NOMBRE: ACEVEDO BAUTISTA ERNESTO GRUPO: 4QV2

PRACTICA No 10 REACCION DE TRANSAMINACION Y SURECONOCIMIENTO

POR MEDIO DE CROMATOGRAFIA EN PAPEL.
INTRODUCCION
Las transaminaciones son reacciones donde se traspasa el grupo amino desde un alfa-
aminoácido a un alfa-cetoácido, convirtiéndose el primero en alfa-cetoácido y el segundo en
un alfa-aminoácido. Las enzimas que catalizan estas reacciones son las transaminasas y
necesitan el piridoxal fosfato (PLP) como enzima. Las enzimas que catalizan esta reacción
se denominan aminotransferasas o transaminasas y utilizan al fosfato de piridoxal como
cofactor.
La función de las transaminasas es la de recoger los grupos alfa amino de la mayoría de los
aminoácidos en un solo aminoácido, el ácido glutámico, por lo que la mayoría de estas
enzimas utilizan al alfa-cetoglutarato como aceptor de los grupos amino.
Hay dos tipos de transaminasas, la aspártico transaminasa glutámico-oxalacética (TGO) y la
alanina transaminasa glutámico-pirúvica (TGP), cuyos niveles en suero tienen importantes
significados en el diagnóstico clínico. Estas enzimas abundantes en el corazón e hígado son
liberadas cuando los tejidos sufren una lesión, por lo tanto, sus niveles altos en suero, pueden
ser indicativos de infarto de miocardio, hepatitis infecciosa u otros daños orgánicos.
OBJETIVOS

• Cuantificar la actividad de transaminasa ALAT/TGP en extracto de hígado por medio

de cromatografía y espectrofotometría
• Elaborar una curva tipo de unidades de absorbancia contra micromoles de ácido
glutámico.
METODOLOGIA
1.- REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN
a) Preparar dos tubos en la forma siguiente:
Tubo P T

Preparación cruda de Transaminasa 1.0 1.0

(mL)
Regulador de fosfatos 0.006 M pH 1.0 1.0
7.4 (mL)
Alanina 100 μmoles/ml (mL) 0.5 0.5
Preincubación a 37oC durante 5 minutos
Agua destilada (mL) 0.0 0.5
 Ácido alfa-cetoglutárico 100 0.5 0.0
μmoles/mL (mL)
Incubar a 37oC durante 1 hora con agitación ocasional
Alcohol 96° (mL) 4.0 4.0
Centrifugar 10 minutos a 2 500 rpm

b) Pasar el sobrenadante a un vaso de precipitados y evaporar casi a sequedad en una placa

de calentamiento. Tener cuidado de no carbonizar la muestra.
c) Disolver los residuos con 1 mL de agua destilada.
2.- PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA

Cortar una tira de papel Whatman No.1 de

23 x 57 cm y trazar con lápiz, a lo ancho del
papel, tres líneas paralelas a 2.5, 6.0 y 8.0 cm
en total a partir de uno de los extremos y
doblar sobre la primera línea hacia el frente
y sobre la segunda hacia atrás.
Marcar con lápiz en la
última línea (8.0 cm) nueve
puntos equidistantes.
En los primeros cinco puntos colocar 5,
10, 15, 20 y 25 µL respectivamente, de
una solución de ácido glutámico de 20
µmoles/mL, usando un secador de aire
caliente después de cada aplicación.

Desarrollar el cromatograma
Saturar el cromatograma durante dos Colocar en los cuatro puntos restantes,
durante 18 horas aproximadamente
horas en una cámara de cromatografía 60 µL de los tubos P y T de la reacción
con el disolvente utilizado, hasta
previamente saturada con el de transaminación, 20 µL de agua y 5
que éste haya recorrido tres cuartas
disolvente etanol:metanol:agua-urea µL de la solución tipo de alanina,
partes del cromatograma.
(45:45:10:0.5 v/v/v/p) secando con un secador de aire caliente
después de cada aplicación.

Sacar el cromatograma de la
cámara, marcar el frente de
corrimiento y dejarlo secar en la
estufa para cromatografía a 70°C
hasta evaporar el disolvente.
 3.-REVELADO Y ELUCIÓN DE LAS MUESTRAS
2.- PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA
Revelar el cromatograma
por aspersión con una
solución de ninhidrina al
0.05% en etanol.
Colocar los tubos de ensayo
en baño maría a 80oC durante
2 minutos. Enfriar en baño
con hielo y agregar a cada
tubo 5 mL de acetona al 75%.
Leer en el espectrofotómetro a 540
nm. Ajustar con el testigo
correspondiente.
Recortar las manchas correspondientes
Colocar el cromatograma en
a la curva tipo de ácido glutámico y
la estufa para cromatografía
también las manchas correspondientes
a 80°C hasta que aparezcan
al ácido glutámico formado en los tubos
ligeramente las manchas.
P y T de la reacción de transaminación.
Fragmentar cada una de las
Recortar una porción de papel
porciones de papel y colocarlas a la misma distancia recorrida
en tubos de ensayo, añadir 1 ml
por el ácido glutámico en el
de solución de ninhidrina al 1% carril donde se aplicó el agua.
en butanol para eluir las muestras.