralsky. Generalmente se coloca hasta
0.1 ml. de inoculo.

3. NUMERO MÁS PROBABLE (NMP)

El método de determinación del número más probable (NMP), proporcionada un valor

estimado del número de microorganismos presentes en una muestra. Este método,
esencialmente se fundamenta en la conjunción de cálculos estadísticos y pruebas bioquímicas
(medios de cultivo que se emplean) y dependen del microorganismo que se evalúa. Para este tipo
de recuento, se debe tener en cuenta los límites de confianza, para las diferentes combinaciones
de los resultados positivos y negativos; así como también el volumen usado en los tubos al
realizar la prueba y las diluciones respectivas; todos estos datos se encuentran establecidos en
tablas que ya han sido estandarizadas (Figura 10.6 y Tabla 10.1).

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Figura 10.6. Esquema procedimental en la estimación del Numero Más Probable

Tabla 10.1. Índice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con
porciones de 1 cm3 y 5 con porciones de 0.1 cm3.

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4. PESO SECO

La determinación del peso de las células en seco es la técnica más directa para la
estimación cuantitativa de una masa de células, y probablemente la más segura y reproducible.
Sin embargo solo puede utilizarse con suspensiones muy densas de células, y estas deben estar
bien lavadas, para privarlas por completo de toda materia extraña.

5. TURBIDIMETRIA

La medida de las propiedades de la disipación de la luz de los cultivos, es también usada

para estimar la biomasa. Las medidas turbidimétricas son un método conveniente a seguir
durante el desarrollo y la estandarización de cantidades de biomasa, usadas en experimentos con
microbios, en bioquímica, fisiología y genética.

El fundamento básico de este método, es que la luz interactúa con el sistema electrónico
molecular dipolo de la suspensión, aún cuando la luz no sea absorbida. La interacción es tal que la
luz es disipada a igual longitud de onda. Los detalles de la interacción de la luz con un átomo o
molécula pequeña fueron estudiados por LORD RAYLEIGH en 1981. Un aspecto importante de
esta ley es que la intensidad de la luz disipada depende inversamente a la cuarta parte de la
potencia de la longitud de onda.

La forma de la luz disipada, depende del tamaño, forma y del índice de refracción del
objeto. El índice de refracción es el valor de la velocidad de la luz en un medio diferente. El
principio de la luz disipada emanada de todas las partes de un cuerpo iluminado, originalmente
fue establecida por HUYGENS, aunque aplicada a explicación de las propiedades de lentes y
prismas, así como a la explicación de la luz disipada por bacterias.

De acuerdo a la ley de LAMBERT-BEER, la absorbancia es proporcional a la concentración

y la aplica a la medida de turbidez (absorbancia o densidad óptica). Existe una significante
desviación de la ley de Lambert-Beer a altas concentraciones celulares, esto ocurre
particularmente a baja longitud de onda. Una curva estándard es esencial para corregir estas
desviaciones, como las imperfecciones instrumentales y las lecturas.

Complicaciones adicionales pueden intervenir tales como con las bacterias que tienden a
agruparse en donde las determinaciones turbidimétricas son dificultosas a repetir y es imposible
realizar interpretaciones en términos de biomasa. Asimismo formaciones filamentosas pueden
presentar dificultades.

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Figura 10.7. Fundamento del método de recuento por turbidimetria (Espectrofotometría).

6. SISTEMA NEFELOMÉTRICA DE McFARLAND

Este sistema se sustenta en contar con una batería de tubos de ensayo con diferentes
concentraciones de cloruro de Bario, la que produce diferente turbidez en cada uno de ello. La
turbidez de cada tubo de ensayo nos representa una determinada carga microbiana ante una
muestra problema, por tanto permite una estimación aproximada del recuento microbiano (Ver
Anexo 1).

7. FILTRACIÓN

El concepto de apoya en el hecho de que la suspensión microbiana fluye a través de un

papel de filtro (usualmente de 0,45 μm de tamaño de poro), donde las formas celulares quedan
retenidas. Mas adelante, con la ayuda de pinzas estériles es retirado el papel filtro y depositado
en la superficie del agar nutritivo. La placa es incubada, contabilizándose el numero de colonias
que aparecen en ella, deduciéndose el número de microorganismos por ml. de suspensión

Figura 10.8. Fundamento del método de recuento por filtración.

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8. ACTIVIDADES PRÁCTICAS

1. CAMARA NEUBAUER

Materiales: Cámara Neubauer / Microscopio / Micropipetas / Material Biológico: Cultivo de

Saccharomyces cerevisciae / Tubos de ensayo con SSF para efectuar diluciones / Tubos estériles.

Técnica de empleo:

1. Se toma la muestra a evaluar con la ayuda de una pipeta, procediéndose a cargar la

cámara, la cual debe estar bien limpia, así como también el cubreobjetos; este se debe
adherir perfectamente a las bandas longitudinales de apoyo, lo cual se comprueba por la
aparición de los anillos de Newton. Para la aplicación de la muestra hay que desechar las
primeras gotas, colocando la punta de aquella al borde de la cámara, dejando salir una
pequeña gota para cubrir toda la extensión, procurando evitar el rebasamiento en los
surcos laterales; la cámara debe permanecer 2-3 minutos en posición horizontal.
2. Colocar la cámara en la platina del microscopio y observar con poco aumento para
verificar la uniformidad de las células; en caso contrario, se limpia y se carga nuevamente.
3. Dependiendo del tamaño de las células a contabilizar, se escogerá el cuadrante más
adecuado (el central). Así por ejemplo se tiene la referencia que, en el caso de glóbulos
rojos se usa el objetivo seco de mayor aumento; como estos se encuentran separados en
grupos de 16, se debe computar en 5 de esos campos. No debe contarse los glóbulos que
se hallan sobre las líneas inferior e izquierda, pero si los que están sobre la línea superior
y derecha. En el caso de ser células más grandes como lo es los glóbulos blancos, se usa
un objetivo de poco aumento y se cuentan los elementos distribuidos en los cuatro
cuadrados adicionales (4 mm2.). Se debe obtener el promedio de elementos por mm.2 y
se multiplica por 10, para calcular así la cantidad por mm 3 de la dilución.

