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Guía de Prácticas N°5
Guía de Prácticas N°5
Práctica N°5:
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA - Parte I
I. MARCO TEÓRICO
En un organismo vivo tienen lugar numerosas reacciones químicas, la mayoría de las cuales se
encuentran funcionalmente interconectadas. Muchas de tales reacciones no podrían llevarse a
cabo sólo con las condiciones de pH y temperatura fisiológicos, por lo que necesitan de la
presencia de catalizadores específicos de naturaleza proteica, las enzimas. Estas controlan la
naturaleza de las reacciones y la velocidad a la que se aproximan al equilibrio. Las enzimas
intervienen en procesos que requieren energía para llevar a cabo reacciones endergónicas, así
como también en las que desprenden energía, denominadas reacciones exergónicas.
a) Tiempo de incubación
b) Concentración de la enzima
c) Concentración del substrato
d) Efecto del pH
e) Efecto de la temperatura
f) Presencia de cofactores.
Velocidad de reacción
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Por lo tanto, para entender la cinética enzimática se necesitan conocer las constantes Km y
Vmax. Dentro de las muchas formas de calcular estas variables encontramos el gráfico de
Lineweaver-Burk, en el cual representamos la curva de Michaelis-Menten en forma lineal para
poder usar la ecuación de la recta.
(donde V = Vo y Vm = Vmax)
Los factores que afectan la actividad enzimática, y que veremos en la parte práctica son:
1. Efecto de temperatura
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incremento no puede ser infinito dado la naturaleza proteica de las enzimas. Así, al
aumentar la temperatura las proteínas empiezan a desnaturalizarse perdiéndose la
actividad catalítica. La temperatura a la cual la actividad enzimática es máxima se llama
temperatura óptima. Cada enzima tiene una temperatura óptima dependiente de su
naturaleza proteica, su composición aminoacídica y sus estructuras.
2. Efecto del pH
Algunos de los aminoácidos de las enzimas poseen grupos químicos ionizables como son
los carboxilos (-COOH), amino (-NH2), tiol (-SH), imidazol, etc., en sus cadenas laterales.
Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga positiva, negativa o neutra. Como
la conformación de las proteínas depende en parte de sus cargas eléctricas, habrá un pH
en el cual la conformación será la más adecuada para su actividad catalítica. Este es
llamado el pH óptimo. Por ejemplo, la beta galactosidasa proveniente de Lactobacillus
acidophilus es una enzima cuyo pH óptimo se encuentra en el rango ácido, al igual que la
pepsina, enzima que se encuentra en el estómago de mamíferos.
Para ver los efectos de pH y temperatura, en esta práctica se trabajará con la enzima 6-O-
α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168), producida por la bacteria Gram positiva,
Actinoplanes missouriensis, contenida en la muestra del ensayo. Esta enzima hidroliza el
enlace glucosídico de un sustrato que añadimos, la hesperidina, que es un glicósido natural
formado por la unión de la rutinosa con la hesperetina. La rutinosa que se libera es el
disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa y tiene carácter reductor (en el C1 de la glucosa).
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Objetivos
- Observar el efecto de la temperatura, el efecto del pH y el efecto de la concentración
de la enzima sobre la actividad enzimática.
b. Veamos un ejemplo:
Tubo N° B 1a 2a 3a
Substrato (mL de albúmina) 2,0 2,0 2,0 2,0
HCl 1N (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3
H2O destilada (mL) 1,7 1,6 1,6 1,6
Tubo N° 1b 2b 3b
Enzima Pepsina 1% (mL) 0,1 0,1 0,1
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d. Agregar el contenido de los tubos 1a, 2a, 3a, a sus respectivos tubos 1b, 2b, y 3b.
e. Incubar por 10 min a las siguientes temperaturas:
Tubo N° B 1b 2b y 3b
Temperatura (°C) 37 0 37
Tubo N° B 1 2 3 4
Substrato (mL de albúmina) 2,0 2,0 2,0 2,0 -
HCl 1N (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 -
H2O destilada (mL) 1,7 1,6 1,5 1,4 -
Enzima Pepsina 1% (mL) - - - - 1,0
b. Pre Incubar por 3 min a 37° C y añadir la enzima incubada en el tubo 4, a cada uno
de los tubos anteriores, de acuerdo al siguiente esquema:
Tubo N° B 1 2 3
Enzima incubada (mL) - 0,1 0,2 0,3
c. Incubar por 6 min a 37 °C. Detener la reacción colocando los tubos en hielo.
