PRACTICA

OXIDACIONES BIOLOGICAS

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:
1. Xantino deshidrogenasa de la leche
2. Oxidación del Lactato y succinato por un homogenizado de músculo cardiaco

OBJETIVOS:

1. Estudiar la oxidación del Succinato y del Lactato por un homogenizado de

músculo cardiaco
2. Estudiar la necesidad de cofactores y acción de inhibidores.
3. Estudiar la actividad de la xantino deshidrogenasa de la leche.

INTRODUCCION:

Como es sabido, en la membrana mitocondrial interna existe una serie de

transportadores de hidrógeno y/o electrones, que en conjunto se conocen como cadena
respiratoria mitocondrial. Así, diversos sustratos en determinadas vías metabólicas, al
oxidarse pierden 2 hidrógenos (2 protones y 2 electrones) por acción de deshidrogenasas
ya sea NAD o FAD dependientes, estableciéndose desde aquí un verdadero proceso de
transferencia de hidrógenos y/o electrones, dando como resultado final la reducción del
oxígeno y su conversión en agua y la consecuente liberación de energía libre que es
aprovechada en la formación de ATP.

PIRUVATO
LACTATO

ADP + Pi

NAD FMN ATP ADP + Pi ATP

ASCORBATO ADP + Pi ATP
Rotenona
Barbitúricos
CoQ Cit b Cit c1 Cit c Cit (a + a3) 1/ O2=
Piericidina
2
Clorpromacin
a Antimicina A CN-
FAD BAL CO
MALATOISOCITR Feniletilbiguanida Azida Sódica
ATOGLUTAMAT s Sulfuro de H
OOH Acil CoA SUCCINATO Naptoquinona
 Ceto
Glutarato
Figura Nº 1.1.- Cadena Respiratoria Mitocondrial
 En el esquema que presentamos, se observan los componentes de la cadena respiratoria
mitocondrial de mamíferos. Se observan también algunos sustratos que al oxidarse, los protones
y / o electrones perdidos en estos procesos son transportados por la cadena respiratoria.
Así mismo, se muestra el sitio de acción de algunos inhibidores, lo mismo que los lugares
donde se genera ATP.

Está bien claro entonces que cuando funciona la cadena respiratoria mitocondrial,
hay consumo de oxígeno. Así en presencia de mitocondrias y los sustratos adecuados, la
medida del consumo de oxígeno es un índice del grado de funcionamiento de la cadena
respiratoria mitocondrial. Sin embargo, la existencia de algunos compuestos que se
comportan como aceptores artificiales de hidrógenos y/o electrones, hacen factible
también el estudio de la oxidación de algunos sustratos oxidables por la cadena
respiratoria mitocondrial.

Entre los aceptores artificiales de electrones, se tiene al azul de metileno,

matasulfato de fenazina, al diclorofenol indofenol, entre los más conocidos y que tienen
la característica particular de presentar un color cuando están oxidados y otro cuando
son reducidos por algún intermediario de la cadena respiratoria.

EXPERIMENTO Nº 1.

XANTINO DESHIDROGENASA DE LA LECHE.

Rotular 4 tubos de ensayo y medir como se señala en el siguiente cuadro:

TUBO 1 2 3 4
Leche cruda 5.0 ml ------ 5.0 ml 5.0 ml
Leche hervida ------ 5.0 ml ------ ------
Uretano 50% ------ ------ 1.5 ml ------
Na CN 0.008 N ------ ------ ------ 0.5 ml
Aldehido fórmico 0.1 M 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml 0.8 ml
Azul de metileno 0.001 M 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml 0.4 ml

a) Mezclar con cuidado cada uno de los tubos.

b) Cubrir cada tubo con una capa de 1 ml. de parafina líquida (o aceite) y
colocarlos en baño maría a 37ºC.
c) Observar el grado de decoloración cada 5 min.
EXPRESION DE RESULTADOS:

Observar el aclaramiento de los tubos cada 5 min. y anotarlo en cruces de acuerdo al siguiente
esquema:
- Tubo permanece azul
+ Ligero aclaramiento
++ Aclaramiento mayor que el anterior
+++ Tubo casi completamente claro
++++ Tubo completamente claro

TUBO Nº 1 2 3 4
Tiempo 0 min.
Tiempo 5 min.
Tiempo 10 min.
Tiempo 15 min.
Tiempo 20 min.
Tiempo 30 min.