2. RECUENTO EN PLACA

Materiales: Placas Petri de 100 x 15 mm. / Pipetas bacteriológicas de 1 ml., 5 ml. y 10 ml. / Tubos
de ensayo / Mechero de vidrio / Asas de siembra / Agar nutritivo / Muestras de vino fermentado.

Técnica de Empleo:

1. Se diluye la muestra en SSF en tubos de ensayo.

2. Se pipeta la alicuotas de 1 ml. de cada dilución a las respectivas placas Petri,
adicionándose el agar nutritivo aún licuado (método de incorporación o profundidad).
3. En la siembra de superficie se agrega 0.1 ml. de muestra diluida, de las diluciones antes
mencionadas, sobre placas de agar conteniendo agar nutritivo.
4. Incubar por 24 hrs. Y cuantificar el número de colonias por placa, a partir de las cuales
efectuar las estimaciones.

3. NUMERO MÁS PROBABLE

Materiales: Tubos de ensayo conteniendo con pequeña ampollas invertidas / Pipetas

bacteriológicas de 1 ml., 5 ml. y 10 ml. / Asa bacteriológica / Mechero / Caldo con sacarosa al 4%
conteniendo 100 mg/l. de bisulfito. / Suspensión de levadura.

Técnica de Empleo:
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1. De la muestra original se pipetea 10 ml., 1 ml. y 0.1 ml. de cada una de las series de 5
tubos que contienen el caldo nutritivo.
2. Se inocula los tubos a la temperatura ambiente por 24 y 48 horas.
3. Después de este tiempo se observa los tubos que muestran producción de gas.
4. Para obtener el NMP de las tres series, los tubos en donde se ha confirmado la
producción de gas deben de referirse a la tabla de NMP. Ej: para valores de 2, 1 y 0 en la
serie de 10, 1 y 0.1 ml. respectivamente, la tabla indica un NMP de 7/100 ml.

4. PESO SECO

Materiales: Tubos de prueba de 13 x 100 mm. / Centrífuga de laboratorio / Estufa / Balanza

analítica / Pipeta.

Técnica de Empleo:

Se pesa dos tubos de prueba vacíos y secos (P1), luego se extrae la muestra de biomasa de
levadura con una pipeta (5 ml) y se vacia a los 2 tubos de prueba, se centrifuga a una velocidad de
4000 rpm por un tiempo de 20 m, luego se vacía el sobrenadante y se llevan los tubos a una la
estufa a 105°C hasta que el peso sea constante,o caso contrario por 12 hrs.

5. TURBIDIMETRIA

Materiales: Espectofotómetro SPECTRONIC 20D / 10 tubos de prueba con 4.5 ml. de agua
destilada. / 0.5 ml. de levadura Saccharomyces concentrada.

Técnica de Empleo:

1. A 0.5 ml. de levadura concentrada se adicionan a un tubo que contiene 4.5 ml. de agua
destilada obteniendo la dilución de 10-1 , de esta solución se toma 0.5 ml. y se adiciona a
otro tubo con 4.5 ml. de agua destilada obteniendo la dilución 10 -2 y así sucesivamente
hasta completar todos los 10 tubos de prueba.
2. Por otro lado el espectofotómetro primeramente es conectado a la fuente de energía
eléctrica de 220 V, dejando que se estabilice, después de unos 10 minutos, se selecciona
una longitud de onda (Wavelength) de 550, luego se calibra en vacio la tramitancia de
cero (0) y para el agua destilada debe calibrarse un valor de tramitancia de 100%.
3. Realizada esta operación las muestras diluidas son colocadas en el espectofotómetro
procediéndose a la lectura respectiva.

9. CUESTIONARIO

1. Establezca diferencias entre métodos de recuento directo e indirecto.

2. Señale los métodos en los cuales podemos visualizar las células vivientes.

3. ¿Como efectuaría el recuento de hongos de tipo misceliar?

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4. ¿Cual considera el método de recuento más preciso?

5. ¿Que métodos de recuento son más adecuados para altas cargas microbianas?.

6. ¿Qué métodos de recuento son más adecuados para cargas microbianas pobres?

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Edit. Prentice Hall. 10ª Edic. 1011 pp.
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México. 476 pp.
Joklik, W.; Willett, H.; Amos, B.; C. Wilfert – 1997 – ZINSSER, MICROBIOLOGÍA. Edit.
Panamericana. 20ª Edic. Bs.As. 1696 pp.
Liébana, J. – 2002 - MICROBIOLOGÍA ORAL. Ed. Mc Graw-Hill-Interamericana. 2ª Edic. Madrid.
677 pp.
MacFaddin – 2003 - PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE
IMPORTANCIA CLÍNICA. Edit. Médica Interamericana. 3ª Edic. Bs.As. Argentina 850 pp.
Freeman, B. – 1983 - TRATADO DE MICROBIOLOGÍA DE BURROWS. Edit. Interamericana. 21ª
Edición. México. 1119 pp.
Pelczar, M.; Chang, R. – 1982 - MICROBIOLOGÍA. 2ª Edic. Edit. Mc Graw Hill. México.

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