d. Secar bien los tubos y esperar 2 min antes de leer las muestras.
e. Leer en el espectrofotómetro utilizando la longitud de onda adecuada (490 nm).
f. Encontrar la actividad enzimática restando las lecturas de cada tubo, de las lecturas
del tubo B (blanco). Graficar colocando en las abscisas las concentraciones de la
enzima y en las ordenadas la AE .
a. Ir al simulador virtual:
http://biomodel.uah.es/lab/abs/activ_enz.htm#
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b. Desplaza los controles para elegir un pH y una temperatura para el ensayo (Ubicar al
lado izquierdo de la pantalla las barras azules, y con el botón izquierdo del mouse
desplace hacia arriba o abajo para mover el valor del pH y la temperatura).
c. Teniendo fijo un valor de pH, mueva el botón de temperatura para averiguar la
temperatura óptima para trabajar.
d. Una vez encontrada la Temperatura óptima de trabajo, varía los valores de pH hasta
encontrar el pH óptimo de trabajo
e. Ve pulsando, en orden, los botones para añadir los componentes de la reacción a la
cubeta del ensayo. Añadir primero el tampón y el sustrato, luego la muestra, siendo el
tiempo de incubación 1 hora.
f. El botón “añadir sustrato” vaciará antes la cubeta. El botón “añadir muestra” iniciará la
incubación
g. Cumplido el tiempo de incubación, agregar el DNS e incubar 10 min a 100°C
h. Una vez que se haya desarrollado el color, pulsa en el espectrofotómetro el botón para
medir la absorbancia (denominado: tomar medida) y anota su valor en la tabla de la
derecha
i. Anote esta tabla en tu cuaderno de laboratorio una vez terminada la experiencia.
Los datos en la tabla a la derecha se pueden seleccionar, copiar y pegar en una
hoja de cálculo, o bien exportarlos a un archivo de texto (delimitado por comas
o tabuladores) para luego importarlo a la hoja de cálculo o programa de gráficos
j. Como se indica en la figura, las flechas rojas indican las opciones que se puede
manipular con el mouse.
III. INFORME
1. Elabore un mapa conceptual de los fundamentos teóricos de los factores que afectan a la
actividad enzimática: temperatura, concentración de enzima, pH
2. Desarrolle los siguientes temas, relacionados a las experiencias realizadas:
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IV. CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las principales precauciones que debemos tener para el desarrollo de
un diseño experimental en el cual deseamos medir actividad enzimática?
2. Cite enzimas que se inactivan a altas temperaturas.
3. Averigüe y presente un caso en el cual se tenga una enzima con actividad
enzimática a altas temperaturas. ¿Tiene algún uso práctico?
4. ¿Existen enzimas que no sigan la cinética de Michaelis-Menten?
5. Describa brevemente los efectos que causan el cambio del pH en la estructura de
las enzimas.
6. Utilizando el simulador https://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzass/enzymass.htm,
para la evaluación del efecto de la temperatura en la actividad enzimática,
encontrará 5 enzimas disponibles, a cada grupo se le asignará una de ellas.
- Escoger un rango de temperatura inicial y final. Este proceso puede ser
realizado varias veces de tal forma que la curva final muestre la temperatura en
la cual se produce más producto. Utilizar pH 5, 9, 6, 9 y 2 para las enzimas 1, 2,
3, 4 y 5, respectivamente.
- Mantener las demás condiciones por defecto y seleccionar la opción de no
incluir inhibidor. Guardar captura de imagen de los resultados para su informe,
para explicar sus resultados.
a. ¿Cuál es la temperatura óptima de la enzima?
b. ¿Qué sucede con la enzima a temperaturas muy superiores a la temperatura
óptima?
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V. REFERENCIAS
- Mathews Ch., Van Holde K.E. (2000). Bioquímica. 2da. edición. Editorial MacGraw-
Hill. Interamericana.Madrid.
- Murray, R.K. et al. (2007) Bioquímica de Harper. 17a edición. Editorial El Manual
Moderno. México. Oehling.
- Nelson D.L, Cox M.M.(2014) Lehninger. Principios de Bioquímica. Ediciones Omega.
6ª ed.
- https://www.worthington-biochem.com/introBiochem/factors.html
- http://dept.harpercollege.edu/chemistry/chm/100/dgodambe/thedisk/enzyme/
4back2.htm