Se puede utilizar más tiempo de lecturas si fuera necesario.

EXPERIENCIA Nº 2

OXIDACION DEL LACTATO Y SUCCINATO POR UN HOMOGENIZADO DE

MUSCULO CARDIACO.

Rotular 7 tubos de ensayo y medir lo siguiente.

1 2 3 4 5 6 7
Azul de metileno 3 gts. 3 gts. 3 gts. 3 gts. 3gts. 3 gts. 3gts.
Lactato 0.1 M 2 ml. 2ml. ---- ---- ---- ---- ----
Succinato 0.1 M ---- ---- ---- ---- 2 ml. 2 ml. ----
Succinato 0.3 M ---- ---- ---- ---- ---- ---- 2 ml.
NAD 0.1 ml. --- 0.1 ml. ---- ---- ---- ----
Malonato ---- ---- ---- ---- ---- 2 ml. 2 ml.
Agua destilada 1.9 ml. 2.0 ml. 3.9 ml. 4.0 ml. 2.0 ml. ---- ----
Preparación enzimática 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml.
de músculo cardiaco

Mezclar y añadir a cada tubo 1 ml. de parafina líquida (o aceite)

Incubar en baño maría a 37ºC.

EXPRESION DE RESULTADOS:

TUBO Nº 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo 0 min.
Tiempo 5 min.
Tiempo 10 min.
Tiempo 15 min.

Puede utilizarse más tiempo de lectura si fuese necesario.

INTERPRETACION E INTERROGANTES BIOQUIMICOS

1. Los potenciales redox de los sistemas A y B, son respectivamente, - 0.23 y –0.32

voltios, indicar cuál es el sistema oxidante y cuál es el reductor.
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2. Es necesario agregar NAD para que el lactato se oxide? Si __ No __ Qué tubo

apoya su respuesta:
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3. El lactato se ha oxidado en forma máxima en el tubo Nº ___. Explique qué es lo que

ha sucedido en dicho tubo:
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4. Por qué el aclaramiento del tubo 2 es menor que el del tubo.

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5. Hay aclaramiento en el tubo Nº 3? Si __ No __ . Por qué?

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6. Hay aclaramiento en el tubo Nº 4 ? Si __ No __ . Por qué?
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7. Cómo explica Ud. lo sucedido en el tubo Nº 5:
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8. Explique que pasó en el tubo Nº 6 . se aclaró? Si ___ No ___ . Qué función está
cumpliendo el malonato ?
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9. Qué objeto tiene el Nº 7:

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10. De qué color aparecerían los tubos de no agregar la parafina? Por qué?
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11. Escriba la reacción catalizada por la Xantino deshidrogenasa de la leche en el tubo

Nº 1
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12. Por qué el cianuro no inhibe la oxidación del aldehido fórmico en el tubo Nº 4?
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13. La Xantino deshidrogenasa es una enzima mitocondrial? Si __ No __. Qué otras

fuentes tisulares podrían usarse en esta experiencia?
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14. En el tubo Nº 3 observaría aclaramiento? Si __ No __ . Cuál sería la acción del
uretano?
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15. Cuál es el sustrato natural de la Xantino deshidrogenasa y cuál es su rol fisiológico?

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16. Del siguiente gráfico

Figura 1.- Efecto del ortodinitrocresol sobre el consumo de oxígeno en

mitocondria de hígado de rata.
Una suspensión de mitocondrias frescas de hígado de rata en un tampón adecuado fueron incubados en una cámara
provista de un electrodo de oxígeno. Se comenzaron a añadir a la cámara diferentes compuestos y se midieron los
niveles de oxígeno, obteniéndose los resultados que se grafican ( A y B).

Explique ¿Por qué al añadir el cianuro a la preparación se obtuvieron los

resultados mostrados? ¿Qué interpretación le merece?

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Explique el efecto que se obtiene cuando se añade oligomicina a la preparación.

¿Cómo explica la respuesta obtenida cuando previamente se añadió DNOC?

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17. ¿Cómo explica el aumento en la temperatura corporal y en la frecuencia

respiratoria que se observó en el segundo paciente?

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